CN105311055A - 一种鹿血活性组分的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鹿血活性组分的制备方法。本发明以新鲜的鹿血为原料，经过病毒灭活、蛋白酶一次酶解、酿酒酵母两次发酵、干燥后获得鹿血活性组分。经本发明技术制备的鹿血活性组分具有以下特点：(1)酶解使大分子量蛋白质降解为小分子，不仅避免了鹿血引起过敏等不良反应，又使肽的活性位点暴露而具有ACE抑制活性、DPP-IV抑制活性、抗菌活性等多种功能；(2)经过一次酶解、二次发酵后的鹿血活性组分解后消除了血液制品原有的腥味，口味更易于被接受。鹿血活性组分可用于药品、功能性食品、食品添加剂等领域，具有广阔应用前景。

Description

一种鹿血活性组分的制备方法

技术领域

本发明涉及鹿血活性组分制备技术。

背景技术

鹿血自古以来一直是珍贵的滋补品，中国历代的《本草纲目》、《本草新编》等本草书籍都有鹿血药用价值的记载。鹿血用于健身最早见于宋代《清波杂志》，明朝李时珍的《本草纲目》对鹿血的医疗作用作了详细记载：“主阳痿、补虚、止腰痛、跌伤、狂犬伤，和酒服制肺痿吐血，及崩中带下，诸气痛欲危者饮之立愈。大补虚损，益精血、解痘毒、药毒。我国古代早至宋朝起，皇宫贵族就养鹿取血生饮，但这种食用方式限制了鹿血的食用人群，亟待开发出食用方便、功效明确的鹿血保健品，使鹿血这一皇室滋补品走入寻常百姓家庭。

鹿血的主要成分血浆和血细胞，血浆中除水外还含有蛋白质、无机盐、葡萄糖及激素等组分。鹿血中含有丰富的蛋白质，含量达到13％。与人血清数据相比鹿血中锌和铁的含量显著提高(参考文献1：宋胜利，葛志广，梅花鹿血液微量元素与蛋白组分，中药材，1999，22(8)：382－383)，锌的含量是人血的两倍以上。锌是人体所必需的重要微量元素，参与人体免疫功能，不仅显著影响免疫功能还影响胰岛素、生长素和性激素等人体重要激素的分泌，鹿血的益精血等活性与其高含量的锌密切相关。

鹿血中铁含量是人血的十倍。鹿血中的铁以有机铁的形式存在，易于为人体所吸收，鹿血的补血活性与其高含量的有机铁相关，鹿血血红素将是很好的补血良药血红素也叫铁卟啉、血红素铁或氯化血红素，动物血来源的血红素是用于防治缺铁性贫血的，具有吸收好副作用小的优点，是纯天然的生物铁剂，广泛应用于药品及保健品。

鹿血中蛋白质含量占13％以上，是鹿血中的主要成分。蛋白质是由肽组成的，具有生理作用的肽类化合物称为功能肽或生物活性肽，活性肽具有抗氧化、降血压、提高免疫力、抗肿瘤、促进矿物质吸收等活性，用不同来源的蛋白质制备具有各种功能的活性肽已成为该领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹿血活性组分制备技术，本发明将新鲜鹿血病毒灭活、酶解、发酵、干燥等处理后，制备成为可直接食用的活性组分。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

将加入抗凝剂的新鲜鹿血与等体积的水混合均匀，加热至60℃～100℃搅拌保温5～60分钟，降温至20～80℃，用1MHCI或者1MNaOH调节至2.0～9.0，每升鹿血加入为0.02～5g蛋白水解酶，搅拌酶解0.5～24小时；酶解结束后升温至80～100℃搅拌保温10分钟，再降温至30～50℃，每升鹿血加入0.1～10克的酿酒活性干酵母，发酵0.5～24小时，发酵结束后升温至100℃，保温10分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

所述蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或两种以上混合物。

鹿血活性组分作为活性成份用于药物、功能食品或食品的制备中；其可制备成任何形式，例如口服剂型：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、或颗粒剂；

外用局部制剂：乳膏、软膏、乳液、凝胶、半固体膏、贴剂糊膏、喷雾剂或气雾剂；

注射剂：溶液、悬剂、或乳剂。

本发明具有如下优点：

1.反应条件温和。本发明将鹿血直接酶解，反应条件温和，保留了鹿血固有的活性组分。

2.去除了可能引起过敏的大分子蛋白质，增加了新活性。通过酶解技术可将易引起：大分子蛋白质是主要的致敏原，直接服用鹿血会引起一些不良反应，酶解技术可将大分子蛋白质降解为小分子物质，消除了鹿血的致敏原，扩大了鹿血的适用人群。酶法降解蛋白质可制备成为具有ACE抑制活性、DPP-IV抑制活性、抗氧化、抗菌等多种生物活性肽。

3.消除了鹿血原有的腥味。本技术是将鹿血经过蛋白质酶解一次酶解、啤酒酵母二次酶解，去除了鹿血固有的腥味，使口味更易于被接受。

4.具有良好的应用前景。通过本工艺制得的活性成分更容易被人体吸收、食用更方便，因此作为功能食品、药品具有广泛的应用前景。

具体实施方式

实施例1

1，鹿血活性组分的制备

取10升加入20克抗凝剂EDTA-K.2H₂O的新鲜马鹿鹿血，加入10升的去离子水混合均匀后加热至80℃搅拌保温10分钟，降温至40℃，用1MHCI调节pH为2.0，加入0.2克胃蛋白酶，搅拌酶解24小时；酶解结束后升温至80℃搅拌保温10分钟，再降温至40℃，加入1克的酿酒活性干酵母，发酵24小时；发酵结束后升温至100℃，保温10分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

2，鹿血活性组分的抗氧化能力

2.1抗氧化活性测定方法

2.1.1铁还原能力的测定

Fe³⁺-三吡啶-三吖嗪(TPTZ)可被样品中的还原物质还原为Fe²⁺而呈现出蓝色，并于593nm处有最大吸光值，根据吸光值的大小，计算出样品抗氧化活性的强弱。

(1)Vc标准曲线制作：精确吸取Vc标准溶液(270μg/mL)3、6、9、12、15μL于试管中，加入1.8mLTPTZ工作液(组成：25mL0.3M，pH＝3.6醋酸钠-醋酸缓冲液，2.5mL10mM三吡啶-三吖嗪溶液，2.5mL20mMFeCl₃)，最后加去离子水补齐至2mL，37℃水浴10min后，测定其在593nm处的吸光度值。以Vc浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)样品铁还原能力的测定

吸取一定体积样品液于试管中，加入1.8mLTPTZ工作液，最后加去离子水补齐至2mL，37℃水浴10min后，测定其在593nm处的吸光度值。根据标准曲线方程计算样品铁还原能力。样品的铁还原能力以每毫克样品相当于多少μgVc的铁还原能力表示。

2.1.2清除羟基自由基能力的测定

根据Fenton反应原理，Fe²⁺可与邻二氮菲形成红色络合物，在510nm处有最大吸收峰，当邻二氮菲-Fe²⁺被羟基自由基氧化为邻二氮菲-Fe³⁺时，其510nm处的吸收强度变小，当加入抗氧化剂后，对羟基自由基产生抑制作用。因此可根据加入样品前后的吸光度值变化计算样品对·OH的清除率。

(1)·OH的清除率的测定

精密吸取1mL0.1M，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液于试管中，加入0.75mL的5mM的邻二氮菲溶液，混匀后加入0.5mL的7.5mmol/L的FeSO₄溶液，立即混匀，向试管中分别加入0.5mL不同浓度的样品溶液，然后加入0.5mL0.1％H₂O₂，混匀后，再加入1.75mL去离子水，于37℃水浴60min，以未损伤管进行全扫描，确定最大吸收波长(测定为510nm)，测定其在此波长下的吸光度值。(损伤管：以去离子水代替样品溶液；未损伤管：以去离子水代替样品溶液及0.1％H₂O₂)

按以下公式计算样品对羟基自由基的清除率。

其中，Y为对羟基自由基的清除率(％)；

A_损伤为损伤管的吸光度值；

A_未损为未损伤管的吸光度值；

A_S为样品溶液参与反应的吸光度值。

(2)EC₅₀计算软件计算EC₅₀值。

2.1.3清除1-二苯-2-苦肼基(DPPH)自由基能力的测定

DPPH·是一种稳定的自由基，易溶解在乙醇中，呈紫色，在517nm处有最大吸收。当加入抗氧化剂后，抗氧化剂提供单电子，与DPPH·的单电子成功配对后，DPPH·浓度变小，紫色变浅，在517nm处的吸光值随之也变小，因此可用比色法，根据加入抗氧化剂前后，吸光度的变化来测定抗氧化剂对DPPH·的清除能力。

(1)样品对DPPH自由基的清除率的测定

精密吸取1mL0.1mM的DPPH溶液加入一定体积样品溶液，混匀后，用70％乙醇补齐至2mL，混匀室温避光放置30min。以70％乙醇代替样品溶液为空白对照。以70％乙醇代替DPPH溶液管为样品空白管，将空白对照管做全扫确定最大吸收波长(测定为517nm)，在最大吸收波长处测定吸光度。

按照以下公式计算样品对DPPH自由基的清除率。

$Y=(1-\frac{A_S-A_B}{A_C})\×100\%$ (式3.2)

其中Y为对DPPH自由基的清除率(％)；

A_B为样品空白管的吸光度值；

A_C为空白对照管的吸光度值；

As为样品管的吸光度值。

(2)EC₅₀计算软件计算EC₅₀值。

3，实验结果

表1鹿血活性组分抗氧化能力

以上结果表明鹿血活性组分有较强的抗氧化能力，可用于药品、功能食品或普通食品。

实施例2

取100升加入15000U抗凝剂肝素的新鲜梅花鹿血，加入100升的去离子水混合均匀后加热至100℃，搅拌保温10分钟；降温至50℃，用1MNaOH调节pH为8.0，加入500克碱性蛋白酶，搅拌酶解5小时；酶解结束后升温至80℃搅拌保温10分钟，再降温至30℃，加入500克的酿酒活性干酵母，发酵12小时；发酵结束后升温至100℃，保温10分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

鹿血活性组分的活性检测结果与实施例1相同。

实施例3

取10升加入20克抗凝剂草酸钠的新鲜梅花鹿鹿茸血，加入10升的去离子水混合均匀后加热至60℃搅拌保温60分钟，降温至55℃，用1MNaOH调节pH为8.0，加入2克菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物(两者质量比为1:1)，搅拌酶解10时；酶解结束后升温至80℃搅拌保温10分钟，再降温至45℃，加入20克的酿酒活性干酵母，发酵8小时；发酵结束后升温至100℃，保温10分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

鹿血活性组分的活性检测结果与实施例1相同。

实施例4

取10升加入20克抗凝剂EDTA-K.2H₂O的新鲜马鹿鹿茸血，加入10升的去离子水混合均匀后加热至90℃搅拌保温20分钟，降温至40℃，用1MNaOH调节pH为8.0，加入10克胰蛋白酶；搅拌酶解5时；酶解结束后升温至80℃搅拌保温10分钟，再降温至40℃，加入30克的酿酒活性干酵母，发酵5小时；发酵结束后升温至100℃，保温10分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

鹿血活性组分的活性检测结果与实施例1相同。

实施例5

取10升加入20克抗凝剂草酸钠的新鲜马鹿血，加入10升的去离子水混合均匀后加热至80℃搅拌保温10分钟，降温至40℃，用1MNaOH调节pH为8.0，加入30克风味蛋白酶，搅拌酶解4时；酶解结束后升温至80℃搅拌保温10分钟，再降温至35℃，加入60克的酿酒活性干酵母，发酵5小时，发酵结束后升温至100℃，保温20分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

鹿血活性组分的活性检测结果与实施例1相同。

Claims (4)

1.一种鹿血活性组分的制备方法，其特征在于：

将加入抗凝剂的新鲜鹿血与等体积的水混合均匀，加热至60℃～100℃搅拌保温5～60分钟，降温至20～80℃，用0.1～1MHCI或者0.1～1MNaOH调节至2.0～9.0，每升鹿血加入为0.02～5g蛋白水解酶，搅拌酶解0.5～24小时；酶解结束后升温至80～100℃搅拌保温10分钟，再降温至30～50℃，每升鹿血加入0.1～10克的酿酒活性干酵母，发酵0.5～24小时，发酵结束后升温至80～100℃，保温5～30分钟；反应结束后冷冻干燥得到粉末状鹿血活性组分。

2.按照权利要求1所述鹿血活性组分的制备方法，其特征在于：所述蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或两种以上混合物。

3.按照权利要求1或2所述鹿血活性组分的制备方法，其特征在于：所述鹿血活性组分作为活性成份，用于药物、功能食品或普通食品的制备中。

4.按照权利要求3所述鹿血活性组分的制备方法，其特征在于：

其可加入药物学可接受的载体或食品中制备成任何剂型形式，

例如口服剂型：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、或颗粒剂；

外用局部制剂：乳膏、软膏、乳液、凝胶、半固体膏、贴剂糊膏、喷雾剂或气雾剂；

注射剂：溶液、悬剂、或乳剂。