CN110845573B - 一种多肽及其在制备ace抑制剂或降血压药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制血管紧张素转换酶（angiotensin‑converting enzyme,ACE）活性及降血压的一种多肽化合物Pro‑Gly‑Pro‑Met‑Gly‑Hyp‑Arg‑Gly‑Ala‑Pro，它的氨基酸序列为Pro‑Gly‑Pro‑Met‑Gly‑Hyp‑Arg‑Gly‑Ala‑Pro。多肽Pro‑Gly‑Pro‑Met‑Gly‑Hyp‑Arg‑Gly‑Ala‑Pro具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的药物先导化合物具有良好的应用前景。

Description

一种多肽及其在制备ACE抑制剂或降血压药物中的应用
技术领域
本发明涉及多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro在制备抑制血管紧张素转换酶(ACE)及降血压药物中的应用。
背景技术
高血压是一种常见的心血管疾病，发病率高、是引发心、脑、肾和血管等各种并发症和导致中风、促进动脉粥样硬化、冠心病的一个重要危险因子。肽是一类重要的降血压药物，肽类化合物降血压的作用靶点是抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-convertingenzyme,ACE)的活性(文献1：Vanessa Vermeirssen，John Van Camp，Willy Verstraete，British Journal of Nutrition 2004，92：357-366)。血管紧张素转化酶可将不具活性的十肽血管紧张素I转化为具有强烈收缩血管作用的八肽血管紧张素Ⅱ，从而使血压升高，因此抑制ACE活性可有效控制高血压。多肽是一类重要的ACE抑制剂，天然蛋白质的酶解肽是ACE抑制剂肽的主要来源(文献2：Lieselot Vercruysse,John Van Camp,Guy Smagghe,J.Agric.Food Chem 2005,53:8106-8115)。血管紧张素转化酶对于机体血压和心血管功能起着重要的调节作用，因此抑制ACE活性的药物在心血管、心力衰竭等疾病的治疗中发挥重要作用。多肽类的ACE抑制剂在降血压的同时不会引起常见降压药物的干咳等副作用。
发明内容
本发明的目的是提供多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro在抑制ACE活性和降血压中的应用和快速筛选方法；多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明以所述多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro为抑制ACE活性和降血压的有效成份。
其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro为ACE抑制剂及降血压药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制ACE活性和降血压活性的多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro，来源于梅花鹿。由于鹿的蛋白库不够完善，总蛋白数量较少，而牛和鹿的基因同源性超过90％(Sui Z G,Yuan H M,Liang Z,et al.Talanta,2013,107,189-194.)，因此本实验选择牛科(bovine)作为蛋白数据库。多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro来源于牛科(bovine)蛋白库的Collagen type III alpha 1chain蛋白，含10个氨基酸残基，序列为Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro，为单链线性结构，白色粉末状，易溶于水，分子量为1214Da；对ACE活性具有较好的抑制作用，IC50为381±42μM(n＝3，Mean±SD)。
多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro具备ACE抑制剂所要求的特征：1.ACE抑制活性肽主要取决于C端氨基酸，C末端为芳香族氨基酸(Trp，Phe，Tyr)或疏水氨基酸残基，而N端为疏水氨基酸残基的肽段具有较强的ACE抑制活性。多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro的C末端三肽均为疏水氨基酸残基，分别为Pro(疏水)、Ala(疏水)、Gly(中性)；N端三肽也为疏水氨基酸残基，分别为Pro(疏水)、Gly(中性)、Pro(疏水)因此部分满足ACE抑制剂所要求的特征，具有较好的ACE抑制活性。
2.肽的疏水性氨基酸残基数量是影响其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有较多的疏水氨基酸残基。多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro的疏水氨基酸残基分别有Pro、Pro、Met、Ala、Pro，占全部残基数目的一半，表明其含有较多的疏水氨基酸。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明首次从鹿茸中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制ACE的活性，因此作为治疗高血压等心血管疾病药物的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。
具体实施方式
实施例1多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro的制备
采用LC-MS/MS与Shotgun蛋白质组学技术相结合的方法。以梅花鹿茸为原料，经酶解蛋白，离心，超滤及LC-MS/MS分析，结合构效关系特征，筛选对ACE具有抑制作用的肽段。
其具体方法如下：
将新鲜梅花鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入去离子水使鹿茸浓度为33.3g/L，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(W/W)的胰蛋白酶，在40℃下酶解3小时；酶解结束将酶解液过80目筛，残渣同法提取一次。将两次酶解液升温至90℃保温15分钟，先后经8层纱布和200目筛过滤，所得滤液以10000g的速度离心10分钟，收集上清液；上清液经Nanodrop Onec在205nm下测定肽浓度，加水稀释至肽浓度20mg/mL待用；将溶胀后的Sephadex G-25medium填料填装成直径2cm、柱高30cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速3.5mL/min进行洗脱，以床体积的1/20为一个流份，洗脱2个床体积，收集全部40个流份并经Nanodrop Onec在205nm下测定肽浓度。根据肽浓度合并第16至第25个流份，冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
将鹿茸提取物用LTQ Orbitrap Velos进行质谱分析：将鹿茸提取物用0.1％(V/V)甲酸水溶液复溶成0.4mg/mL的溶液，进行LC-MS/MS分析。将毛细管的一端拉成内径约为5μm的尖端，通过气压将C18AQ填料压入柱内，填充柱长度约15cm。将毛细管的尖端与质谱相连。所用的流动相A为0.1％(V/V)甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，线性梯度洗脱过程为：0％B(0min)—2％B(2min)—25％B(87min)—35％B(97min)—90％B(99min)—90％B(109min)—2％B(110min)—2％B(120min)。流速60μL/min。
设置离子传输毛细管的温度200℃，电喷雾电压1.8kV，归一化碰撞能量35.0％。均使用数据依赖模式(data-dependent mode)对MS和MS/MS进行图谱采集。质谱扫描条件设定为：从每次m/z＝400～2000的全扫描中选择10个最高丰度离子峰进行MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)设置为：重复次数(repeat count)为2，重复容忍时间(repeatduration)30s，动态排除时间(exclusion duration)90s。利用Xcalibur软件(Version2.2，Thermo)进行系统控制和数据收集。
将采集的*.raw文件数据用Thermo Proteome Discoverer Daemon(v1.4)转换成*.mgf格式，再用Mascot(version 2.3.0，Matrix Science，London，UK)于牛科数据库(bovine，蛋白数目17890，下载自http://www.uniprot.org/),进行检索，检索参数如下：不设置酶切位点、最大漏切数和固定修饰；蛋氨酸残基、脯氨酸残基加15.9949Da的可变修饰；母离子的质量容忍度(peptide tolerance)为20ppm，碎片离子的质量容忍度(fragmentions tolerance)为0.8Da。导出肽段结果时设置score>25,调整显著性差异P使肽段假阳性率(FDR，false discovery rate)控制在1％内。鉴定结果见附表一。结合构效关系进行筛选，获得序列为Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro的多肽。
实施例2多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro的ACE抑制活性检测
反应原理：
FAPGG(N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly，λmax＝340，ε＝2270M-1cm-1)，
可以被ACE酶解成FAP(N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Phe，λmax＝340，ε＝1512M-1cm-1)和GG(在340nm无吸收)，因此可以作为ACE的模拟底物。1mM FAPGG完全转化成FAP+GG的吸光度变化值ΔA＝0.758，因此可根据340nm吸光度的变化值计算反应速率和抑制率。
ACE溶液制备方法：
1g兔肺丙酮粉加入10倍(w/v)PBS(100mM,pH＝8.3，含5％(V/V)丙三醇)，4℃振摇过夜。提取液经35000g离心30min，上清液用PBS(100mM,pH＝8.3，含300mM NaCl)稀释10倍(V/V)，得ACE溶液。
实验方法：
实验所用多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro由南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度>95％。本实验在96孔板中进行，FAPGG和Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro均用PBS(100mM,pH＝8.3，含300mM NaCl)进行配制或稀释。按表1依次加入ACE溶液和2、0.5、0.1mM的Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro溶液，37℃温育5min后加入1.6mM FAPGG溶液启动反应，立即在340nm下测定吸光度，记为A0。37℃温育30min，再于340nm下测定吸光度，记为A1，令ΔA＝A1-A0，ACE抑制率根据公式I％＝[1-(ΔA多肽组-ΔAblank组)/(ΔA control组-ΔAblank组)]×100％进行计算。
表1 ACE抑制模型反应体系
Figure GDA0003707127550000031
(单位μL，“—”表示用相应体积的PBS代替)
多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro的ACE抑制活性结果如表二所示：
表二 不同浓度的Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro对ACE的抑制活性
Figure GDA0003707127550000032
由表二可知Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro对ACE的半数抑制浓度即IC50＝381±42μM(Mean±SD，n＝3)
多肽Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的药物先导化合物具有良好的应用前景。附表：鹿茸提取物经LC-MS/MS鉴定的肽段
Figure GDA0003707127550000041
Figure GDA0003707127550000051
Figure GDA0003707127550000061
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Figure GDA0003707127550000281
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Figure GDA0003707127550000301
Figure GDA0003707127550000311
以TGTPGLPGPPGPMGPPGDR为例：肽段的修饰种类为Oxidation(M)；3Pro(O)(P)，表明该肽段有1处甲硫氨酸氧化修饰和3处脯氨酸羟基修饰。肽段的修饰位置为0.0002002000001002000.0，表示该肽段的3处脯氨酸羟基修饰位于第4、7、16位残基，甲硫氨酸氧化修饰位于第13位残基。
附表一的序列所涉及的氨基酸均为氨基酸的简写，各氨基酸缩写、简写及名称见附表二。
附表二 氨基酸名称、缩写与简写
Figure GDA0003707127550000312

Claims (3)

1.一种多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Hyp-Arg-Gly-Ala-Pro。
2.一种权利要求1所述的多肽在制备ACE抑制剂或降血压药物中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ACE抑制剂或降血压药物中添加药物学上可接受的载体或辅料。
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