CN111349687B

CN111349687B - 一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111349687B
Application number: CN202010196390.XA
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 颜正飞; 秦琴; 唐诚业
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2040-03-19
Also published as: CN111349687A

Abstract

本发明公开了一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用，属于检测技术领域。本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，利用此方法检测蛋白酶的酶活时，仅需将待测样品与蛋白酶筛选底物混合后观察混合液的颜色变化和颜色变化的响应时间即可，操作简单。本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，此方法以大米蛋白为底物，因此，利用此方法可准确的测定出蛋白酶对大米蛋白的酶活，在筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶方面具有极高的应用前景。

Description

一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶筛选底物及其制备方法和应用，属于检测技术领域。

背景技术

大米是我国第一大粮食品种。大米蛋白则是国际公认的优质蛋白。与大豆蛋白、乳清蛋白等蛋白相比，大米蛋白的营养抑制因子含量少，无过敏反应，大米蛋白包含人体所需氨基酸且氨基酸配比合理，另外，大米蛋白的生物价远超大豆蛋白，可与虾及牛肉等的生物价相媲美，符合世界卫生组织（WHO）推荐的理想模式。

但是，由于大米蛋白中含有较多谷蛋白，不易溶解，因此，大米蛋白多用作动物饲料添加剂。为了提高大米蛋白的附加值，通常将其水解成短肽或氨基酸后制成营养价值更高的短肽或氨基酸营养液，作为高价值添加剂运用于保健品、饮料、化妆品等行业。高纯度的大米肽价格在10万/吨以上。

目前，主要是使用酶解法对大米蛋白进行水解。但是，现有的酶解法仍具有许多缺陷，其中，酶解法所使用的蛋白酶对大米蛋白的酶活不高所导致的水解大米蛋白效率低、水解大米蛋白所得水解液中多肽含量低是最严重的缺陷之一。例如，公开号为CN1102229643A的专利申请文本中，发明人使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶三种酶复配水解大米蛋白，水解3h，仅可使反应液中多肽的含量达50%左右；公开号为CN106967773A的专利申请文本中，发明人使用亮氨酸氨肽酶水解大米蛋白，水解4 h，仅可使反应液中多肽的含量达30%~40%。因此，筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶至关重要。

福林酚法（中华人民共和国专业标准GB/T 23527-2009：蛋白酶制剂）是目前测定蛋白酶酶活最常用的方法，利用此方法，可分别以酪蛋白、大米蛋白等多种蛋白为底物测定蛋白酶对不同蛋白的酶活。但是，福林酚法具有操作繁琐、耗时耗力等缺陷，这大大降低了蛋白酶酶活的检测效率。因此，急需找到一种操作简单的测定蛋白酶酶活的方法，尤其是以大米蛋白为底物测定蛋白酶酶活的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单的测定蛋白酶酶活的方法，尤其是以大米蛋白为底物测定蛋白酶酶活的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备蛋白酶筛选底物的方法，所述方法为将含有蛋白和金纳米颗粒的缓冲液进行第一次反应，得到反应液A；在反应液A中添加巯基己醇进行第二次反应，得到反应液B；将反应液B进行分离，得到蛋白酶筛选底物。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，蛋白的浓度为5~100 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，蛋白的浓度为40 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为大米蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1~1.0 mmol/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中，金纳米颗粒的浓度为0.1 mmol/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、Tris-EDTA缓冲液或Tris缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的浓度为5~20 mmol/L、pH为7~8。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的浓度为10 mmol/L、pH为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述反应液A中，巯基己醇的浓度为0.1~0.5 mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应液A中，巯基己醇的浓度为0.1mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述第一次反应的温度为30~35℃、转速为180~250rpm、时间为1~4 h。

在本发明的一种实施方式中，所述第一次反应的温度为35℃、转速为180 rpm、时间为1 h。

在本发明的一种实施方式中，所述第二次反应的温度为30~35℃、转速为180~250rpm、时间为20~23 h。

在本发明的一种实施方式中，所述第二次反应的温度为35℃、转速为180rpm、时间为23 h。

本发明还提供了利用上述方法制备得到的蛋白酶筛选底物。

本发明还提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，所述方法为将待测样品与上述蛋白酶筛选底物混合，若混合液颜色不发生变化，则待测样品的蛋白酶酶活为0或低于检出限；若混合液由酒红色变为橘色，根据公式Y=-0.1527X+31.82计算待测样品的蛋白酶酶活；所述公式中，Y为颜色变化的响应时间，单位为s，X为酶活，单位为U/mL。

本发明还提供了上述制备蛋白酶筛选底物的方法或上述蛋白酶筛选底物或上述测定蛋白酶酶活的方法在测定蛋白酶活性或筛选不同酶活的蛋白酶中的应用。

[有益效果]

（1）本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，利用此方法检测蛋白酶的酶活时，仅需将待测样品与蛋白酶筛选底物混合后观察混合液的颜色变化和颜色变化的响应时间即可，操作简单。

（2）本发明提供了一种测定蛋白酶酶活的方法，此方法以大米蛋白为底物，因此，利用此方法可准确的测定出蛋白酶对大米蛋白的酶活，在筛选得到更多对大米蛋白酶活高的蛋白酶方面具有极高的应用前景。

附图说明

图1：金纳米颗粒的全波长扫描结果。

图2：金纳米颗粒的透射电镜观察结果。

图3：酶解前后含有蛋白酶筛选底物溶液A₁的混合液的颜色变化以及全波长扫描结果。

图4：酶解前后含有蛋白酶筛选底物溶液A₂的混合液的颜色变化以及全波长扫描结果。

图5：酶活与颜色变化的响应时间的拟合方程。

具体实施方式

下述实施例中涉及的百里香粉末购自西安瑞盈生物科技有限公司；下述实施例中涉及的氯金酸粉末、巯基己醇溶液（1 M）和蛋白酶购自Sigma公司；下述实施例中涉及的70%（v/v）乙醇溶液购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的大米蛋白购自无锡金农生物公司。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

透射电镜分析：将金纳米颗粒用蒸馏水制备成1mg/mL的金纳米溶液，并超声分散30 min；取1滴超声分散后的金纳米溶液作为样品滴于碳网上，用滤纸吸干载网上的样品液滴，待样品即干时，用2%（w/v，g/100 mL）磷钨酸水溶液负染，用滤纸吸干余液，晾干，在200kV加速电压下进行测试。

全波长扫描分析：将金纳米颗粒用蒸馏水制备成1mg/mL的金纳米溶液，并超声分散30 min；取2mL超声分散后的金纳米溶液作为样品装于比色皿中，在波长200~800 nm范围内进行全波长扫描。

将蛋白酶筛选底物溶液A₁或含有蛋白酶筛选底物溶液A₁的混合液超声分散30min；取2mL超声分散后的蛋白酶筛选底物溶液A₁作为样品装于比色皿中，在波长200~800nm范围内进行全波长扫描。

将蛋白酶筛选底物溶液A₂或含有蛋白酶筛选底物溶液A₂的混合液超声分散30min；取2mL超声分散后的蛋白酶筛选底物溶液A₂作为样品装于比色皿中，在波长200~800nm范围内进行全波长扫描。

下述实施例中涉及的制备方法如下：

金纳米颗粒的制备方法如下（金纳米颗粒也可直接购买获得）：

具体步骤如下：

（1）将50 g百里香粉末用500 mL 70%（v/v）乙醇溶液浸没后，于30℃、180 rpm振荡12 h，得到浸提液A；将浸提液A于4℃、10000 r/min离心20 min，得到上清液A和沉淀A；将沉淀A用500 mL 70%（v/v）乙醇溶液浸没后，于30℃、180 rpm振荡12 h，得到浸提液B；将浸提液B于4℃、10000 r/min离心20 min，得到上清液B；将上清液A和上清液B合并后于40℃、真空条件下浓缩30 min，得到百里香浓缩液；将百里香浓缩液冷冻干燥，得到百里香提取物；用无菌水将百里香提取物配制成浓度为100 mg/mL的百里香提取物母液；

（2）将4.11 g氯金酸粉末用100 mL无菌水溶解，得到浓度为10 mol/L的氯金酸母液；

（3）将步骤（1）制得的百里香提取物母液与步骤（2）制得的氯金酸母液混合后用无菌水将混合液进行稀释至混合液中百里香提取物终浓度为5 mg/mL、氯金酸终浓度为0.1mmol/L，得到反应液；将反应液于35℃、180 rpm、光照的条件下反应至反应液由浅黄色变为酒红色且颜色不再加深；将反应液经纤维素膜过滤后于4℃、14000 r/min离心20 min，得到沉淀B；将沉淀B冷冻干燥，得到金纳米颗粒溶液。

称量金纳米颗粒的重量（重量即产量），发现，金纳米颗粒的重量为100 mg。

将金纳米颗粒进行全波长扫描分析，发现，金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒在550nm下有最大吸收峰（金纳米颗粒的全波长扫描结果见图1）。

将金纳米颗粒进行透射电镜分析，发现，金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒呈圆或椭圆形，直径为30~40 nm（金纳米颗粒的透射电镜观察结果见图2）。

大米蛋白溶液的制备方法如下

将大米蛋白溶于Tris-HCl缓冲液（20 mM、pH 7.0）中至浓度为40 mg/mL，得到混合液；将混合液超声30 min后于4℃、4000 r/min离心20 min，去除沉淀，获得大米蛋白溶液。

实施例1：蛋白酶筛选底物的制备

具体步骤如下：

方案一：将5 mL大米蛋白溶液与1 mL金纳米颗粒溶液混合后，于35℃、180 rpm振荡反应1 h，得到反应液A₁；向反应液A₁中滴加巯基己醇溶液至反应液A中巯基己醇的终浓度为0.1 mmol/L后继续反应23 h，得到反应液B₁；将反应液B₁于4℃、10000 r/min离心10 min后取沉淀A₁；将沉淀A₁用Tris-HCl缓冲液（10 mM、pH 7.0）洗涤三次后，于4℃、10000 r/min离心10 min，取沉淀B₁，此沉淀B₁即为蛋白酶筛选底物A₁；将蛋白酶筛选底物A₁用Tris-HCl缓冲液（10 mM、pH 7.0）复溶至Tris-HCl缓冲液中蛋白酶筛选底物A₁的浓度为1 mg/mL，得到蛋白酶筛选底物溶液A₁。

方案二：将5 mL大米蛋白溶液与1 mL金纳米颗粒溶液混合后，于35℃、180 rpm振荡反应24 h，得到反应液A₂；将反应液A₂于4℃、10000 r/min离心10 min后取沉淀A₂；将沉淀A₂用Tris-HCl缓冲液（10 mM、pH 7.0）洗涤三次后，于4℃、10000 r/min离心10 min，取沉淀B₂，此沉淀B₂即为蛋白酶筛选底物A₂；将蛋白酶筛选底物A₂用Tris-HCl缓冲液（10 mM、pH7.0）复溶至Tris-HCl缓冲液中蛋白酶筛选底物A₂的浓度为1 mg/mL，得到蛋白酶筛选底物溶液A₂。

经观察，蛋白酶筛选底物溶液A₁和蛋白酶筛选底物溶液A₂均呈现深红色。将蛋白酶筛选底物溶液A₁和蛋白酶筛选底物溶液A₂进行全波长扫描分析，发现，蛋白酶筛选底物溶液A₁和蛋白酶筛选底物溶液A₂均在550 nm下有最大吸收峰。

实施例2：蛋白酶筛选底物的验证

具体步骤如下：

将300 μL蛋白酶在沸水浴中保持30 min后分别与600 μL实施例1制备得到的蛋白酶筛选底物溶液A₁和蛋白酶筛选底物溶液A₂混合，得到对照组的混合液；将300 μL不同酶活的蛋白酶分别与600 μL实施例1制备得到的蛋白酶筛选底物溶液A₁和蛋白酶筛选底物溶液A₂混合使得混合液中蛋白酶的终酶活分别为0、9、10、15、30、50、80、120、150U/mL（此处终酶活是以大米蛋白为底物，通过福林酚法测得的），得到实验组的混合液；观察各混合液的颜色变化及颜色变化的响应时间，并且，对各混合液进行全波长扫描分析以检测各混合液的最大吸收峰是否产生红移现象（分析结果见图3-4和表1）。

经观察，一定时间后，对照组的所有混合液的颜色和最大吸收峰均未发生变化；实验组的所有含有蛋白酶筛选底物溶液A₁的混合液的颜色均发生了显著的变化，由深红色变成橘黄色，且最大吸收峰由550 nm红移至650 nm处，故蛋白酶筛选底物溶液A₁可用于检测蛋白酶的酶活，故蛋白酶筛选底物溶液A₁可用于检测蛋白酶的酶活；实验组的所有含有蛋白酶筛选底物溶液A₂的混合液的颜色和最大吸收峰均未发生变化，故蛋白酶筛选底物溶液A₂不可用于检测蛋白酶的酶活。

以对照组和实验组的所有含有蛋白酶筛选底物溶液A₁的混合液的颜色变化响应时间来体现酶活的大小，随着酶活的上升，颜色变化的响应时间越短，呈负相关，故以酶活作为横坐标、颜色变化的响应时间作为纵坐标，得到拟合方程：Y=-0.1527X+31.82，拟合方程中，Y为颜色变化的响应时间，单位为s，X为酶活，单位为U/mL（拟合方程可见图5）；根据拟合方程以及对照组和实验组的所有含有蛋白酶筛选底物溶液A₁的混合液的颜色变化响应时间计算所有对照组和实验组的所有含有蛋白酶筛选底物溶液A₁的混合液的酶活（计算结果见表1），计算结果与初始酶活（即混合液中蛋白酶的终酶活）数值一致，故蛋白酶筛选底物溶液A₁可用于检测蛋白酶的酶活且准确度高。

另外，由表1可知，使用蛋白酶筛选底物溶液A₁检测蛋白酶酶活的最低限度为10U/mL。

表1蛋白酶筛选底物溶液A₁和A₂的各项检测结果

其中，“ND”是指未检测到颜色变化的响应时间。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述方法为将含有大米蛋白和金纳米颗粒的缓冲液进行第一次孵育，得到反应液A；在反应液A中添加巯基己醇进行第二次孵育，得到反应液B；将反应液B进行分离，离心取沉淀得到蛋白酶筛选底物；

所述缓冲液中，大米蛋白的初始浓度为40 mg/mL；

所述缓冲液中，金纳米颗粒的初始浓度为0.1 mmol/mL；

所述巯基己醇的终浓度为0.1 mmol/L；

所述第一次孵育的温度为35℃、转速为180 rpm、时间为1 h；所述第二次孵育的温度为35℃、转速为180 rpm、时间为23 h；

所述缓冲液的浓度为5~20 mmol/L、pH为7~8。

2.如权利要求1所述的一种制备蛋白酶筛选底物的方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液或Tris缓冲液。

3.权利要求1或2所述的制备蛋白酶筛选底物的方法在测定蛋白酶活性或筛选不同酶活的蛋白酶中的应用。