CN117099869A - 一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法 - Google Patents
一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，包括如下步骤：将小麦蛋白加入去离子水中分散制成悬浮液，依次进行脱淀粉纯化、超声改性、酶解、高温灭酶处理，酶解产物以4000 r/min‑6000 r/min的转速进行离心，收集上清液进行冷冻干燥，获得所述小麦蛋白肽粉；之后制成质量浓度3%的小麦蛋白多肽溶液并加入无机钙进行螯合，反应形成的螯合液冷却后经无水乙醇沉淀、干燥成粉，获得所述小麦蛋白肽钙螯合物；所述超声改性处理的条件为超声功率180‑270 W、时间30‑50 min；所述酶解过程中使用的蛋白酶包括碱性蛋白酶、Proteax酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶以及耐热蛋白酶PC 10F；所述螯合反应体系的pH=5‑9、温度30‑70°C。本发明建立了一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，涉及的螯合物制备工艺简单，生产成本低廉，可为实际生产提供科学依据，同时制得的螯合物补充剂吸收效率高，是一种理想的功能性钙制剂，在补钙的同时还可发挥小麦蛋白多肽的生物活性功能，具有良好的实际应用价值和开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法。
背景技术
随着经济和现代社会的快速发展，科学技术创新不断引领食品行业技术进步，健康理念越来越受到人们的重视。针对不发达地区人群的缺钙现状，补钙剂的研发至今未止，已有大量的补钙产品被研发并应用到人体钙缺乏的健康问题上。
目前，国内市场上销售的钙制剂主要为无机钙和有机钙。前者生产成本低、钙含量高，但必须借助载体或消耗机体相关的酶才能被吸收；后者虽有着高溶解度、对肠胃无刺激作用等优点，但需解离成钙离子后才能进入肠胃，还会与胃酸形成沉淀而降低钙的吸收，值得注意的是肠道的环境偏碱性，钙离子在碱性条件下容易形成不溶性钙沉积而阻碍钙的吸收。钙产品层出不穷，但生物利用率不高的现实成为制约人体有效补钙的瓶颈问题（参阅Trends in Food Science and Technology，58：140-148，2016），因此，开发有效的钙补充剂已成为一个迫切需要解决的问题。与传统的钙制剂相比，肽钙螯合物具备良好的生物可及性和更高的吸收效率。小肽在机体内的运转存在一个独立的系统，在运输过程中消耗能量少，速度快，不易达到饱和，由于该机制的存在，肽作为金属离子的配体与金属离子进行结合之后，可通过肽的转运机制进入黏膜细胞，且进入过程中不被酶分解（参阅FoodResearch International, 141:110169，2021）。除了能提高钙离子的生物利用度，螯合物还具有调节免疫、抑菌、抗氧化、降血糖血脂、保护肝脏等多种功能。
现上市使用的多肽螯合钙产品有胶原蛋白钙肽粉、酪蛋白磷酸肽钙咀嚼片等，然而胶原蛋白和酪蛋白皆为动物蛋白，提取过程繁琐、生产成本高昂，由此制得的螯合钙市场价格较高，令消费者难以接受。因此，寻找钙结合量高、成本低的原料来开发多肽螯合钙制剂具有十分重要的意义。小麦蛋白作为淀粉加工行业的主要副产物，蛋白质含量高达75%，且酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）的的比例高达30-40%。多项研究表明，富含酸性氨基酸的肽段更有利于Ca2+的结合，螯合活性较高的吸收肽中通常存在谷氨酸(Glu)、天冬氨酸（Asp）、丝氨酸（Ser）（参阅Food and Function，2020，11：8724-8734），综上所述，小麦蛋白具有适宜与钙离子螯合的分子基础，是制备螯合剂的理想原料。
因此，本发明希望提供一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，以克服现有产品的不足；与此同时，除了作为钙补充剂，肽钙螯合物也能够作为抑菌剂、抗氧化剂等应用到工业生产中，促进小麦蛋白产业链向高附加值产品延伸。
发明内容
基于我国居民钙缺乏的问题比较突出，对新型钙制剂的需求较大。然而，现今上市使用的肽螯合钙产品仅胶原蛋白肽螯合钙和酪蛋白磷酸肽螯合钙两种，而一些特殊人群由于乳糖不耐症也不能依靠奶制品来补充钙源，且动物蛋白的价格相对较高。
针对以上所述现有技术的不足之处，为解决现有多肽螯合钙产品单一、成本高昂、适用人群有限等问题，本发明提供了一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，以期为新型钙补充剂的研究开发生产提供科学依据和理论参考，具体技术方案包括如下步骤：将谷阮粉与水以1:2-1:4的料液比溶解后，置于磁力搅拌器上，在200-400 r/min的转速下搅拌均匀后，加入α-淀粉酶脱除其中的淀粉；将纯化的小麦蛋白溶解后进行超声改性处理，冷却至室温备用；利用生物可控酶解技术进行酶解，获得的酶解液经灭酶后进行离心，分离沉淀物，取上清液冷冻干燥，获得小麦蛋白肽；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙混合；利用无水乙醇沉淀法对游离钙离子和螯合钙进行分离，析出的沉淀物干燥成粉即为小麦蛋白肽钙螯合物。
所述酶解处理过程中采用的酶包括耐热蛋白酶PC 10F、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、Proteax酶。
优选的，所述α-淀粉酶纯化处理小麦蛋白包括：加入0.5-1.5%的α-淀粉酶，在温度60℃、pH为6.5的条件下反应40-60 min，冷却至室温后在4000 r/min离心20-30 min，获得的沉淀物进行冻干，即为纯化的小麦蛋白。
优选的，所述超声改性处理包括：小麦蛋白以1-3%的质量浓度溶解后，在180-270W超声功率下处理30-50 min，以此提高小麦蛋白在水中的溶解性和分散性。
优选的，所述酶解过程中蛋白酶为耐热蛋白酶PC 10F时，水解度控制为3-12%（反应时间为10-80 min），调节酶解体系的pH恒定为6.0-7.0，温度为60-70°C。
优选的，所述酶解过程中蛋白酶为Proteax酶时，水解度控制为5-20%（反应时间为10-90 min），调节酶解体系的pH恒定为7.0-7.5，温度为50-55℃。
优选的，所述酶解过程中蛋白酶为风味蛋白酶时，水解度控制为2-8%（反应时间为15-110 min），并调节酶解体系的pH恒定为6.5-7.0，温度为50-55℃。
优选的，所述酶解过程中蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解度控制为2-8%（反应时间为15-120 min），并调节酶解体系的pH恒定为7.0-7.5，温度为50-55℃。
优选的，所述酶解过程中蛋白酶为胰蛋白酶时，水解度控制为3-12%（反应时间为5-80 min），并调节酶解体系的pH恒定为7.0-8.0，温度为50-55℃。
优选的，所述酶解过程中蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解度控制为5-20%（反应时间为2-50 min），并调节酶解体系的pH恒定为8.0-9.0，温度为50-55℃。
优选的，所述离心处理包括：离心的转速为4000-6000 r/min，时间为15-25 min。
优选的，所述谷阮粉的蛋白含量为72-75%，通过α-淀粉酶纯化后，蛋白含量高达83-86%。
优选的，所述螯合物的钙结合量为19.80-65.04 mg/g，粒径为135.85-239.10 nm。
本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：
1. 相对于现有的酪蛋白和胶原蛋白肽螯合钙产品，本发明制备的小麦蛋白肽螯合钙以小麦蛋白为原料，拓展了钙元素营养产品的原料来源，大大降低了原料成本，且不易产生过敏反应，适用人群更加广泛；
2. 酶解前使用α-淀粉酶对谷阮粉中的淀粉进行脱除，提高了原料中蛋白质的含量，使得后续酶解过程中底物和酶的接触面积增加，进而缩短酶解时间，提高多肽的生产效率；
3. 采用新型酶制剂耐热蛋白酶PC 10F，为使用生物酶法制备多肽螯合钙时使用的酶制剂提供了新的参考，不再局限于碱性蛋白酶等常规的水解酶，且耐热蛋白酶的稳定性高于常见的蛋白水解酶；
4. 利用超声辅助酶法，超声产生的空化作用可以破坏小麦蛋白分子间的氢键、范德华力等相互作用力，使得小麦蛋白原本紧密的结构逐渐变得松散，提高了小麦蛋白在水中的分散性，同时有利于暴露更多的酶解位点和螯合位点。
附图说明
图1为对比例1-6和实施例1-4制得的小麦蛋白肽钙螯合物的钙结合量测定图。
图2为最佳制备条件所得的小麦蛋白肽及其螯合物的扫描电镜图，其中小麦蛋白肽作为对照。
图3最佳制备条件所得的小麦蛋白肽及其螯合物的荧光光谱图，其中小麦蛋白肽作为对照。
图4为最佳制备条件所得的小麦蛋白肽及其螯合物的粒径分布图，其中小麦蛋白肽作为对照。
实施方式
为解决现有技术上的不足，本发明提供了一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，以期提高钙离子的溶解性，促进细胞对钙离子的吸收作用，实现新型钙强化剂的可控、高效制备，为肽钙螯合物的工业化生产及应用提供一定的科学依据与技术支持。本发明的技术方案包括如下步骤：将谷阮粉与水以1:2-1:4的料液比溶解后，置于磁力搅拌器上，在200-400r/min的转速下搅拌均匀后，加入α-淀粉酶脱除其中的淀粉；将纯化的小麦蛋白溶解后进行超声改性处理，冷却至室温备用；利用生物可控酶解技术进行酶解，获得的酶解液经灭酶后进行离心，分离沉淀物，取上清液冷冻干燥，获得小麦蛋白肽；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙混合；利用无水乙醇沉淀法对游离钙离子和螯合钙进行分离，析出的沉淀物干燥成粉即为小麦蛋白肽钙螯合物。
所述酶解处理过程中采用的酶包括耐热蛋白酶PC 10F、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、Proteax酶。
进一步的，所述α-淀粉酶纯化处理小麦蛋白包括：加入0.5-1.5%的α-淀粉酶，在温度60℃、pH为6.5的条件下反应40-60 min，冷却至室温后在4000 r/min离心20-30 min，获得的沉淀物进行冻干，即为纯化的小麦蛋白。
进一步的，所述超声改性处理包括：小麦蛋白以1-3%的质量浓度溶解后，在180-270 W超声功率下处理30-50 min，以此提高小麦蛋白在水中的溶解性和分散性。
进一步的，所述酶解过程中蛋白酶为耐热蛋白酶PC 10F时，水解度控制为3-12%（反应时间为10-80 min），调节酶解体系的pH恒定为6.0-7.0，温度为60-70°C。
进一步的，所述酶解过程中蛋白酶为Proteax酶时，水解度控制为5-20%（反应时间为10-90 min），调节酶解体系的pH恒定为7.0-7.5，温度为50-55℃。
进一步的，所述酶解过程中蛋白酶为风味蛋白酶时，水解度控制为2-8%（反应时间为15-110 min），并调节酶解体系的pH恒定为6.5-7.0，温度为50-55℃。
进一步的，所述酶解过程中蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解度控制为2-8%（反应时间为15-120 min），并调节酶解体系的pH恒定为7.0-7.5，温度为50-55℃。
进一步的，所述酶解过程中蛋白酶为胰蛋白酶时，水解度控制为3-12%（反应时间为5-80 min），并调节酶解体系的pH恒定为7.0-8.0，温度为50-55℃。
进一步的，所述酶解过程中蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解度控制为5-20%（反应时间为2-50 min），并调节酶解体系的pH恒定为8.0-9.0，温度为50-55℃。
进一步的，所述离心处理包括：离心的转速为4000-6000 r/min，时间为15-25min。
进一步的，所述谷阮粉的蛋白含量为72-75%，通过α-淀粉酶纯化后，蛋白含量高达83-86%。
进一步的，所述螯合物的钙结合量为19.80-65.04 mg/g，粒径为135.85-239.10nm。
下面通过结合具体实施例及对比例对本发明的技术方案作出进一步的介绍说明。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明实施例及对比例采用如下试验方法：
采用乙二胺四乙二酸钠（EDTA）滴定法测定小麦蛋白肽钙螯合物的钙结合量：称取小麦蛋白肽钙螯合物样品30 mg，加入15 mL超纯水，待其溶解后再加入3 mL NaOH（1 mol/L）溶液、1 ml三乙醇胺和300 μL的钙羧酸指示剂（0.01 mol/L），用EDTA（0.01 mol/L）溶液作为滴定液，与此同时观察溶液颜色变化，从酒红色变为蓝色并在3 min内不褪色，即为滴定终点。通过记录EDTA滴定液的用量，即可计算得到小麦蛋白肽钙螯合物的钙结合量（mg钙/g产物）。
扫描电镜：分别取小麦蛋白肽（WPH）及小麦蛋白肽钙螯合物（WPH-Ca）粉末各1 mg，然后将其均匀地涂抹在连接至装载平台的双面导电胶带的标本架上，在真空环境下喷金镀膜5分钟，设置扫描电子显微镜的工作条件为：加速电压3.0 kV，工作距离6.1 mm，放大倍数5000×，观察后将扫描图像保存。
荧光光谱：将WPH以及WPH-Ca粉末用去离子水分别配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，设置激发波长为280 nm，波长范围为290-450 nm，然后对样品溶液进行扫描，对比螯合前后荧光吸收峰的改变情况。
粒径：将WPH以及WPH-Ca粉末用去离子水分别配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，再用0.45 µm的滤膜进行过滤以除去其中的不溶物，将溶液装载至塑料比色皿内，在纳米粒度电位仪上进行检测。
对比例1：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至50°C，加入胰蛋白酶并调节反应体系pH值至7，待水解度达到3%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15min）灭活胰蛋白酶，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为4:1的条件下混合，再将混合溶液的pH值调至7.0左右，在温度50°C的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
对比例2：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至55°C，然后加入木瓜蛋白酶，并调节反应体系pH值至7，待水解度达到8%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活木瓜蛋白酶，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为4:1的条件下混合，再将混合溶液的pH值调至7.0左右，在温度50℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
对比例3：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至50°C，然后加入风味蛋白酶，并调节反应体系pH值至7，待水解度达到4%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活风味蛋白酶，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为4:1的条件下混合，再将混合溶液的pH值调至7.0左右，在温度50℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
对比例4：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至50°C，然后加入Proteax酶，并调节反应体系pH值至7，待水解度达到15%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活Proteax酶，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为4:1的条件下混合，再将混合溶液的pH值调至7.0左右，在温度50℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
对比例5：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至50°C，然后加入碱性蛋白酶，并调节反应体系pH值至8，待水解度达到20%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活碱性蛋白酶，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为4:1的条件下混合，再将混合溶液的pH值调至7.0左右，在温度50℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
对比例6：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至60°C，然后加入耐热蛋白酶PC 10F并调节反应体系pH值至7，待水解度达到6%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活耐热蛋白酶PC 10F，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为4:1的条件下混合，再将混合溶液的pH值调至6.0左右，在温度40°C的水浴条件下进行螯合反应40 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
实施例1：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至60°C，然后加入耐热蛋白酶PC 10F并调节反应体系pH值至7，待水解度达到6%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活耐热蛋白酶PC 10F，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为3:1条件下混合，再将混合溶液的pH值调至6.0左右，在温度40℃的水浴条件下进行螯合反应40 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
实施例2：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至60°C，然后加入耐热蛋白酶PC 10F并调节反应体系pH值至7，待水解度达到6%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活耐热蛋白酶PC 10F，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为3:1条件下混合，再将混合溶液的pH值调至6.0左右，在温度40℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
实施例3：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至60°C，然后加入耐热蛋白酶PC 10F并调节反应体系pH值至7，待水解度达到6%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活耐热蛋白酶PC 10F，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为3:1条件下混合，再将混合溶液的pH值调至6.0左右，在温度50℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
实施例4：首先将小麦蛋白加入去离子水中制成质量浓度为2%的小麦蛋白溶液，然后于270 W超声功率下处理40 min，再用保鲜膜封口后置于水浴锅中加热至60°C，然后加入耐热蛋白酶PC 10F并调节反应体系pH值至7，待水解度达到6%时停止反应，高温（100°C沸水浴处理15 min）灭活耐热蛋白酶PC 10F，酶解液冷却后在转速5000 r/min条件下离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到小麦蛋白肽粉；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙在质量比为3:1条件下混合，再将混合溶液的pH值调至7.0左右，在温度50℃的水浴条件下进行螯合反应50 min获得螯合反应产物溶液，螯合液冷却后加入5倍体积的无水乙醇后在转速5000 r/min条件下离心15 min，取离心后获得的沉淀物，置于真空冷冻干燥机中干燥，获得小麦蛋白肽钙螯合物。
实验部分
对本发明所作实施例与对比例制成的小麦蛋白肽钙螯合物的钙结合量测定，如图1所示；最佳制备条件所得的小麦蛋白肽及其螯合物的扫描电镜图、荧光光谱图、粒径分布图分别如图2、图3、图4所示，其中小麦蛋白肽作为对照。
如图1所示，不同水解度下所生成的肽组成不同，且暴露出螯合位点的种类及数量也存在差异，因而会在一定程度上对水解物的螯合活性造成影响。在水解反应的快速阶段内各个蛋白酶可水解的催化位点多，致使肽键断裂，水解度迅速上升，暴露出的螯合位点的数量和种类也随之增加，之后水解度过大，多肽降解成游离氨基酸，导致小麦蛋白肽的钙结合量下降。与胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、Proteax酶和碱性蛋白酶相比，耐热蛋白酶水解产生的小麦蛋白肽的钙结合量最高，而且其反应温度高达65-70℃，在工业生产中具有潜在的应用优势，还具有稳定性好等特点，因而选择耐热蛋白酶作为最佳用酶。
如图2所示，小麦蛋白肽类物质结构松散，表面光滑，有一些白色颗粒，可能是吸附在多肽表面的氯化钠结晶，而与钙离子发生螯合作用后，表面变得粗糙，呈排列致密的颗粒结构，内部结构更加紧凑，这是由于多肽与钙之间的配位键引起了内部结构的折叠，从而生成小颗粒状物质，这些颗粒相互之间会发生吸引进而产生聚集。此外螯合物的表面还有一些裂痕存在，可能是测样前进行喷金操作时，样品在空气中吸潮，而电子显微镜的环境是真空的，导致样品快速失水干燥，因此留下痕迹。
如图3所示，WPH的最大吸收峰出现在349.8 nm处，此处是芳香族氨基酸的特征吸收峰，加入Ca2+后，氨基酸会随着金属离子的加入转移到多肽分子表面，导致WPH-Ca的最大吸收峰发生偏移，蓝移至346.8 nm处，与此同时，WPH在螯合的过程中发生折叠也会导致最大吸收峰发生改变；此外，经螯合处理后，WPH-Ca的内源性荧光强度显著降低，说明钙离子与多肽链上羧基、羟基等结合位点复杂的相互作用导致了激发态的能量变化，造成多肽的荧光猝灭。
如图4所示，WPH在水溶液中的平均粒径为251.23 nm，加入Ca2+后，小麦蛋白多肽与金属离子发生反应，致使二者配位结合形成环状结构，WPH-Ca的平均粒径由此减小，显著下降至230.92 nm；同时也可以发现WPH-Ca的粒径分布范围较窄、分布区域比较均匀，说明小麦蛋白肽螯合钙形成了均一稳定的结构，且纳米级小分子螯合钙的溶解度比常规的无机钙和有机钙制剂更高。
最后应说明的是：上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1. 一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将谷阮粉与水以1:2-1:4的料液比溶解后，置于磁力搅拌器上，在200-400 r/min的转速下搅拌均匀后，加入α-淀粉酶脱除其中的淀粉；将纯化的小麦蛋白溶解后进行超声改性处理，冷却至室温备用；利用生物可控酶解技术进行酶解，获得的酶解液经灭酶后进行离心，分离沉淀物，取上清液冷冻干燥，获得小麦蛋白肽；随后加入去离子水配制成质量浓度3%的小麦蛋白肽溶液，并与无机钙混合；利用无水乙醇沉淀法对游离钙离子和螯合钙进行分离，析出的沉淀物干燥成粉即为小麦蛋白肽钙螯合物；
所述酶解处理过程中采用的酶包括耐热蛋白酶PC 10F、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、Proteax酶。
2. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述α-淀粉酶纯化处理小麦蛋白包括：加入0.5-1.5%的α-淀粉酶，在温度60℃、pH为6.5的条件下反应40-60 min，冷却至室温后在4000 r/min离心20-30 min，获得的沉淀物进行冻干，即为纯化的小麦蛋白。
3. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述超声改性处理包括：小麦蛋白以1-3%的质量浓度溶解后，在180-270 W超声功率下处理30-50min，以此提高小麦蛋白在水中的溶解性和分散性。
4. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中蛋白酶为耐热蛋白酶PC 10F时，水解度控制为3-12%（反应时间为10-80 min），调节酶解体系的pH恒定为6.0-7.0，温度为60-70°C。
5. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中蛋白酶为Proteax酶时，水解度控制为5-20%（反应时间为10-90 min），调节酶解体系的pH恒定为7.0-7.5，温度为50-55℃。
6. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中蛋白酶为风味蛋白酶时，水解度控制为2-8%（反应时间为15-110 min），并调节酶解体系的pH恒定为6.5-7.0，温度为50-55℃。
7. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解度控制为2-8%（反应时间为15-120 min），并调节酶解体系的pH恒定为7.0-7.5，温度为50-55℃。
8. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中蛋白酶为胰蛋白酶时，水解度控制为3-12%（反应时间为5-80 min），并调节酶解体系的pH恒定为7.0-8.0，温度为50-55℃。
9. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解度控制为5-20%（反应时间为2-50 min），并调节酶解体系的pH恒定为8.0-9.0，温度为50-55℃。
10. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述离心处理包括：离心的转速为4000-6000 r/min，时间为15-25 min。
11. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述螯合处理包括：无机钙溶液为硫酸钙、碳酸钙、氯化钙或氧化钙中的任何一个或数个的混合物，钙元素与所述小分子肽的质量之比为1:1-5:1，混合溶液的pH值为5.0-9.0，水浴条件下螯合反应的温度为30-70°C，反应时间为30-70 min。
12. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述螯合液置于冰水中冷却，反应结束后，加入4-6倍体积的无水乙醇混合，在转速4000-6000 r/min条件下离心至少15-20 min。
13.根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述谷阮粉的蛋白含量为72-75%，通过α-淀粉酶纯化后，蛋白含量高达83-86%。
14. 根据权利要求1所述的一种小麦蛋白肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述螯合物的钙结合量为19.80-65.04 mg/g，粒径为135.85-239.10 nm。
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