CN109988228B - 一种蒙古黄芪病程相关蛋白及其晶体、生长方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蒙古黄芪病程相关蛋白及其晶体、生长方法和用途，蒙古黄芪病程相关蛋白具有下述(a)‑(c)任一所述的氨基酸序列：(a)为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(b)为与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；或者(c)具有(a)或(b)所示的氨基酸序列的不丧失生物活性的同系物、衍生物、片段或突变体；本发明首次对AmPR‑10的氨基酸序列进行了公开，有利于实现AmPR‑10的鉴定与功能性研究，进一步发现AmPR‑10在制备治疗特发性肺纤维化的药物中的用途，AmPR‑10的治疗效果明显，作为天然中草药提取物，其来源广泛、毒性小，适于临床应用。

Description

一种蒙古黄芪病程相关蛋白及其晶体、生长方法和用途

技术领域

本发明涉及蛋白质晶体技术领域，具体涉及一种蒙古黄芪病程相关蛋白及其晶体、生长方法和用途。

背景技术

中草药主要根据所含有的活性成分入药，为了充分利用资源和探索新的活性成分，其中蛋白质成分逐渐受到关注。近年来，已有许多具有生物活性的蛋白质相继在多种中草药中被发现。分离纯化中草药中的活性蛋白质成分，以期找到一些新的具有生物活性的蛋白质源，已经成为国内外众多研究工作者的一个重要方向。

黄芪系豆科(Leguminasae)蝶形花亚科(P即ilionoideae)黄芪属(AstragalusLinn)膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)及蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Fisch)Hsiao)的干燥根，是我国著名的常用滋补中药材，具有补气升阳、固表止汗、脱毒生肌、利水脱肿等功效。据《中国药典》2015年版记载，黄芪根含黄芪多糖、黄酮、皂昔、微量元素和氨基酸等多种有效成分，在免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗应激、调节血糖和血压、抑制病毒、抗菌等方面具有显著疗效。

作为一种天然的中草药，黄芪具有丰富的药用活性成分，目前关于黄芪中有效成分的研究主要集中在多糖、皂甙和黄酮等成分上，黄芪中蛋白质含量很高，但对蛋白的功能性研究很少。

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)是植物在病原体侵染下或是外界环境的压力、化学物质和植物自身激素因素促使下由自身编码的具有抵抗作用的蛋白。目前，根据蛋白的分子量、等电点、氨基酸序列、血清学性质和生物学功能等方面性质，病程相关蛋白被划分为14个家族，即PR-1至PR-14。中国专利文献CN1928079A中从蒙古黄芪植株中分离出一种具有核糖核酸酶活性的蛋白，SDS-PAGE测得的亚基分子量17.2kDa。因为该核糖核酸酶活性蛋白与病程相关蛋白(pathogenesis-related protein， PR)具有同源性，被命名为蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-relatedprotein，AmPR-10)。上述的文献中公开了黄芪中的活性蛋白AmPR-10，以及AmPR-10的核糖核酸酶活性，但目前尚未报道 AmPR-10的氨基酸序列，不利于进一步验证AmPR-10的结构、功能以及其在疾病治疗方面的用途。此外，上述纯化后的AmPR-10以溶液形式存在，在蛋白质保藏过程中容易失活，不能长期存储、使用，不利于实现对 AmPR-10的功能性研究和AmPR-10作为疾病治疗药物的药用效果。

发明内容

因此，本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种蒙古黄芪病程相关蛋白，并提供了其核心的氨基酸序列。

本发明要解决的第二个技术问题在于克服现有技术中纯化的蒙古黄芪病程相关蛋白存在稳定性低、易降解的缺陷，从而提供一种稳定性高，适于长期保存、运输，对保存条件要求低的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体。

本发明要解决的第三个技术问题在于提供所述的蒙古黄芪病程相关蛋白在制备治疗特发性肺纤维化的药物方面的新用途。

本发明提供了一种蒙古黄芪病程相关蛋白，具有下述(a)-(c)任一所述的氨基酸序列：

(a)为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)为与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；或者

(c)具有(a)或(b)所示的氨基酸序列的不丧失生物活性的同系物、衍生物、片段或突变体。

本发明提供了编码上述的蒙古黄芪病程相关蛋白的编码基因。

本发明提供了一种制备上述的蒙古黄芪病程相关蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)制备蒙古黄芪总蛋白粗提液；

(2)阴离子交换层析

将蒙古黄芪总蛋白粗提液上样阴离子交换层析柱，使用第一洗脱液洗脱阴离子交换层析柱，以除去杂质蛋白，然后使用第二洗脱液洗脱阴离子交换层析柱，使蒙古黄芪病程相关蛋白从阴离子交换层析柱上被洗脱；

(3)凝胶过滤层析

将含有蒙古黄芪病程相关蛋白的第二洗脱液，上样凝胶过滤层析柱，然后使用第三洗脱液洗脱凝胶过滤层析柱，使蒙古黄芪病程相关蛋白从凝胶过滤层析柱上被洗脱，得到纯化的蒙古黄芪病程相关蛋白。

本发明提供了一种蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体，所述晶体具有P4₁的空间群，晶胞参数为：a＝86.878埃，b＝86.878埃，c＝37.348埃，α＝β＝γ＝90。

上述的晶体，所述蒙古黄芪病程相关蛋白的三维结构中含有3个α螺旋和7个反平行β折叠，7个反平行β折叠包围在位于C末端的α螺旋的外周，使所述晶体形成疏水性内核。

上述的晶体，所述3个α螺旋结构包括：α螺旋1为Pro16至Val24的氨基酸区段，α螺旋2为Ser27至Thr34的氨基酸区段，α螺旋3为Glu130 至Leu152的的氨基酸区段；

所述7个β折叠包括：反平行β折叠1为Val3至Ser12的氨基酸区段，反平行β折叠2为Leu38至Glu45的氨基酸区段，反平行β折叠3为Ile53 至Glu60的氨基酸区段，反平行β折叠4为Glu63至Asp75的氨基酸区段，反平行β折叠5为Val80至Gly88的氨基酸区段，反平行β折叠6为Val95 至Ala106的氨基酸区段，反平行β折叠7为Ser112至Thr122的氨基酸区段。

上述的晶体，所述蒙古黄芪病程相关蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其同系物、片段、突变体。

本发明提供了一种生长上述的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体的方法，包括以下步骤：

S1、将纯化后的蒙古黄芪病程相关蛋白配制为1mg/mL的蛋白溶液；

S2、将步骤S1中蛋白溶液与母液等体积混合后，利用悬滴式蒸汽扩散法形成蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体；

所述母液中包含100mM的Tris和20％(w/v)的PEG-3350，pH为 7.5。

上述的生长方法，所述步骤S3中晶体的生长温度为18℃，生长时间为7天。

本发明提供了一种蒙古黄芪病程相关蛋白的共结晶晶体，所述共结晶晶体由上述的晶体，或以上述的生长方法得到的晶体，与玉米素共结晶形成。

上述的共结晶晶体，所述共结晶晶体具有P4₁的空间群，晶胞参数为： a＝87.119埃，b＝87.119埃，c＝37.218埃，α＝β＝γ＝90。

本发明提供了上述的蒙古黄芪病程相关蛋白在制备治疗肺纤维化的药物中的用途。

本发明提供了上述的蒙古黄芪病程相关蛋白在抑制木瓜蛋白酶活性、 HYP表达水平、TGF-β1表达水平、MDA表达水平或上调SOD表达水平的中的用途。

本发明提供了一种药物组合物，包括权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白、权利要求4-7任一项所述的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体，或以权利要求8-9任一项所述的生长方法得到的黄芪病程相关蛋白的晶体。

上述的药物组合物，还包括药学上可接受的盐、载体和辅料中的至少一种。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白，具有下述(a)-(c)任一所述的氨基酸序列：(a)为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(b)为与 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；或者 (c)具有(a)或(b)所示的氨基酸序列的不丧失生物活性的同系物、衍生物、片段或突变体；本发明首次对AmPR-10的氨基酸序列进行了公开，有利于实现AmPR-10的鉴定与功能性研究，为进一步发现AmPR-10对不同疾病的治疗效果奠定了基础，如在本发明中研究发现AmPR-10可通过提高机体抗氧化能力，减轻肺组织炎症损伤和改善纤维化程度，抑制ECM的沉积，保持肺组织结构的完整，从而起到防治在特发性肺纤维化的作用。

2、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体，所述晶体具有P4₁的空间群，晶胞参数为：a＝86.878埃，b＝86.878埃，c＝37.348埃，α＝β＝γ＝90。

蛋白质晶体是溶液中随机分布的蛋白质分子经规则排列堆积形成的有序聚集体，与溶液状态下的蛋白质相比，蛋白晶体的稳定性提升、不易降低，可长时间保藏和运输。与无序聚集的蛋白质沉淀相比，蛋白质的晶体形式能够保持其高的蛋白活性。本发明首次得到了蒙古黄芪病程相关蛋白 (AmPR-10)的蛋白晶体，晶体产品极大提高蒙古黄芪病程相关蛋白的稳定性，更大限度地提高AmPR-10的纯度和保持产品的高生物活性。本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体能够长期保存，所需的保藏条件要求低，降低了蒙古黄芪病程相关蛋白的保藏和运输成本，为AmPR-10的在科研、医疗和检测等方面的研究和应用提供了重要的实施条件。

另一方面，了解AmPR-10的结构对于药物设计，改变或修饰分子结构使AmPR-10具有特定的应用特性具有重要意义，而要进行蛋白质的结构解析，必须得到适于射线衍射结构分析的晶体，本发明提供的AmPR-10晶体，为得到AmPR-10的三维结构提供了实现基础。

3、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白的三维结构，含有3个α螺旋和1个β圆筒，所述β圆筒由7个反平行β折叠组成，所述β圆筒包围在位于C末端的α螺旋的外周，使所述晶体形成疏水性内核。

本发明提供的AmPR-10的三维结构信息可用于筛选、鉴定、选择和/ 或设计能与AmPR-10或结构同源的分子结合的化学实体或配体。利用计算机模拟技术，设计与在此公开的AmPR-10的构象互补形状的合成化合物和 /或其他分子的设计。具体而言，计算机技术可用于鉴定或设计与AmPR-10 结合的化学实体或配体，例如改性剂、激动剂和拮抗剂等。潜在的改性剂可结合AmPR-10的活性位点或其部分，或干扰之，并可以是竞争性、非竞争性或无竞争性的抑制剂；或通过结合两个单体之间的界面，从而干扰二聚化。一旦针对生物活性进行鉴定或筛选，这些抑制剂/激动剂/拮抗剂就可在治疗上或预防上用于阻断或增强AmPR-10活性。还可通过计算机技术获得与AmPR-10结合并影响其活性的配体类似物的结构-活性数据。

4、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体的生长方法，由于蛋白质晶体的获得是制约蛋白晶体领域的主要技术瓶颈之一，本发明提供的生长方法简便易行，在普通实验条件下就可以完成，为AmPR-10晶体的获得提供了重要的实施途径，能够用于生长适合X射线衍射的蛋白质分子晶体，为AmPR-10的蛋白质工程研究、药物分子设计等方面的发展提供了重要条件；同时，以本发明提供的方法所得到的晶体性质稳定，保持高的蛋白活性，适用于以AmPR-10为基础的药物制备，以及实现AmPR-10的药物治疗效果。

6、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白的纯化方法，能够得到活性高、电荷分布均匀的AmPR-10，适于后期AmPR-10理化性质的测定、活性分析，有利于蛋白质晶体后对AmPR-10的晶体结构进行解析。同时，该纯化方法重复性好，减少了纯化过程中的蛋白损失，缩短了工艺时间，适用于大规模AmPR-10蛋白的分离、纯化。

7、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白在制备治疗特发性肺纤维化的药物中的用途，首次揭示了蒙古黄芪病程相关蛋白在疾病治疗方面的应用。

肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。绝大部分肺纤维化病人病因不明(特发性)，这组疾病称为特发性间质性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia，IIP)，是间质性肺病中一大类。而特发性间质性肺炎(IIP)中最常见的以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病类型为特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病。PF的发明率日益增高，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，患者多死与呼吸衰竭和继发肺部感染。目前对于肺纤维化的治疗糖皮质激素仍为首选，但它仅对20％的PF患者有效，并且常常为一过性反应。免疫抑制剂不仅存在潜在的严重副作用，而且对IF 治疗基本无效。由于目前西医治疗方法中缺少对PF的有效治疗手段，本发明中发现的提取于天然中草药中的效果明确的活性成分，能够明显改善由于博来霉素引起的小鼠体内的肺纤维化，对PF的治疗效果明确。AmPR-10 作为一种成分确定、治疗效果明显、资源丰富的天然中药活性物质，在PF 的药物研发和临床治疗中有着广泛的应用前景。

8、本发明提供的蒙古黄芪病程相关蛋白在制备治疗特发性肺纤维化的药物中的用途，能够实现对IPF的治疗，另外，蒙古黄芪病程相关蛋白是提取于黄芪的天然活性成分，其毒副作用小，有利于提高IPF患者的健康状况。

9、本发明提供的药物组合物，包括蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体， AmPR-10为蛋白晶体形式，AmPR-10的蛋白晶体具有活性高、稳定性好的优势，能够提高AmPR-10作为IPF治疗药物的治疗效果，并适于存储和运输，降低了药物的使用成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中阴离子交换层析中Buffer QB洗脱的色谱图；

图2是本发明实施例1中阴离子交换层析中Buffer QB洗脱的色谱放大图；

图3是本发明实施例1中阴离子离子交换层析后蛋白的SDS-PAGE检测图；

图4是本发明实施例1中凝胶过滤层析中Buffer QS洗脱的色谱图；

图5是本发明实施例1中凝胶过滤层析后蛋白的SDS-PAGE检测图；

图6是本发明实施例1中AmPR-10分离纯化的流程图；

图7是本发明实施例2中AmPR-10与PR-10家族蛋白的一级序列比对结果图；

图8是本发明实施例4中AmPR-10的晶体衍射图；

图9是本发明实施例4中AmPR-10晶体的三维结构飘带图；

图10是本发明实施例4中AmPR-10晶体的表面电势图；

图11是本发明实施例5中AmPR-10与玉米素共结晶晶体的三维结构图；

图12是本发明实验例1中AmPR-10对木瓜蛋白酶活性影响的检测结果图；

图13是本发明实验例2中AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠的体重和肺系数的影响检测图；

图14是本发明实施例2中AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织病理学的影响检测图；

图15是本发明实施例2中AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织 Hyp含量的影响检测图；

图16是本发明实施例2中AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织丙二醛(MDA)含量的影响检测图；

图17是本发明实施例2中AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织 SOD含量的影响检测图；

图18是本发明实施例2中AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织TGF-β1含量的影响检测图；

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。下述实施例中的蒙古黄芪采自山西省浑源黄芪种植基地。

实施例1

本实施例提供一种蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)的分离纯化方法，具体包括以下步骤(参见图6)：

1、制备蒙古黄芪粗提液

蒙古黄芪干燥根切片、机械粉碎、过药典3号筛后得到黄芪粉末，按 1:10料液比加入提取缓冲液(含25mM Tris-HCl，5mM NaCl，pH 8.0)，55℃恒温浸提60min，布氏漏斗抽滤弃掉沉淀，上清液12,000rpm离心20min 后，得到蒙古黄芪粗提液。

2、阴离子交换层析

(1)将蒙古黄芪粗提液上样Q Sepharose Fast Flow XK16/20阴离子交换层析柱，Q Sepharose Fast Flow XK16/20阴离子交换层析柱为实验室自装柱，填料名称：QSepharose Fast Flow，柱子名称：XK16/20。

(2)使用第一洗脱液冲洗阴离子交换层析柱，冲洗至A280＜100mAU，除去未与离子柱结合的杂蛋白，第一洗脱液为Buffer QA(含25mM Tris-HCl，5mM NaCl，pH 8.0)。

(3)使用第二洗脱液线性洗脱阴离子交换层析柱，将目标AmPR-10 从柱子上洗脱下来，第二洗脱液为Buffer QB(25mM Tris-HCl，1M NaCl， pH 8.0)，先在体积分数为0％～50％Buffer QB线性洗脱10个柱体积，然后体积分数100％Buffer QB梯度洗脱3个柱体积，每管15mL收集。AmPR-10 在体积分数为9.0％～23.8％的Buffer QB洗脱下，从阴离子交换层析柱上被洗脱下来(图1和图2)。

(4)收集步骤(3)中含有蛋白AmPR-10的第二洗脱液，将第二洗脱液超滤浓缩至5mL，12,000rpm下离心20min后取上清液用于下一步分离纯化。

3、凝胶过滤层析

将步骤2中含有蛋白AmPR-10的上清液上样HiPrep 16/60Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析柱，使用第三洗脱液冲洗凝胶过滤层析柱，将蛋白 AmPR-10从柱子上洗脱下来。第三洗脱液为Buffer S(137mmol/L NaCl， 2.7mmol/L KCl，10mmol/L KH₂PO₄，2mmol/LNa₂HPO₄，pH 7.4)。目的蛋白AmPR-10在Buffer S使用量为62mL处被洗脱出来(图4)。

阴离子离子交换层析柱上样后以Buffer QA洗脱的色谱图，阴离子交换层析是利用阴离子或阴离子化合物与固相中阳离子交换剂的结合能力不同进行分离纯化，蒙古黄芪粗提液带正电荷的杂蛋白因而无法与层析柱结合，被Buffer QA洗脱下来，带负电荷的AmPR-10与层析柱正常结合。继续使用Buffer QB洗脱目标蛋白，图1显示Buffer QB洗脱目标蛋白的色谱结果图，图2为图1的放大结果图。由于Buffer QB中离子浓度的改变，影响蛋白AmPR-10与层析柱的结合，在Buffer QB的离子的体积分数为 9.0％～23.8％时，可以使AmPR-10脱离层析柱。

图3显示阴离子离子交换层析后收集的蛋白样品的SDS-PAGE检测胶图，取其中在18.4KD附近形成清晰蛋白条带的样品1C4、1C3、1C5、2A2 等样品用于凝胶过柱层析。

图4显示凝胶过滤层析柱上样后以Buffer S洗脱的色谱图，凝胶过滤色谱依据相对分子质量的大小和性状进行分离，由图4可知，在Buffer S 的使用量在62mL处，蛋白AmPR-10被洗脱下来，得到纯化的蛋白 AmPR-10。

图5显示凝胶过滤层析后收集的蛋白样品(1C1、1C2、1C3和1C4) 的SDS-PAGE检测胶图，以及对目标蛋白AmPR-10浓缩后的检测结果。由图5可知，利用上述的蛋白纯化方法能够纯化得到蛋白含量和纯度高的 AmPR-10。

结果显示：采用Q Sepharose Fast Flow XK16/20阴离子交换层析加 HiPrep 16/60Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析的两步法分离纯化 AmPR-10，与Q Sepharose FastFlow XK26/20阴离子交换层析加Butyl Sepharose High Performance疏水层析加SuperdexTM 75 10/300GL凝胶过滤层析的三步法分离纯化AmPR-10相比，缩短了工艺时间、减少了目的蛋白在纯化过程中的损失，且两步法得到的AmPR-10电荷分布均匀，可满足后续蛋白质质谱鉴定和晶体生长的要求。

实施例2

本实施例提供一种蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)的氨基酸序列的测定方法，具体包括以下步骤：

1、蛋白质谱分析

采用Thermo Fisher公司Q Exactive Mass Spectrometer对AmPR-10进行蛋白鉴定。SDS-PAGE电泳分离获得目的条带，胶内酶解后质谱检测，液相条件为：进样5min后，先预柱脱盐然后梯度洗脱经C18毛细管柱进行肽段分离，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B液为含0.1％甲酸的乙睛，流动相C液为含0.1％甲酸的水溶液，流速200nl/min.。梯度洗脱方法为：5-60min乙睛浓度从10％上升至85％，65-85min乙睛浓度保持在 85％，85-95minA液平衡分析柱。质谱条件为：正离子模式下，氮气为雾化气，氩气为碰撞气，源温100℃，锥孔电压40V，毛细管电压3kV，一级质谱质量扫描范围为350～1500Da，二级质谱质量扫描范围为50～2000Da， DDA模式对肽段自动进行MS/MS测定。数据采用Matrixscience公司Mascot 软件进行MS/MS Ion Search检索。

2、黄芪转录组测定

山西省浑源县黄芪药材种植基地采摘新鲜黄芪，置液氮中保存，Trizol 试剂法提取总RNA，分别采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法检测 RNA样品的纯度、浓度和完整性等，以保证使用合格的样品进行转录组测序。样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：(1)用带有Oligo(dT) 的磁珠富集真核生物mRNA；(2)加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers) 合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；(4)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXP beads 进行片段大小选择；(5)最后通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小(Insert Size)进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。

蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调。因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。

3、将蛋白AmPR-10质谱分析得到的肽段信息与黄芪转录组测定得到的转录组信息比对，得到AmPR-10完整的一级结构序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将AmPR-10的一级序列与PR-10家族其他蛋白的一级序列进行比对，具体的包括：AmPR-10(ZY16)；Protein Llpr-10.1a(PDBID 4RYV,61％)； Ara H 8Allergen(PDBID4MA6,66％)；Major Pollen Allergen Bet V 1-A (PDBID 4BKD,47％)；Major StrawberryAllergen Fra A1-E(PDBID 4C9I, 46％)；Fra A3Allergen(PDBID 4C94,47％)；M MajorAllergen Dau C 1 (PDBID 2WQL,33％)。比对结果如图7所示，AmPR-10与PR-10家族蛋白具有一定同源性。

实施例3

本实施例提供一种生长蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)的晶体的方法，采用Hampton Research公司蛋白质结晶筛选试剂盒(Index、PEG/ION、 SaltRx、Crystal ScreenKitⅠ、Ⅱ)。通过悬滴式蒸汽扩散法初筛AmPR-10 蛋白质的结晶条件，在多个不同的结晶条件下获得了初始晶体。通过优化调整，优选为如下的生长条件：

1、取实施例1中纯化的蛋白AmPR-10溶液，将AmPR-10溶液浓缩后得到浓度为(1mg/mL)的AmPR-10溶液。

2、生长微小蛋白晶体

取0.3μL步骤1中浓缩后的AmPR-10溶液，与0.3μL的母液(100mM Tris，pH7.5，20％PEG3350(w/v))混合滴加在晶体生长盖玻片上，手动将其倒置于晶体生长孔上，置于18℃生长7天，可得到130×60×30μm的 AmPR-10蛋白质晶体。

上述的晶体生长条件能够培养得到临界尺寸的AmPR-10晶体，保持了 AmPR-10的蛋白活性。AmPR-10晶体的衍射强度高，适于X衍射以分析晶体的三维结构，为基于蛋白结构的药物分子设计提供了条件。上述生长条件得到的AmPR-10晶体稳定性和蛋白活性高，适于长时间运输和保藏，为基础AmPR-10蛋白的药物制备提供了条件。

实施例4

本实施例提供一种蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)的晶体和晶体的三维结构，AmPR-10晶体通过实施例3中的生长条件培养得到。

1、AmPR-10晶体

将AmPR-10蛋白质晶体在上海同步辐射光源BL18U下衍射达到

晶体X射线衍射图如图8所示，晶体具体的衍射数据如表1所示：

表1AmPR-10晶体衍射数据收集相关参数

上述的蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)的晶体，能够提高蒙古黄芪病程相关蛋白的稳定性，更大限度地提高AmPR-10的纯度和保持产品的高生物活性。AmPR-10晶体适于长期保存，所需的保藏条件要求低，降低了蒙古黄芪病程相关蛋白的保藏和运输成本，为AmPR-10的在科研、医疗、检测等方面的研究和应用提供了重要的实施条件。

2、AmPR-10晶体的三维结构

基于实施例2中已获得的AmPR-10一级结构，和上述的AmPR-10晶体的衍射检测，得到AmPR-10晶体的三维结构。

图9显示AmPR-10晶体的三维结构：AmPR-10晶体含有3个α螺旋和 1个β圆筒，所述β圆筒由7个反平行β折叠组成。3个α螺旋结构包括：α螺旋1为Pro16至Val24的氨基酸区段，α螺旋2为Ser27至Thr34的氨基酸区段，α螺旋3为Glu130至Leu152的的氨基酸区段；7个β折叠包括：反平行β折叠1为Val3至Ser12的氨基酸区段，反平行β折叠2为Leu38 至Glu45的氨基酸区段，反平行β折叠3为Ile53至Glu60的氨基酸区段，反平行β折叠4为Glu63至Asp75的氨基酸区段，反平行β折叠5为Val80 至Gly88的氨基酸区段，反平行β折叠6为Val95至Ala106的氨基酸区段，反平行β折叠7为Ser112至Thr122的氨基酸区段。

β圆筒包围在位于C末端的α3螺旋的外周，反平行β折叠1和反平行β折叠2的连接处有2个不规则卷曲：Loop1和Loop2，位于Loop1和Loop2 中间的螺旋部分弯曲并被分隔成α1螺旋和α2螺旋。β折叠与α螺旋共同形成一个大的疏水性内核，这个疏水性内核是AmPR-10发挥生物活性的关键部位。

图10显示AmPR-10晶体的表面电势图：极性氨基酸残基位于表面，疏水性侧链位于接触面，使AmPR-10蛋白具有稳定的空间结构。

本发明中首次揭示了AmPR-10蛋白的三维结构，发现了AmPR-10蛋白的活性位点，为设计合成AmPR-10蛋白-配合复合物，基于AmPR-10的小分子药物，多肽和免疫结合物等提供了基础，有利于AmPR-10蛋白的功能性研究和实现AmPR-10蛋白的医药用途。

实施例5

本实施例提供了一种蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)的共结晶晶体，是AmPR-10晶体与玉米素的共结晶晶体，共结晶晶体通过下述步骤得到：

将实施例3中的AmPR-10晶体浸泡于1mM玉米素中，在18℃下浸泡2天后，得到AmPR-10与玉米素的共结晶晶体，共结晶晶体的衍射数据如表2所示：

表2AmPR-10与玉米素的共结晶晶体衍射数据收集相关参数

对AmPR-10的三维结构分析显示，AmPR-10的疏水性内核有四个入口，允许小分子有机物、离子及水分子的进入。本发明首次发现了玉米素能够进入AmPR-10的疏水性空腔，实现与AmPR-10的结合，并培养得到了玉米素与AmPR-10的共结晶晶体。

PR-10家族蛋白质有两种不同类型的口袋，第一种为小的、浅的口袋，只能特异性结合一分子配体，第二种为大的、横跨整个疏水性内核的口袋，能够结合两分子以上的配体。玉米素通过疏水性相互作用力结合于由Ile35，Ile38，Leu56，Leu68，Leu143，Phe58和Lys139组成的 AmPR-10的口袋处，AmPR-10与玉米素共结晶晶体的三维结构如图11 所示。

玉米素是一种植物体内天然存在的细胞分裂素，具有促进植物细胞分裂、减慢呼吸作用、保持细胞活力、延缓植物衰老的作用。玉米素与 AmPR-10的结合提示AmPR-10具有运输、储存玉米素的功能，在提高植物抗逆性，促进植物生长方面具有应用前景。

实验例1

1、实验目的：检测蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)对木瓜蛋白酶活性的影响。

2、实验方法：

以benzoyl-arginine-naphthylamide(BANA)为底物，20μL的0.1mg/mL 木瓜蛋白酶溶液(25mM PBS，pH 6.0)中加入40μL活化液(2mM EDTA， 3mM DTT，pH6.0)，100μL抑制剂以及340μL磷酸盐缓冲液(25mM PBS， pH 6.0)。37℃孵育10min，然后加入200μL的1mM BANA(含1％DMSO， 25mM PBS，pH 6.0)底物开始反应，37℃反应20min后，加入500μL的 95％乙醇配制的2％的盐酸终止反应。最后加入500μL的0.06％乙醇配制的 p-dimethylaminocinnamaldehyde，540nm处测其吸光值。

3、实验结果：

图12显示AmPR-10对木瓜蛋白酶活性的影响，与未添加AmPR-10蛋白的空白对照组相比，实验组1(AmPR-10：0.15mg/mL)、实验组2 (AmPR-10：0.2mg/mL)和实验组3(AmPR-10：0.3mg/mL)中，木瓜蛋白酶的活性均得到抑制，其中，在AmPR-10浓度为0.2mg/mL时，对木瓜蛋白酶的抑制效果最好。

实验例2

1、实验目的：检测蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)对特发性肺纤维化的治疗效果。

2、实验方法：

2.1分组及模型制备

SPF级雌性ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)适应性饲养一周后，将体重16-18g的小鼠分为对照组、模型组及AmPR-10 治疗组。模型组小鼠鼻腔滴注博来霉素造模。实验动物使用许可证号:SCXK (京)2016-0011)。

2.2给药方法

建模后第2天起，对照组、模型组腹腔注射0.9％质量分数的生理盐水，每只小鼠0.2mL；治疗组腹腔注射AmPR-10，剂量按照1mg/kg，用0.9％生理盐水稀释，每只0.2mL，连续注射14天。

2.3统计学方法

实验数据均以均数±标准差

表示，全部资料用SPSS 17.0统计软件进行组间单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.4检测指标与方法

2.4.1一般状况观察

每天观察动物活动、精神状态、摄食等状况。分别于给药后第7、14、 21、28天，测定每组小鼠的体重变化。分别于给药后第7、28天，每次每组取5只小鼠，眼球采血处死。取肺脏，用滤纸吸干血迹，称取并记录肺质量，根据公式计算肺系数：肺系数＝肺质量(mg)/体质量(g)。

表3和图13A显示肺纤维化对小鼠体重的影响，观察期间对照组小鼠活泼好动，皮毛光亮，摄食正常，体重逐渐增加。模型组小鼠精神萎靡，呼吸急促，反应灵敏度变差，毛发干燥晦暗，严重者脱毛，进食下降，体重逐渐减轻。治疗组小鼠精神状态略好于模型组。

每组小鼠在造模后第7、28天肺系数的变化情况如图13B所示：与对照组相比，模型组小鼠的肺系数明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，治疗组小鼠的肺系数明显降低(P<0.05)。

表3AmPR-10对肺纤维化小鼠体重变化的影响(

n＝10)

注：*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01.^#表示与模型组相比，

P<0.05；^##表示与模型组相比，P<0.01

2.4.2HE染色观察肺组织形态变化

分别于给药后第7、28天取材，每次每组处死5只小鼠。取左肺4％多聚甲醛固定，按常规病理学方法包埋，病理切片进行苏木素-伊红(HE) 染色，光镜下观察肺泡炎、肺纤维化程度。

图14显示AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织病理学的影响，图14A为对照组第7天的肺纤维化小鼠肺组织病理学切片，图14B为模型组第7天的肺纤维化小鼠肺组织病理学切片，图14C为治疗组第7天的肺纤维化小鼠肺组织病理学切片，图14D为对照组第28天的肺纤维化小鼠肺组织病理学切片，图14E为模型组第28天的肺纤维化小鼠肺组织病理学切片，图14F为治疗组第28天的肺纤维化小鼠肺组织病理学切片。

结果显示：光镜下对照组小鼠的肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺泡间隔未见增厚及炎症细胞细浸润。模型组小鼠第7天可见明显急性肺炎，肺泡间隔增宽，可见大量炎性细胞浸润，同时伴有大量出血(图14B)；模型组小鼠第28天可见肺泡结构紊乱，肺泡炎明显，肺泡间隔成纤维细胞大量增殖及细胞外基质大量沉积，呈现典型的特发性肺纤维化病变(图14E)。与模型组比较，AmPR-10给药组小鼠第7、28天肺组织结构明显改善，炎症细胞浸润程度减轻，成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积均减少，肺组织纤维化程度明显减轻(图14C、14F)。

2.4.3H分光光度法检测肺组织中Hyp、SOD、MDA含量表达

取右肺用冰盐水冲洗，滤纸吸干水分，冷冻保存备检，肺组织中Hyp、 SOD、MDA含量检测均按照试剂盒说明书操作。

羟脯氨酸是组成胶原蛋白最重要的成分之一，通过测定Hyp来判断组织中胶原含量的变化，从而推测组织纤维化的程度。

图15显示AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织Hyp含量的影响，模型组小鼠肺组织中Hyp含量第7、28天明显高于对照组(P<0.01)。与模型组比较，AmPR-10治疗组第7、28天有明显降低(P<0.05，P<0.01)。

图16显示AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织丙二醛(MDA)含量的影响，模型组小鼠肺组织中MDA表达水平第7、28天显著高于对照组(P<0.01)。与模型组比较，治疗组第28天MDA表达水平明显降低 (P<0.01)。

图17显示AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织SOD含量的影响，模型组肺组织中SOD表达水平第7、28天显著低于对照组(P<0.01)。与模型组比较，治疗组第28天SOD表达水平明显升高(P<0.01)。

2.4.4酶联免疫吸附法检测肺组织中TGF-β1含量表达

取右肺冷冻保存备检，肺组织中TGF-β1含量检测按照试剂盒说明书操作。

图18显示AmPR-10对特发性肺纤维化小鼠肺组织TGF-β1含量的影响，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中TGF-β1表达水平第7、28天显著高于对照组(P<0.01)。与模型组比较，治疗组第7、28天明显降低(P<0. 05，P<0.01)。

3、实验结果：

特发性肺纤维化是以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，最终形成肺间质纤维化为特征病变的慢性进展性疾病。目前临床上用于治疗特发性肺纤维化的药物主要是糖皮质激素和免疫抑制剂，但其副作用严重影响了广泛使用，因此寻找合适的中药治疗特发性肺纤维化已成为目前的研究热点。

本研究HE染色结果表明，AmPR-10可明显减轻特发性肺纤维化小鼠肺泡结构受损及肺泡间隔增厚的程度，减少炎性细胞浸润，表明AmPR-10 对小鼠PF的发生发展具有抑制作用。肺系数作为反映PF程度的指标之一，在PF的发病过程中，由于炎症细胞浸润、血管充血淤血等因素造成肺重增加，导致肺系数升高。本研究结果显示，AmPR-10可显著降低模型小鼠的肺系数，进一步证明AmPR-10可改善小鼠PF的发病程度。

HYP作为胶原纤维蛋白中主要的组成成分，可准确地间接反映胶原纤维蛋白的含量。研究表明TGF-β1是细胞外基质沉积最强的促进剂，还能抑制胶原的降解，在肺纤维化发病机制中的作用显著。本实验结果表明， AmPR-10能显著降低肺纤维化小鼠肺组织中HYP、TGF-β1的含量表达，提示AmPR-10可减轻胶原在肺间质得沉积，从而起到减轻PF的作用。

肺纤维化是一个复杂的病理生理过程，尽管发病机制尚未完全阐明，但氧化应激在其发生发展中起重要作用[12]。SOD是体内重要的清除氧自由基的酶，肺组织中SOD的含量可以间接反映机体肺清除氧自由基的能力[13]。MDA是脂质过氧化的终产物，可以反映机体过氧化的程度，也可以破坏细胞膜结构，进而导致细胞肿胀坏死。本研究发现，AmPR-10可降低肺纤维化小鼠肺组织内MDA含量，上调SOD的含量，表明AmPR-10可能通过调节氧化/抗氧化失衡、降低氧化应激损伤达到减轻PF的目的。

综上所述，AmPR-10可能通过降低HYP、TGF-β1的表达，升高肺组织SOD和降低MDA含量表达水平，提高机体抗氧化能力，减轻肺组织炎症损伤和改善纤维化程度，抑制ECM的沉积，保持肺组织结构的完整，从而起到防治PF的作用，这些作用机制的揭示为指导AmPR-10的开发及临床用药提供了可靠的药理学依据。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 山西中医学院

<120> 一种蒙古黄芪病程相关蛋白及其晶体、生长方法和用途

<130> HA201702965

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> 蒙古黄芪病程相关蛋白(AmPR-10)

<400> 1

Met Gly Val Ile Ser Phe Asn Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Ala Pro

1 5 10 15

Ala Arg Leu Tyr Lys Ala Leu Val Thr Asp Ser Asp Thr Leu Ile Pro

20 25 30

Lys Thr Ile Pro Glu Ile Gln Ser Val Glu Ile Val Glu Gly Asn Gly

35 40 45

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Phe Val Glu Asp Gly Glu Thr

50 55 60

Lys His Val Leu His Lys Val Glu Val Ile Asp Asp Ala Asn Leu Val

65 70 75 80

Tyr Lys Tyr Ser Leu Val Gly Gly Val Gly Phe Pro Glu Thr Val Glu

85 90 95

Lys Ile Ser Phe Glu Gly Lys Leu Val Ala Gly Pro Asp Gly Gly Ser

100 105 110

Ile Ala Lys Ile Thr Val Thr Tyr His Thr Lys Gly Asp Ala Thr Pro

115 120 125

Thr Glu Lys Glu Leu Leu Asp Gly Lys Val Lys Gly Glu Ala Leu Phe

130 135 140

Lys Ala Leu Glu Gly Tyr Val Leu Ala Asn Pro Glu Tyr Lys

145 150 155

Claims (15)

1.一种蒙古黄芪病程相关蛋白，其特征在于，为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白的编码基因。

3.一种制备权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备蒙古黄芪总蛋白粗提液；

(2)阴离子交换层析；

将蒙古黄芪总蛋白粗提液上样阴离子交换层析柱，使用第一洗脱液洗脱阴离子交换层析柱，以除去杂质蛋白，然后使用第二洗脱液洗脱阴离子交换层析柱，使蒙古黄芪病程相关蛋白从阴离子交换层析柱上被洗脱；

(3)凝胶过滤层析；

将含有蒙古黄芪病程相关蛋白的第二洗脱液，上样凝胶过滤层析柱，然后使用第三洗脱液洗脱凝胶过滤层析柱，使蒙古黄芪病程相关蛋白从凝胶过滤层析柱上被洗脱，得到纯化的蒙古黄芪病程相关蛋白。

4.一种如权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体，其特征在于，所述晶体为AmPR-10晶体，其衍射数据收集相关参数见下表：

5.根据权利要求4所述的晶体，其特征在于，所述蒙古黄芪病程相关蛋白的三维结构中含有3个α螺旋和7个反平行β折叠，7个反平行β折叠包围在位于C末端的α螺旋的外周，使所述晶体形成疏水性内核。

6.根据权利要求5所述的晶体，其特征在于，所述3个α螺旋结构包括：α螺旋1为Pro16至Val24的氨基酸区段，α螺旋2为Ser27至Thr34的氨基酸区段，α螺旋3为Glu130至Leu152的氨基酸区段；

所述7个反平行β折叠包括：反平行β折叠1为Val3至Ser12的氨基酸区段，反平行β折叠2为Leu38至Glu45的氨基酸区段，反平行β折叠3为Ile53至Glu60的氨基酸区段，反平行β折叠4为Glu63至Asp75的氨基酸区段，反平行β折叠5为Val80至Gly88的氨基酸区段，反平行β折叠6为Val95至Ala106的氨基酸区段，反平行β折叠7为Ser112至Thr122的氨基酸区段。

7.一种生长如权利要求4-6任一项所述的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将纯化后的蒙古黄芪病程相关蛋白配制为1mg/mL的蛋白溶液；

S2、将步骤S1中蛋白溶液与母液等体积混合后，利用悬滴式蒸汽扩散法形成蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体；

所述母液中包含100mM的Tris和20％(w/v)的PEG-3350，pH为7.5。

8.根据权利要求7所述的生长方法，其特征在于，所述步骤S2中晶体的生长温度为18℃，生长时间为7天。

9.一种蒙古黄芪病程相关蛋白的共结晶晶体，其特征在于，所述共结晶晶体由权利要求4-6任一项所述的晶体，或以权利要求7-8任一项所述的生长方法得到的晶体，与玉米素共结晶形成；所述共结晶晶体具有P4₁的空间群，晶胞参数为：a＝87.119埃，b＝87.119埃，c＝37.218埃，α＝β＝γ＝90。

10.权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白在制备治疗肺纤维化的药物中的用途。

11.权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白在制备抑制木瓜蛋白酶活性、HYP表达水平、TGF-β1表达水平、MDA表达水平或上调SOD表达水平的产品中的用途。

12.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白、权利要求4-6任一项所述的蒙古黄芪病程相关蛋白的晶体，或以权利要求7-8任一项所述的生长方法得到的黄芪病程相关蛋白的晶体。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。

15.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的盐。

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