CN1928079B

CN1928079B - 一种具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制备方法

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Publication number: CN1928079B
Application number: CN2006101133580A
Authority: CN
Inventors: 闫巧娟; 江正强; 齐笑玮; 韩鲁佳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2026-09-25
Also published as: CN1928079A

Abstract

本发明公开了一种具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制备方法。该蛋白，其凝胶过滤层析测得的分子量为32.6kDa，SDS-PAGE测得的亚基分子量17.2kDa，总糖的质量百分含量为13.7％，其N末端15个氨基酸的序列为序列表中序列1；所述总糖中含有质量百分含量为73％的阿拉伯糖和质量百分含量为15％的葡萄糖。本发明的具有核糖核酸酶活性蛋白，其核糖核酸酶的比活达74.11U/mg。

Description

一种具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制备方法。

背景技术

中草药主要根据所含有的活性成分入药，为了充分利用资源和探索新的活性成分，其中蛋白质成分逐渐受到关注。近年来，已有许多具有生物活性的蛋白质相继在多种中草药中被发现。分离纯化中草药中的活性蛋白质成分，以期找到一些新的具有生物活性的蛋白质源，已经成为国内外众多研究工作者的一个重要方向。

病程相关蛋白是植物在病原体侵染下或是外界环境的压力、化学物质和植物自身激素因素促使下由自身编码的具有抵抗作用的蛋白。自烟草中的四个病程相关蛋白于二十世纪七十年代被首次发现之后，越来越多的此类蛋白在单子叶植物和双子叶植物的广大种属中被发现。目前，根据蛋白的分子量、等电点、氨基酸序列、血清学性质和生物学功能等方面性质，病程相关蛋白被划分为14个家族，即PR-1至PR-14。

PR-10蛋白是一类分子量在16-19kDa之间，等电点偏酸性并具有抗蛋白酶活性的蛋白，根据它们没有信号肽和结构上的特性判断它们存在于胞液内。已经在很多植物中都发现有PR-10蛋白的存在，包括双子叶植物，如西芹、豌豆、大豆和马铃薯；单子叶植物，如芦笋、百合和水稻。许多研究表明PR-10蛋白不仅参与了植物的抗病机制反应，同时在植物的自身发育中也起着重要作用。PR-10蛋白在结构上类似核糖核酸酶，在目前已报道的PR-10家族蛋白中，发现有体外的RNase活性的有桦树花粉过敏原Bet v1，棉花GaPR-10，黄羽扇豆L1PR-10.1C，辣椒CaPR-10和丁茄SsPR10等，但是大多PR-10蛋白如土豆、西芹和苜蓿中的PR-10蛋白没有RNase活性。

黄芪，系豆科(Leguminasae)蝶形花亚科(Papilionoideae)黄芪属(AstragalusLinn)膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)及蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Fisch)Hsiao)的干燥根。关于黄芪中有效成分的研究主要集中在多糖、皂甙和黄酮等，对于黄芪中含量很大的蛋白质组分(15％以上)研究报道很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制备方法。

本发明所提供的具有核糖核酸酶活性的蛋白，名称为AmPR-10，其凝胶过滤层析测得的分子量为32.6kDa，SDS-PAGE测得的亚基分子量17.2kDa，总糖的质量百分含量为13.7％，其N末端15个氨基酸的序列为序列表中序列1；所述总糖中含有质量百分含量为73％的阿拉伯糖和质量百分含量为15％的葡萄糖。

所述具有核糖核酸酶活性的蛋白，是按照包括下述步骤的方法制备：

1)制备pH为5.2-8.2黄芪植株的总蛋白提取液；

2)将步骤1)得到的总蛋白提取液进行金属离子螯合层析，用pH为6.0-8.0磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到未结合蛋白峰洗脱液；

3)将步骤2)得到的未结合蛋白峰洗脱液过阴离子交换层析柱，先用pH为5.4-7.4磷酸缓冲液洗去未结合蛋白，用含30～60mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，再用含300～500mmol/L NaCl磷酸缓冲液洗脱结合蛋白，收集洗脱峰；

4)步骤3)得到的洗脱液用湿球粒度范围101-303μm，分子量分离范围为1.5kDa-30kDa的凝胶层析柱分离，用pH为5.2-8.2柠檬酸-磷酸缓冲液洗脱，收集核糖核酸酶比活为74.11U/mg的洗脱峰，得到具有核糖核酸酶活性的蛋白。

所述步骤1)中总蛋白提取液是将黄芪粉碎成黄芪粗粉，加入pH为5.2-8.2磷酸缓冲液，在4-20℃下搅拌提取8-12小时，过滤提取液，将滤液离心收集上清液得到的。

所述步骤1)中黄芪粗粉与磷酸缓冲液的重量比为1∶4～10，所述磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为7.2。

所述步骤2)中的磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为7.0；所述磷酸缓冲液的流速为8～14mL/小时。

所述步骤3)中的磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为6.4；所述洗涤杂蛋白的缓冲液的NaCl浓度优选为50mmol/L；所述洗脱结合蛋白的缓冲液的NaCl浓度优选为400mmol/L。

所述步骤4)中所用凝胶层析柱为Sephadex G50凝胶层析柱；所述柠檬酸-磷酸缓冲液为含10mmol/L柠檬酸、20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，pH为6.2的溶液；所述柠檬酸-磷酸缓冲液洗脱的流速为4～6mL/小时。

所述制备具有核糖核酸酶活性的蛋白的步骤中还包括将步骤1)和2)中得到的样品进行透析，将步骤2)和3)收集的洗脱液样品进行超滤，所述超滤的截留分子量为10kDa。

所述黄芪可为蒙古黄芪、膜荚黄芪或多序岩黄芪。

本发明提供的上述具有核糖核酸酶活性的蛋白的制备方法，包括下述步骤

1)制备pH为5.2-8.2黄芪植株的总蛋白提取液；

3)将步骤2)得到的未结合蛋白峰洗脱液过阴离子交换层析柱，先用pH为5.4-7.4磷酸缓冲液洗去未结合蛋白，用含30～60mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，再用含300～500mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱结合蛋白，收集洗脱峰；

所述方法中，所述步骤1)中总蛋白提取液是将黄芪粉碎成黄芪粗粉，加入pH为5.2-8.2磷酸缓冲液，在4-20℃下搅拌提取8-12小时，过滤提取液，将滤液离心收集上清液得到的。

所述方法中，所述步骤1)中黄芪粗粉与磷酸缓冲液的重量比为1∶4～10，所述磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为7.2。

所述方法中，所述步骤2)中的磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为7.0；所述磷酸缓冲液的流速为8～14mL/小时。

所述方法中，所述步骤3)中的磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为6.4；所述洗涤杂蛋白的缓冲液的NaCl浓度优选为50mmol/L；所述洗脱结合蛋白的缓冲液的NaCl浓度优选为400mmol/L。

所述方法中，所述步骤4)中所用凝胶层析柱为Sephadex G50凝胶层析柱；所述柠檬酸-磷酸缓冲液为含10mmol/L柠檬酸、20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，pH为6.2的溶液；所述柠檬酸-磷酸缓冲液洗脱的流速为4～6mL/小时。

所述方法中，所述制备具有核糖核酸酶活性的蛋白的步骤中还包括将步骤1)和2)中得到的样品进行透析，将步骤2)和3)收集的洗脱液样品进行超滤，所述超滤的截留分子量为10kDa。

所述方法中，所述黄芪可为蒙古黄芪、膜荚黄芪或多序岩黄芪。

本发明的具有核糖核酸酶活性蛋白，其核糖核酸酶的比活达74.11U/mg。本发明的制备具有核糖核酸酶活性蛋白的方法是一种高效的提取纯化方法，通过将提取的粗提液进行金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步分离纯化得到电泳纯蛋白，从10g黄芪中可以得到4.19mg纯蛋白(表1)。本发明的具有核糖核酸酶活性蛋白，可作为核糖核酸酶，用于降解RNA；也可以本发明的具有核糖核酸酶活性蛋白为抗原制备单克隆和多克隆抗体，检测目的植物中是否含有具有核糖核酸酶活性蛋白；将本发明的具有核糖核酸酶活性蛋白的编码基因与TA29等启动子结合后构成嵌合基因可作为不育基因，导入到植株中为植物基因育种提供新途径。

附图说明

图1为Zn-Agarose-4B层析图谱

图2为离子交换柱QAE Sephadex A-25层析图谱

图3为凝胶柱Sephadex G50层析图谱

图4为各步纯化后SDS-PAGE图谱

图5为凝胶过滤层析Superdex 75测具有核糖核酸酶活性蛋白分子量

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、具有核糖核酸酶活性的蛋白的获得

1、黄芪粗提液的提取

将蒙古黄芪(Astragalus mongholicus Bunge)粉碎后，加入磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 7.2)，使黄芪粉末与磷酸缓冲液的重量比为1∶6，在4℃搅拌提取10小时。将提取液用4层纱布过滤，滤液在10000rpm(3000g)，4℃条件下离心10分钟，取上清液，即为含目标蛋白的黄芪粗提液。

核糖核酸酶活性的测定：核糖核酸酶活性的测定以酵母tRNA(Sigma公司，美国)为底物参照周向军等人的方法(Zhou et al.，2002，Plant Sci.162，629-636)。即将200μg酵母tRNA溶于400μL MES缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)，加入100μL样品在56℃保温30分钟后加入预冷的4mol/L LiCl 1mL，在冰水浴放置3小时后10000rpm冷冻离心20分钟，取上清液1mL加入二蒸水2mL测定A₂₆₀。酶活定义为在上述反应条件下30分钟后使A₂₆₀(光径1cm)增加1个单位所需要的酶量。蛋白的精确定量采用Lowry方法(Lowry et al.，1951，J.Biol.Chem.193，265-275)以牛血清蛋白为标准，蛋白量检测及酶活检测结果如表1所示。

将上述黄芪粗提液进行SDS-PAGE，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分离胶，考马斯亮蓝R250染色，结果如图4中泳道1所示。

2、Zn-Agarose-4B金属离子螯合层析

Zn-Agarose-4B金属离子螯合层析柱料的制备方法：金属离子螯合层析柱料为按照Jerker和Birgit的方法(Jerker et al.，1983，Biochem 22(7)，1621-1630)制备。具体步骤为：将20g凝胶Agarose-4B(湿重)加入25mL 2mol/L氢氧化钠、12.5mL环氧氯丙烷和12.5mL乙腈混合液中，30℃ 150rpm震荡混匀24小时，然后用去离子水充分洗涤凝胶，再用2mol/L碳酸钠平衡。平衡好的柱料滤干加入溶有4g亚氨基二乙酸的40mL 2mol/L碳酸钠溶液中，60℃ 150rpm震荡混匀24小时，用去离子水充分洗涤。活化好的柱料装柱，将1mg/mL氯化锌溶液通过层析柱使层析柱饱和，用去离子水充分洗涤，制得金属离子螯合层析柱Zn-Agarose-4B。

预先用磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 7.0)平衡好层析柱Zn-Agarose-4B，将步骤1得到的黄芪粗提液20mL，在磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 7.0)中透析过夜。透析后的粗体液样品离心后，上样，先用磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 7.0)洗脱未结合蛋白，流速为12mL/小时，待A₂₈₀≤0.08后，再用120mmol/L咪唑洗脱结合蛋白，洗脱时流速为1mL/min，洗至A₂₈₀≤0.25。Zn-Agarose-4B层析图谱如图1所示，图1中A1为未螯合蛋白峰；A2为120mmol/L咪唑洗脱蛋白峰。以牛血清蛋白为标准，采用Lowry方法(Lowry et al.，1951，J.Biol.Chem.193，265-275)对收集的各峰洗脱液蛋白精确定量，用步骤1所述方法测定核糖核酸酶的比活，蛋白量检测及酶活检测结果如表1所示，结果表明未结合蛋白峰A1和120mmol/L咪唑洗脱峰A2的核糖核酸酶的比活分别为12.57U/mg和1.88U/mg。收集未螯合蛋白峰A1，对收集液进行超滤(截留分子量为10kDa，Stirred Cell Model 8050，Millipore)后用磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 6.4)透析过夜，得到的样品进行SDS-PAGE，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分离胶，考马斯亮蓝R250染色，结果如图4中泳道2所示。

3、QAE Sephadex A-25离子交换层析

用磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 6.4)平衡QAE Sephadex A-25阴离子柱(离子交换基团为-CH₂CH₂N⁺(CH₂COHCH₃)(CH₂CH₃)₂，购于Pharmacia公司)，将步骤2透析后的峰A1样品过平衡后QAE Sephadex A-25离子柱，用磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 6.4)洗去未结合蛋白，然后用含50mmol/L NaCl的磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 6.4)过柱洗涤杂蛋白，再用含400mmol/L NaCl的磷酸缓冲液(20mmol/L，pH 6.4)洗脱结合蛋白，自上样出峰(图2中Q3和Q4峰)开始收集至A₂₈₀≤0.04。QAE Sephadex A-25检测A₂₈₀绘出层析曲线如图2所示，图2中Q1为未吸附蛋白峰；Q2为含50mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱峰；Q3和Q4为含400mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱峰，蛋白的精确定量采用Lowry方法(同步骤1)以牛血清蛋白为标准，用步骤1所述方法测定核糖核酸酶的比活，蛋白量检测及酶活检测结果如表1所示，表明Q4峰值处有最高酶活为41.18U/mg。收集Q3和Q4处样品，进行SDS-PAGE，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分离胶，考马斯亮蓝R250染色，结果如图4中泳道3所示，将Q3和Q4洗脱峰进行超滤(截留分子量为10kDa，Stirred Cell Model 8050，Millipore)至1ml。

4、Sephadex G50凝胶层析

用柠檬酸-磷酸缓冲液(10mmol/L柠檬酸、20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，pH 6.2)平衡的Sephadex G50凝胶柱(购于Pharmacia公司)，然后将步骤3经超滤后的收集的Q3和Q4样品(1mL)上柱Sephadex G50，用柠檬酸-磷酸缓冲液(10mmol/L柠檬酸、20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，pH 6.2)洗脱，控制流速为5mL/h，自出峰后收集至A₂₈₀≤0.02，检测A₂₈₀绘出层析曲线如图3所示。收集各峰洗脱液，采用Lowry方法(同步骤1)对蛋白的精确定量，以牛血清蛋白为标准，用步骤1所述方法测定核糖核酸酶的比活，蛋白量检测及酶活检测结果如表1所示，表明图3所示的G1峰值处核糖核酸酶比活为7.78U/mg，图3所示的G2峰值处为74.11U/mg，收集G2峰洗脱液，进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分离胶，考马斯亮蓝R250染色，结果表明G2处AmPR-10达到电泳纯，纯化电泳如图4中泳道4所示，将该纯化的蛋白，命名为AmPR-10。糖蛋白染色采用高碘酸-西佛氏(PAS)方法，结果如图4中泳道5所示，表明AmPR-10为糖蛋白。

经过上述步骤2、3、4三步分离纯化得到电泳纯AmPR-10，从10g黄芪中可以得到4.19mg纯蛋白(表1)。图4为各步纯化后SDS-PAGE；其中，泳道M：标准蛋白分子量标准；泳道1：粗提液；泳道2：步骤2中Zn-Agarose-4B层析收集样品；泳道3：步骤3中QAE Sephadex A-25离子层析收集样品；泳道4：步骤4中Sephadex G50凝胶过滤层析收集样品；泳道5：步骤4中纯化的AmPR-10糖蛋白染色。

表1.AmPR-10纯化过程中蛋白活力

5、AmPR-10理化性质的测定

1)分子量的测定

采用12.5％(g/ml)的分离胶进行SDS-PAGE，测得AmPR-10亚基的分子量为17.2kDa。采用凝胶过滤Superdex 75层析法测定AmPR-10蛋白的分子量，层析柱预先用柠檬酸-磷酸缓冲液(10mmol/L柠檬酸、20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，pH 6.2)平衡，分别将2g/L的蓝色葡聚糖2000、牛血清蛋白(68.0kDa)、卵清蛋白(45.0kDa)、胰凝乳蛋白酶原A(25.7kDa)、细胞色素C(12.3kDa)和AmPR-10过Superdex 75层析柱(购于Pharmacia公司)，均用柠檬酸-磷酸缓冲液(10mmol/L柠檬酸、20mmol/LNa₂HPO₄·12H₂O，pH 6.2)洗脱，流速为0.25mL/min，分别自各标准蛋白和样品上样开始收收集Superdex 75层析柱洗脱液，直至洗脱峰A₂₈₀最高值处，测量出各标准蛋白和样品洗脱液的体积，计算Ve/V₀值(Ve，蛋白洗脱体积；V₀，蓝色葡聚糖2000洗脱体积)。用AmPR-10蛋白过Superdex 75凝胶层析柱上显示单一峰，其Ve/V₀＝1.39(Ve，蛋白洗脱体积；V₀，蓝色葡聚糖2000洗脱体积)。以Ve/V₀为横坐标，以分子量的对数值(Log值)为纵坐标做标准曲线(图5)，根据曲线公式y＝-1.6053x+3.6548，已知AmPR-10 Ve/V₀＝1.39，求出AmPR-10分子量的对数值，再利用函数关系计算求出其分子量为32.6kDa(图5)，由于电泳纯AmPR-10在SDS-PAGE上显示其为分子量为17.2kDa的单一蛋白带，表明AmPR-10是由17.2kDa的亚基组成的同源二聚体。

图5中，Ve为标准蛋白洗脱体积；V₀为蓝色葡聚糖2000洗脱体积；图5中标准蛋白牛血清蛋白(68.0kDa)；卵清蛋白(45.0kDa)；胰凝乳蛋白酶原A(25.7kDa)；细胞色素C(12.3kDa)均用△表示；AmPR-10用■表示，纵坐标中MW表示物质的分子量。

2)AmPR-10糖蛋白中糖含量和组成的测定

将AmPR-10糖蛋白水解，水解条件为：0.4mL AmPR-10水溶液(蛋白浓度为3.6mg/mL)中加入0.1mL三氟乙酸，置于沸水浴煮沸2小时，取出水解样品在真空干燥器中将三氟乙酸完全挥发掉后将样品溶解在0.2mL二蒸水中。

AmPR-10总糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准。具体步骤如下所述：在试管中加入0.1mL 5％苯酚溶液、0.1mL样品和0.5mL浓硫酸，立即混匀，置于沸水浴中煮15min，冷却至室温后在490nm处测定吸光值。检测结果表明每1mgAmPR-10蛋白中含糖量为0.137mg，即13.7％。

AmPR-10糖组分分析采用离子交换色谱法(HPAEC)，将水解样品10μL上样于色谱仪(Dionex BioLC system Model 2500，USA)，固定相为PA10色谱柱(DionexCorp.)，流动相为0.05mmol/L NaOH，流速为1.0mL/min。色谱分析结果表明，其中阿拉伯糖73.0％，葡萄糖15.0％，其余为微量的果糖和一种未知糖。

3)一些金属离子和试剂对AmPR-10核糖核酸酶活力的影响的测定：

在100μL AmPR-10中加入不同的金属离子和试剂，使其终浓度为1mmol/L，40℃保温30min后加入含200μg酵母tRNA 400μL MES缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)，在56℃保温30分钟后加入预冷的4mol/L LiCl 1mL，在冰水浴放置3小时后10000rpm冷冻离心20分钟，取上清液1mL加入二蒸水2mL测定A₂₆₀。酶活定义同步骤1所述。以不加入任何金属离子的酶活为100％。结果如表2所示，表明AmPR-10对小分子有机物SDS和金属离子Cu²⁺，Ag⁺敏感。

表2 一些金属离子和试剂对AmPR-10核糖核酸酶活力的影响

4)N末端序列分析

蛋白经SDS-PAGE后转移到醋酸纤维膜上，采用Edman降解法，PROCISE氨基酸测序仪(Applied Biosystem，USA)分析其N-末端氨基酸序列。

Edman降解法测出纯蛋白的N末端15个氨基酸序列为GVISFNEETISTVAP，将其与数据库中其它PR-10蛋白的N末端15个氨基酸序列对比表明AmPR-10为一种新的PR-10蛋白，与黄羽扇豆L1PR-10.1C同源性最高为80％(表3)。

表3 AmPR-10与其它蛋白的N-末端15个氨基酸残基同源性比较

注：下划线表明氨基酸相同。

序列表

<160>1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>蒙古黄芪(Astragalus mongholicus Bunge)

<400>1

Gly Val Ile Ser Phe Asn Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Ala Pro

1 5 10 15

Claims

1.一种具有核糖核酸酶活性的蛋白，其凝胶过滤层析测得的分子量为32.6kDa，SDS-PAGE测得的亚基分子量为17.2kDa，总糖的质量百分含量为13.7％，其N末端15个氨基酸的序列为序列表中序列1；所述总糖中含有质量百分含量为73％的阿拉伯糖和质量百分含量为15％的葡萄糖；所述具有核糖核酸酶活性的蛋白，按照包括下述步骤的方法制备：

1)将蒙古黄芪粉碎，加入pH为5.2-8.2磷酸缓冲液，在4-20℃下搅拌提取8-12小时，过滤提取液，将滤液离心收集上清液得到pH为7.2的蒙古黄芪植株的总蛋白提取液；所述蒙古黄芪与磷酸缓冲液的重量比为1∶4～10，所述磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L，所述磷酸缓冲液的pH为7.2；

2)将步骤1)得到的总蛋白提取液进行Zn-Agarose-4B金属离子螯合层析，用pH为7.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到未结合蛋白峰洗脱液；

3)将步骤2)得到的未结合蛋白峰洗脱液过QAE Sephadex A-25阴离子交换层析柱，先用pH为6.4、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液洗去未结合蛋白，用含50mmol/LNaCl的磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，再用含400mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱结合蛋白，收集洗脱峰；

4)步骤3)得到的洗脱液用湿球粒度范围101-303μm，分子量分离范围为1.5kDa-30kDa的Sephadex G50凝胶层析柱分离，用pH为6.2的柠檬酸-磷酸缓冲液洗脱，收集核糖核酸酶比活为74.11U/mg的洗脱峰，得到具有核糖核酸酶活性的蛋白；所述柠檬酸-磷酸缓冲液为含10mmol/L柠檬酸，20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O的溶液。

2.一种制备具有核糖核酸酶活性的蛋白的方法，包括下述步骤：