CN105273081A

CN105273081A - 一种二肽基肽酶iv抑制肽及其制备和应用

Info

Publication number: CN105273081A
Application number: CN201410344609.0A
Authority: CN
Inventors: 邹汉法; 靳艳; 晏嘉泽
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2034-07-18
Also published as: CN105273081B

Abstract

本发明涉及一种二肽基肽酶IV抑制剂及其制备，其以鹿胶原肽为活性成份，具有二肽基肽酶IV抑制活性。通过本发明制备的二肽基肽酶IV抑制剂，可应用于食品添加剂、功能食品、药品等领域，具有良好的应用前景。

Description

一种二肽基肽酶IV抑制肽及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。

本发明涉及一种二肽基肽酶IV抑制肽及其制备，其以鹿胶原肽为活性成份，具有二肽基肽酶IV抑制活性。通过本发明制备的二肽基肽酶IV抑制肽，可应用于食品添加剂、功能食品、药品等领域，具有良好的应用前景。

背景技术

二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase-IVDPP-IV)(EC3.4.14.5)是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布于人体内。DPP-IV通过对多肽的剪切使其失活，从而达到调节生理功能的作用。DPP-IV优先水解N-末端第二位上具有脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的蛋白质。其作用底物包括：胰高血糖素样肽-1(GLP21_7-36)、抑胃肽(GIP_1-42)、神经肽(NPY)、YY肽(PYY)以及胰多肽家族(PP-family)等。这些物质的共同特点就是N-末端第二位的氨基酸残基或者是脯氨酸或者是丙氨酸残基。DPP-IV通过作用于以上多肽底物而在糖尿病、葡萄糖耐量、肥胖、食欲调节、高血脂症、骨质疏松、神经肽新陈代谢和T-细胞激活等相关疾病中起着重要的作用。因此，体内给予DPP-IV抑制剂可预防相关底物肽的N-末端降解，从而保障人体机能正常运行。

DPP-IV将完整的GLP-1和GIP反应切断N-末端2个氨基酸残基后，使其失活从而影响GLP-1和GIP相关的血糖调节等生理反应。体内给予DPP-IV抑制剂可预防GLP-1和GIP的N-末端降解，使胰岛素分泌物增加从而改善葡萄糖耐量。鉴于DPP-IV抑制剂与血糖代谢的密切关系，DPP-IV抑制剂已成为新型2型糖尿病药物的研究热点。

DPP-IV抑制剂通过影响胰岛素对葡萄糖的敏感性及β细胞，提高周围组织对胰岛素的敏感性，促进乳糜微粒和极低密度脂蛋白的分解，从而起到降脂的作用。基于同样的理由，DPP-IV也同时具有减肥等功能。因此具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种二肽基肽酶IV抑制肽及其制备；其以鹿胶原肽为活性成份，具有二肽基肽酶IV抑制活性。本发明通过酶解、分离纯化的方法制备鹿胶原肽，制备工艺简单、条件温和，具有良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)以新鲜的鹿皮、鹿筋等为原料，鹿皮或鹿筋脱脂处理后用纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿皮或鹿筋碎片按照1:1～100质量比加入0.01M缓冲液，再按1:10～500质量比加入蛋白酶，于20～50℃搅拌反应1～10小时。将上述反应液的pH用1MNaOH或1MHCI调至6～8，加入复合酶进行酶解，加酶量为反应物质量的0.1～1％，于20～70℃搅拌反应1～10小时，反应结束后90℃灭活20min。将上述反应液5000rpm离心5min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。

(2)干燥的鹿胶原肽用缓冲溶液或醇水溶液溶解，上凝胶柱分离，获得具有二肽基肽酶IV抑制活性的组分。

蛋白质水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶其中两种、三种、四种或五种酶组合使用。

以鹿胶原肽作为活性成份，用于药品、功能食品或食品的制备中；

其可制备成任何形式，例如口服剂型：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、或颗粒剂；

外用局部制剂：乳膏、软膏、乳液、凝胶、半固体膏、贴剂糊膏、喷雾剂或气雾剂；

注射剂：溶液、悬剂、或乳剂。

本发明的特点如下：

1.活性肽的生理活性显著。采用本发明制备工艺，首次从鹿皮、鹿筋中获得具有二肽基肽酶IV抑制活性的肽类物质。

2.反应条件温和、方法简便可行。

3.具有良好的应用前景。二肽基肽酶IV抑制剂具有降血糖、降血脂、降血压、、减肥、改善骨质疏松等功效，通过本发明制备的活性肽可用于药品、功能食品、食品等领域，因此具有良好的应用前景。

具体实施方式

实施例1

1，DPP-IV抑制肽的制备

按照以下工艺制备DPP-IV抑制肽：

以新鲜的梅花鹿鹿皮为原料，鹿皮用质量浓度10％NaOH于50℃煮30分钟进行脱脂处理后纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿皮碎片按照1:80(原料：缓冲液质量比)加入0.01M醋酸缓冲液，再按1:10(酶：原料)质量比加入胃蛋白酶，于40℃搅拌反应1小时。将上述反应液的pH用1MNaOH调至7，加入复合酶(胰蛋白酶，碱性蛋白酶，质量混合比例1:1)进行酶解，加酶量为反应物质量的0.1％，于20℃搅拌反应1小时，反应结束后90℃灭活20min。将上述反应液5000rpm离心5min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。

将鹿胶原肽用50％甲醇溶液溶解，上样至SphadexLH20柱分离，以10％～100％甲醇/水溶液洗脱，以紫外检测器检测，波长为280nm。收集到含量最高的组分为目标组分，冷冻干燥成为产品，检测其DPP-IV抑制活性。

2，DPP-IV抑制活性的检测

(1)原理

采用以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-PNA)为底物的发色底物法筛选DPP-IV抑制剂，该方法的检测原理为在碱性条件下DPP-IV催化底物Gly-Pro-p-nitroanilide水解,生成黄色的对硝基苯胺,后者在波长405nm处有特征性吸收峰,通过酶标仪在405nm处测得的吸光度大小反映酶活性高低。

(2)方法

样品：将样品溶解于100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，配成40mg/mL储备液，再将储备液稀释成不同的浓度，作为样品溶液。

底物：Gly-pro-p-nitroanilide溶液，用100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)将Gly-pro-p-nitroanilide配置成1.59mM的Gly-pro-p-nitroanilide溶液。

阳性药物：DiprotinA溶液，DiprotinA用100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)配置成2mM储备液，使用前稀释成800uM。余下的储备液分装成若干管，-20℃保存。

酶：DPP-IV溶液，用100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)配置成0.01U/mL的DPP-IV溶液。

终止溶液：1M的醋酸—醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)。

实验在96孔板中进行，利用酶标仪在405nm检测吸光度。首先将酶、缓冲液及药物在37℃温度下分别水浴30min,然后将样品(或缓冲液)、底物依次加入96孔板内37℃孵育10分钟，再加入DPP-IV酶溶液，混匀后于37℃温育60分钟，加入100μL1M的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0)使反应终止。用酶标仪测定405nm吸光度。反应总体积为100μl。实验分为4组,每组设3个复孔。各组分别为：

样品组(S组)：样品+酶+底物。

样品空白组(SB组)：样品+底物。

阴性对照组(C组)：酶+底物。

阳性对照组(P组)：DiprotinA+酶+底物。

空白组(B组)：底物。

具体各组加样品见表1。

表1DPP-VI抑制活性实验分组及加样量

分组	底物	抑制剂	酶	终止剂
					样品组(S组)	25	25	50	100
样品空白组(SB组)	25	25	-	100
					阳性对照组(C组)	25	25	50	100
阴性对照组(P组)	25	-	50	100
					空白组(B组)	25	-	-	100

注：a表中数字的单位均为μl。

b反应总体积为100μl，各组按照表中所列加入反应物后用缓冲液将最终体积补至100μl。

(3)抑制率的计算

S组抑制率＝(1-)×100％

P组抑制率＝(1-)×100％

(4)检测结果

实施例2

以新鲜的梅花鹿鹿筋为原料，鹿筋用5％NaOH于80℃煮10分钟进行脱脂处理后用纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿筋碎片按照1:100(原料：缓冲液质量比)加入0.01M磷酸缓冲液，再按1:500(酶：原料)质量比加入胰蛋白酶，于35℃搅拌反应10小时。将上述反应液的pH用0.1MHCI调至6，加入复合酶(木瓜蛋白，菠萝蛋白酶,质量比1:1)进行酶解，加酶量为反应物质量的1％，于50℃搅拌反应10小时，反应结束后100℃灭活5min。将上述反应液2000rpm离心10min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。

将鹿胶原肽用0.01M磷酸缓冲液溶解，上样至SphadexG25柱分离，以0.01M磷酸缓冲液洗脱，以紫外检测器检测，波长为280nm。收集到含量最高的组分为目标组分，冷冻干燥成为产品，检测其DPP-IV抑制活性。

所获得的产品与实施例1的产品具有相同的DPP-IV抑制活性。

实施例3

以新鲜的马鹿鹿筋为原料，鹿筋用质量浓度30％NaOH于70℃煮10分钟进行脱脂处理后纯水清洗干净，乙醇脱脂处理后纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿筋碎片按照1:10(原料：缓冲液)质量比加入0.01M磷酸缓冲液，再按1:50(酶：原料)质量比加入中性蛋白酶，于45℃搅拌反应5小时。将上述反应液的pH用0.5MNaOH调至8，加入复合酶(木瓜蛋白，碱性蛋白酶，风味蛋白酶，质量比为1:1:1)进行酶解，加酶量为反应物质量的0.5％，于60℃搅拌反应5小时，反应结束后70℃灭活20min。将上述反应液8000rpm离心5min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。

将鹿胶原肽用0.05M磷酸缓冲液溶解，上样至SphadexG100柱分离，以0.05M磷酸缓冲液洗脱，以紫外检测器检测，波长为280nm。收集到含量最高的组分为目标组分，冷冻干燥成为产品，检测其DPP-IV抑制活性。

所获得的产品与实施例1的产品具有相同的DPP-IV抑制活性。

实施例4

以新鲜的马鹿鹿皮为原料，鹿皮用质量浓度1％NaOH于100℃煮15分钟进行脱脂处理后纯水清洗干净，，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿筋碎片按照1:1(原料：缓冲液)质量比加入0.01M醋酸缓冲液，再按1:200(酶：原料)质量比加入胃蛋白酶，于25℃搅拌反应8小时。将上述反应液的pH用1MNaOH调至7，加入复合蛋白酶(胰蛋白酶，碱性蛋白酶，风味蛋白酶，质量比为1:1:1)进行酶解，加酶量为反应物质量的0.8％，于30℃搅拌反应3小时，反应结束后80℃灭活25min。将上述反应液6000rpm离心6min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。

将鹿胶原肽用0.01M磷酸缓冲液溶解，上样至SphadexG100柱分离，以0.01M磷酸缓冲液洗脱，以紫外检测器检测，波长为280nm。收集到含量最高的组分为目标组分，冷冻干燥成为产品，检测其DPP-IV抑制活性。

所获得的产品与实施例1的产品具有相同的DPP-IV抑制活性。

Claims

1.一种二肽基肽酶IV抑制剂，其特征在于：其以鹿胶原肽为活性成份，鹿胶原肽具有二肽基肽酶IV抑制活性。

2.一种权利要求1所述二肽基肽酶IV抑制剂的制备方法，其特征在于：

(1)以新鲜的鹿皮或鹿筋中的一或二种以上为原料，鹿皮或鹿筋1～30％NaOH于50～100℃煮10～30分钟进行脱脂处理后用纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿皮或鹿筋碎片按照1:1～100(原料：缓冲液)质量比加入0.01～1M缓冲液，再按1:10～500(酶：原料)质量比加入蛋白酶，于20～50℃搅拌反应1～10小时；将上述反应液的pH用0.1～1MNaOH或0.1～1MHCI调至6～8，加入复合酶进行酶解，加酶量为反应物质量的0.1～1％，于20～70℃搅拌反应1～10小时，反应结束后70～100℃灭活5～30min；将上述反应液2000～8000rpm离心3～10min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽；

(2)干燥的鹿胶原肽用其质量3～5倍10～50％甲醇水溶液或缓冲液溶解，上Sephadex-LH20或Sphadex系列凝胶柱，用同样甲醇水溶液或缓冲液淋洗分离并收集洗脱液，含量最高的组分为具有二肽基肽酶IV抑制活性的组分。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：酶解过程为两步法，第一步用单酶酶解，第二步用复合酶酶解；

单酶酶解所用酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中一种；

复合酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶其中两种、三种、四种或五种酶组合使用，复合酶中单酶以相同的质量比例混合。

4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为：磷酸缓冲液、Tris-HCI缓冲液、或醋酸缓冲液中的一种。

5.一种权利要求1所述鹿血活性组分的应用，其特征在于：权利要求1所述鹿胶原肽作为二肽基肽酶IV抑制剂的活性成份，用于药品、功能食品或普通食品的制备中。

6.按照权利要求5所述鹿血活性组分的应用，其特征在于：

其可加入药物学可接受的载体或食品中制备成任何剂型形式，例如口服剂型：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、或颗粒剂；

注射剂：溶液、悬剂、或乳剂。