CN110845575B - 一种多肽及其应用和dpp-ⅳ抑制剂或降血糖药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制二肽基肽酶（DPP‑Ⅳ，dipeptidyl peptidaseⅣ）活性及降血糖的一种多肽化合物Leu‑His‑Val‑Asp‑Pro‑Glu‑Asn，它的氨基酸序列为Leu‑His‑Val‑Asp‑Pro‑Glu‑Asn。多肽Leu‑His‑Val‑Asp‑Pro‑Glu‑Asn具有DPP‑Ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为降血糖药物先导化合物具有良好的应用前景。

Description

一种多肽及其应用和DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物
技术领域
本发明涉及多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn在制备抑制二肽基肽酶(DPP-Ⅳ，dipeptidyl peptidaseⅣ)及降血糖药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种由于体内胰岛素绝对或相对不足而导致的葡萄糖、蛋白质、脂代谢紊乱的综合症。
二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ，dipeptidyl peptidaseⅣ)是一种丝氨酸蛋白酶，该酶的底物包括N端第二位是脯氨酸或丙氨酸残基的多肽。它能从肽链N端水解两个氨基酸残基，能快速有效降解胰高血糖素样肽1(GLP-1,glucagon-like peptide-1),GLP-1是胰岛素生成和分泌最有效的刺激剂之一,因此抑制DPP-Ⅳ能增强内源性GLP-1的作用,从而提高血液中胰岛素的水平,进而降低并维持糖尿病人的血糖水平(Bioorg Med Chem.2007,15(7):2715-2735)。并且，GLP-1调节胰岛素分泌具有严格的血糖浓度依赖性，只有在高血糖条件下GLP-1才会提高胰岛素的分泌水平，故DPP-Ⅳ抑制剂不存在因服药而引发低血糖的风险(Best Pract Res ClinEndocrinolMetab.2009,23(4):479-86)
发明内容
本发明的目的是提供多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn在抑制DPP-Ⅳ活性和降血糖中的应用和快速筛选方法；多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn具有DPP-Ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、II型糖尿病的药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明以所述多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn为抑制DPP-Ⅳ活性和降血糖的有效成份。
其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn为DPP-Ⅳ抑制剂及降血糖药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制DPP-Ⅳ活性和降血糖活性的多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn来源于梅花鹿。由于鹿的蛋白库不够完善，总蛋白数量较少，而牛和鹿的基因同源性超过90％(SuiZ G,Yuan H M,Liang Z,et al.Talanta,2013,107,189-194.)，因此本实验选择牛科(bovine)作为蛋白数据库。多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn来源于牛科(bovine)蛋白库的Beta-Aglobin chain蛋白，含7个氨基酸残基，氨基酸序列为Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn，为单链线性结构，白色粉末状，易溶于水，分子量为822Da；对DPP-Ⅳ活性具有较好的抑制作用，IC50为402±3μM(n＝3，Mean±SD)。
多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn具备DPP-Ⅳ抑制剂所要求的特征：
DPP-Ⅳ抑制肽由至少应含有一个Pro残基。多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn含有Pro残基，因此满足这一影响活性的条件。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明首次从鹿茸中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制DPP-Ⅳ的活性，因此作为治疗高血糖、II型糖尿病药物的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。
具体实施方式
实施例1多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn的制备
采用LC-MS/MS与Shotgun蛋白质组学技术相结合的方法。以梅花鹿茸为原料，经酶解蛋白，离心，纯化及LC-MS/MS分析，结合构效关系特征，筛选对DPP-Ⅳ具有抑制作用的肽段。
其具体方法如下：
将新鲜梅花鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入去离子水使鹿茸浓度为33.3g/L，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(W/W)的胰蛋白酶，在40℃下酶解3小时；酶解结束将酶解液过80目筛，残渣同法提取一次。将两次酶解液升温至90℃保温15分钟，分别经8层纱布和200目筛过滤，所得滤液以10000g的速度离心10分钟，收集上清液；上清液经NanodropOnec在205nm下测定肽浓度，加水稀释至肽浓度20mg/mL待用；将溶胀后的Sephadex G-25medium填料填装成直径2cm、柱高30cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速3.5mL/min进行洗脱，以床体积的1/20为一个流份，洗脱2个床体积，收集全部40个流份并经NanodropOnec在205nm下测定肽浓度。根据肽浓度合并第16至第25个流份，冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
将鹿茸提取物用LTQ OrbitrapVelos进行质谱分析：将鹿茸提取物用0.1％(V/V)甲酸水溶液复溶成0.4mg/mL的溶液，进行LC-MS/MS分析。将毛细管的一端拉成内径约为5μm的尖端，通过气压将C18AQ填料压入柱内，填充柱长度约15cm。将毛细管的尖端与质谱相连。所用的流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，线性梯度洗脱过程为：0％B(0min)—2％B(2min)—25％B(87min)—35％B(97min)—90％B(99min)—90％B(109min)—2％B(110min)—2％B(120min)。流速60μL/min。
设置离子传输毛细管的温度200℃，电喷雾电压1.8KV，归一化碰撞能量35.0％。均使用数据依赖模式(data-dependent mode)对MS和MS/MS进行图谱采集。质谱扫描条件设定为：从每次m/z＝400～2000的全扫描中选择10个最高丰度离子峰进行MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)设置为：重复次数(repeat count)为2，重复容忍时间(repeatduration)30s，动态排除时间(exclusion duration)90s。利用Xcalibur软件(Version2.2，Thermo)进行系统控制和数据收集。
将采集的*.raw文件数据用Thermo Proteome Discoverer Daemon(v1.4)转换成*.mgf格式，再用Mascot(version 2.3.0，Matrix Science，London，UK)于牛科数据库(bovine，蛋白数目17890，下载自http://www.uniprot.org/),进行检索，检索参数如下：不设置酶切位点、最大漏切数和固定修饰；蛋氨酸残基、脯氨酸残基加15.9949Da的可变修饰；母离子的质量容忍度(peptide tolerance)为20ppm，碎片离子的质量容忍度(fragmentions tolerance)为0.8Da。导出肽段结果时设置score>25,调整显著性差异P使肽段假阳性率(FDR，false discovery rate)控制在1％内。鉴定结果见附表一。结合构效关系进行筛选，获得序列为Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn的多肽。
实施例2多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn的DPP-Ⅳ抑制活性检测
原理
对于N端为X-Pro、X-Ala的肽段，DPP-Ⅳ可将该二肽选择性切除，GLP-1具有X-Ala结构，因此DPP-Ⅳ可导致超过95％的GLP-1发生降解。本方法采用Gly-Pro-p-nitroanilide代替GLP-1作为DPP-Ⅳ的模拟底物，DPP-Ⅳ切下Gly-Pro后，生成的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，由此可计算DPP-Ⅳ的抑制活性。
实验方法：
实验所用多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn由南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度>95％。将多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn溶解于100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，向96孔板加入25μL的Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn溶液和25μL 1.59mM的Gly-pro-p-nitroanilide溶液(用相同缓冲液配置，下同)，混匀，于37℃温育10分钟，再加入50μL 0.01U/mL的DPP-Ⅳ溶液，混匀后于37℃温育60分钟，加入100μL 1M的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0)使反应终止，用酶标仪测定405nm吸光度。Control组用等体积的Tris-HCl缓冲液代替Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn溶液，blank组用等体积的Tris-HCl缓冲液代替Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn溶液和DPP-Ⅳ溶液。
分别配制浓度0.5、0.25、0.1、0.05mM的多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn溶液，按上述方法进行DPP-Ⅳ抑制活性检测。DPP-Ⅳ抑制率计算公式：
Figure GDA0003610415550000031
其中I％表示抑制率，A多肽表示Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn吸光度值，AControl表示阴性对照组吸光度值，Ablank表示空白组吸光度值。结果如表一所示：
表一 不同浓度的Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn对DPP-IV的抑制率
Figure GDA0003610415550000032
由表一可知，多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn对DPP-IV的半数抑制浓度(IC50)为402±3μM(Mean±SD，n＝3)
多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn具有DPP-Ⅳ抑制活性及降血糖活性，作为高血糖、II型糖尿病的药物先导化合物具有良好的应用前景。
附表：鹿茸提取物经LC-MS/MS鉴定的肽段
Figure GDA0003610415550000033
Figure GDA0003610415550000041
Figure GDA0003610415550000051
Figure GDA0003610415550000061
Figure GDA0003610415550000071
Figure GDA0003610415550000081
Figure GDA0003610415550000091
Figure GDA0003610415550000101
Figure GDA0003610415550000111
Figure GDA0003610415550000121
Figure GDA0003610415550000131
Figure GDA0003610415550000141
Figure GDA0003610415550000151
Figure GDA0003610415550000161
Figure GDA0003610415550000171
Figure GDA0003610415550000181
Figure GDA0003610415550000191
Figure GDA0003610415550000201
Figure GDA0003610415550000211
Figure GDA0003610415550000221
Figure GDA0003610415550000231
Figure GDA0003610415550000241
Figure GDA0003610415550000251
Figure GDA0003610415550000261
Figure GDA0003610415550000271
Figure GDA0003610415550000281
Figure GDA0003610415550000291
以TGTPGLPGPPGPMGPPGDR为例：肽段的修饰种类为Oxidation(M)；3Pro(O)(P)，表明该肽段有1处甲硫氨酸氧化修饰和3处脯氨酸羟基修饰。肽段的修饰位置为0.0002002000001002000.0，表示该肽段的3处脯氨酸羟基修饰位于第4、7、16位残基，甲硫氨酸氧化修饰位于第13位残基。
附表一的序列所涉及的氨基酸均为氨基酸的简写，各氨基酸缩写、简写及名称见附表二。
附表二氨基酸名称、缩写与简写
Figure GDA0003610415550000301
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种多肽及其应用和DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu His Val Asp Pro Glu Asn
1 5

Claims (5)

1.一种多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn。
2.一种权利要求1所述多肽在制备DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物中添加药物学上可接受的载体或辅料。
4.一种DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物，其特征在于：其以权利要求1所述多肽Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asn为活性成份。
5.按照权利要求4所述的DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物，其特征在于：所述DPP-Ⅳ抑制剂或降血糖药物中还添加有药物学上可接受的载体或辅料。
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