CN111172224A - 一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，以蛋白含量43～45％的非转基因豆粕为配料，利用米曲霉发酵制取蛋白含量大于52％的大豆肽干粉，且其中小肽含量大于80％。本发明的优点在于：突破了技术瓶颈，选用低蛋白含量的非转基因豆粕为原料，成本大幅缩减，然后选取米曲霉菌株进行接种发酵，米曲霉菌株通过大量分离复壮，选取蛋白酶活力≥1500U/g菌株。从而制备出高质量大豆肽，实现了产业化应用和生产。

Description

一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法。

背景技术

饼粕在生产应用中的诸多优势，使得其在代替鱼粉制造发酵蛋白饲料方面的应用开始受到了越来越多的关注，虽然饼粕的发酵生产发展迅猛，但毕竟还处于发展的初期，还存在许多问题，主要包括：(1)粗纤维含量高达14％以上，蛋白质含量20％-40％不等，有效能值不到豆粕的70％，由于残留皮壳，饼粕颜色发黑，严重影响其商品价值；(2)饼粕的蛋白质(氨基酸)消化利用率低，只有30％-60％，均明显低于鱼粉及豆粕等优质蛋白质饲料资源；③低质饼粕中有毒有害物质含量高。不仅严重影响畜禽生产性能，还会损害动物器官，影响动物的生长发育，甚至导致动物死亡。

1996年以后，我国已成为大豆粕净进口国，并且全球豆粕市场需求以两位数的增长。据联合国粮农组织(FAO)统计，在2O世纪末，全球的纯蛋白质短缺量约为2500万吨，折合成蛋白饲料(粗蛋白含量为40％)约为6300万吨。全球畜牧业已经过10年的快速发展，其蛋白饲料的缺口越来越大。

另外，当前我国可用饲料资源并不充裕，如果能通过发酵技术将此类原料做成发酵饲料，改善粗纤维的使用价值，不但有利于精确的提高粗纤维的正面影响，减低其负面影响，更有利于正确及合理的开发高纤维饲料原料。而且随着我国养殖业的规模发展，植物提取物、纤维素及益生菌即将也必将成为替代抗生素的主要物质。

大豆生物肽来源于大豆蛋白质的酶解产物，是脱皮豆粕经米曲霉制曲发酵作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解物。具有以下产品优势：

(1)小分子肽的营养优于蛋白质：

从营养上讲，蛋白质只有分解成肽才能被吸收，而小分子肽则可以直接被吸收。过量摄入蛋白质会对动物体内产生一定的副作用，因为蛋白质在动物体内的分解产物较多，其中氨、酮酸及尿素等会对动物体产生副作用，不仅增加肝脏的负担，还容易引起消化不良，影响肾脏功能。而小分子复合肽摄入后不但不会引起营养过剩，而且还可以调节动物体的营养平衡。

(2)肽比氨基酸更利于吸收且作用更强大：

1)在动物体中，吸收氨基酸的时候是一个一个被吸收的，而且相同构造的氨基酸之间还存在竞争关系，而在吸收肽的时候是数个被一起吸收，并且相同的肽之间没有竞争关系。肽是由两个或两个以上的氨基酸构成的，而且动物体对肽的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和、无竞争性和抑制性等特点。所以说动物体吸收肽比吸收氨基酸更高效，肽通过肠道吸收后，直接进入血液，将自身能量输送到动物体各个部位。

2)氨基酸只有20种，功效可数，而肽以氨基酸为底物，可合成上百上千种，肽属于降解的小分子蛋白质，含氨基酸基团，属于原料类产品。

肽是介于氨基酸与蛋白质之间一种生化物质,它比蛋白质分子量小,比氨基酸分子量大,是一个蛋白质的片段。也就是说,由两个以上以至多达几十个氨基酸肽键相连聚合成肽,再由多个肽以侧链相接聚合成蛋白质。一个氨基酸不能称为肽,必须是两个以上的氨基酸以肽链相连的化合物才能称为肽；许多氨基酸混合在一起也不能称为肽；氨基酸之间必须以肽键相连,形成“氨基酸链”、“氨基酸串”,串起来的氨基酸才能称为肽。

近些年来，开始采用米曲霉发酵豆粕，去除多种抗营养因子，同时产生微生物蛋白质，丰富并平衡豆粕中的蛋白质营养水平，最终改善豆粕的营养品质，提高饲料效率。发酵豆粕含益生菌、酶制剂、肽等功能成分，同时提高豆粕生物活性小肽蛋白含量，可以通过肠道粘膜直接吸收，吸收速率快、不易饱和，小肽吸收耗能低，节省能量，提高蛋白利用率，还能有效提高动物机体的免疫功能，减少抗生素的用量或替代部分抗生素，具有营养和提高免疫力的双重作用。

豆粕通过米曲霉发酵降解，产生具有特殊功能的营养小肽。小肽吸收具有吸收快、能耗低、效率高、载体不易饱和等优点。大豆肽还能赋予产品特殊生理活性，如促生长、调节免疫、抗菌、抗病毒、催乳、抗氧化、刺激食欲、促进矿物质吸收和抗肿瘤等；而且，豆粕在发酵后由于可溶性肽类和游离氨基酸以及酸性物质增加，使得发酵产物气味醇香，动物适口性提高，增加采食量。大豆肽的开发开创了动物营养的新纪元，丰富了大豆制品的种类，增加了大豆产品的附加值。肽的重要特性之一在于可提高动物对日粮氮利用率的巨大潜力，减少畜禽含氮物质的排放，这对于节约蛋白质饲料、减轻环境污染具有重要的经济和社会意义。

但是，目前米曲霉发酵豆粕制取大豆肽的技术存在较大的发展瓶颈，大豆肽衡量产品好坏的重要指标为蛋白含量以及其小肽含量，蛋白含量大于50％并且小肽含量大于80％的被称为高质量大豆肽，但是目前想实现该技术水平必须选用高蛋白含量(大于45％)的豆粕作为配料，但是高蛋白含量豆粕采购成本昂贵，不具有经济效益，很难实现产业化应用和生产。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明提供一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，以蛋白含量43～45％的非转基因豆粕为原料，选取性能优化选择后的米曲霉菌株进行接种发酵，制备出高质量大豆肽，从而实现产业化应用和生产。

本发明所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：以蛋白含量43～45％的非转基因豆粕为原料，利用米曲霉发酵制取蛋白含量大于52％的大豆肽干粉，且其中小肽含量大于80％。

其中，优选方案如下：

米曲霉菌株通过性能优化选择，不断分离筛选单菌落，选取对蛋白分解能力强的菌落，蛋白酶活力≥1500U/g，若没有达到此指标，需要不停地去重复实验，直到选取到为止。本发明所选取菌株实际经过半年，进行200多次实验，1000余株中筛选到。然后再接种到斜面试管，培养使用。本菌株是曲霉属(Aspergillus)中的米曲霉，分离源为春丰本酿牌酱油曲精。

本发明所述的的制备方法，具体步骤如下：

(1)菌种活化：将米曲霉菌株接种在斜面培养基上培养；

(2)三角瓶菌种培养：将活化好的菌种加入到种子培养基中培养得到三角瓶菌种；

(3)豆粕发酵培养：三角瓶菌种与处理后的非转基因豆粕接种培养，发酵完成后即成成曲，成曲在搅拌条件下再经过液态保温水解；

(4)后处理：将步骤(3)得到的物料烘干制粉，即得成品。

所述的步骤(1)中斜面培养基是豆汁斜面培养基，培养温度是30℃，培养时间是72小时。

所述的步骤(2)中活化好的菌种和种子培养基的比例是1：10-15，培养温度是28-30℃，培养时间是75小时。

所述的步骤(2)中种子培养基的制备方法如下：将麸皮、豆饼粉和玉米粉按质量比7:2:1的比例混匀，添加40-45℃温水搅拌均匀，然后用蒸汽灭菌锅125℃、0.15Mpa条件下下灭菌30min，降温至36℃，制成种子培养基。

所述的步骤(3)中三角瓶菌种中的米曲霉与处理后的非转基因豆粕的质量比为1:1000。

所述的步骤(3)中非转基因豆粕的处理过程如下：将水与非转基因豆粕按质量比0.85:1的比例混匀搅拌，然后在125℃灭菌30min，最后冷却降温至36℃。

所述的步骤(3)中发酵培养的料温是32℃，发酵培养的时间是28小时，水解时成曲与水的质量比为1:3，水解的温度是40～45℃，水解的时间是26～30小时。

所述的步骤(4)中烘干的温度是113℃，制粉的要求是过60目筛网且80％以上过筛率。

本发明的优点在于：突破了技术瓶颈，选用低蛋白含量的非转基因豆粕为原料，成本大幅缩减，然后选取米曲霉菌株进行接种发酵，米曲霉菌株通过性能优化选择，不断分离筛选单菌落，选取对蛋白分解能力强的菌落，蛋白酶活力≥1500U/g。从而制备出高质量大豆肽，蛋白含量大于52％且其中小肽含量大于80％，实现了产业化应用和生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

米曲霉菌株的筛选过程：

1、仪器：

高压蒸汽灭菌锅、烘干箱、培养箱、电子天平、搪瓷杯、烧杯、分装漏斗、试管、吸管(10ml)、吸尔球、玻璃棒、棉花、线绳、报纸、培养皿、三角瓶(100ml)、玻璃珠、移液器(1ml)、吸头、药勺、接种针、酒精灯。

2、药品：

可溶性淀粉，磷酸二氢钾，硫酸镁，琼脂，酪蛋白，氢氧化钠、甲酚红、米曲霉。

分离用平板培养基制备：酪蛋白1.25g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.15g，0.05M氢氧化钠60ml，琼脂7.5g，甲酚红指示剂30ml，水500ml，PH自然。

3、试剂配制：

(1)0.05MNaOH配制：称取NaOH，50g溶于50ml无CO₂的水中，搅拌均匀，注入密闭的容器中，放置溶液至清亮，按表1规定，取上层清液用无CO₂的水稀释至500ml摇匀。

表1：NaOH的配制

NaOH标准溶液的浓度(moL/L)	NaOH的体积(mL)
		1	56
0.5	28
		0.1	5.6
0.05	2.8

NaOH的标定：精确称取0.6g在105-110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加80ml新煮沸过的冷水，加2滴酚酞指示液，用NaOH溶液滴定至浅红色0.5min不褪色，同时做空白实验，结果见表2。

表2：NaOH的标定

NaOH标准溶液的浓度(moL/L)	邻苯二甲酸氢钾质量(mg)	无CO<sub>2</sub>水的体积(mL)
			1	7.5	80
0.5	3.6	80
			0.1	0.75	80
0.05	0.375	80

计算：

公式：m×1000/(V1-V)M，

m-邻苯二甲酸氢钾质量的准确数值g，V1-NaOH的体积数ml，V-空白实验NaOH的体积数ml，M-邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量g/moL。

(2)甲酚红指示剂的配制：称取甲酚红0.04g，加入PH6.88缓冲溶液100ml定容。

(3)豆汁斜面培养基配制：

称酪蛋白1.25g放入搪瓷杯中，加入0.05M氢氧化钠60ml，放入电炉上加热溶解，再加入磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.15g，琼脂7.5g，甲酚红指示剂30ml，水500ml，加热溶解，用吸管(10ml)吸培养基10ml分装试管中，塞好棉塞，用纸包好灭菌，备用。

豆汁斜面培养基制作：试剂-溶解-校正PH值-分装-加棉塞、包扎-灭菌(0.1Mpa保温30分钟)-备用。

4、操作方法：

(1)准备工作：

将使用仪器培养皿、三角瓶、吸头(若干)、药勺、培养基、10ml试管等，用高压灭菌锅0.1Mpa保压30分钟，灭菌备用。

三角瓶：装入100ml水加入玻璃珠(若干)。

10ml试管：装入9ml水，做好编号，塞好棉塞，8支，备用。

培养皿5个为一组，用报纸包好，6包30个。

1ml吸头，每个单独用报纸包好(若干)。

(2)菌样稀释分离：

将待分离的菌样在无菌条件下，称取0.05g酱油曲精放入三角瓶中，瓶内菌液约含孢子50-100万个/ml，充分振摇30分钟左右，使孢子个个分离混匀，制成8份菌悬液，静置5min，备用。

在接种箱内按无菌操作要求，用移液器吸取1ml三角瓶内菌液放入1号管，再从1号管吸1ml放入2号管，以此类推，直至稀释至7号或8号试管内，要求每往试管吸一次换一次吸头，每毫升稀释液中约含孢子数5-10个之间。

取6号7号8号试管内菌液0.5毫升，放入培养皿中，每个稀释度做10个平板，将培养基(温度50℃)倒入培养皿中与菌液充分混匀，放平、冷却。

大约20分钟左右待培养皿内培养基凝固后取出，倒置放入培养箱内(30℃)，培养72h后，即可在平皿培养基上观察到以每个孢子为同心圆而生长的菌落，并在菌落周围有一较大的透明圈。根据菌落直径与透明圈直径的比值和菌落的大小来筛选优良的菌株，选取菌落四组，标记1号、2号、3号、4号、5号、6号。

为了增加透明圈的明显度，加入了甲酚红指示剂并用PH6.88缓冲溶液进行溶解，不影响培养基的PH值。

影响透明圈生长主要有两个因素：

NaOH溶液配制的时间，一般保质期在一个月左右。因为：氢氧化钠易与空气中的二氧化碳发生反应生成碳酸钠和水。

2NaOH+CO₂＝Na₂CO₃+H₂O

酪蛋白溶解要彻底，溶解后溶液颜色呈酒红色。

所述平板上，反复进行多步纯化，得到多株米曲霉菌株。

注意事项：

本操作一定要在灭过菌的无菌接种箱内进行，并严格按无菌操作要求进行。使用的培养皿规格及加入的培养基的数量一定要相同，以便于对不同培养皿中的菌落进行比较。加入培养基的温度不宜过热或过冷，一般控制在45-50℃之间(用手触摸不烫手)否则会使孢子烫死或出现培养基表面不平现象。每稀释一次试管，换一次吸头。

(3)复筛三角瓶产酶培养基：将麸皮、豆饼粉和玉米粉按质量比7：2：1的比例混匀，添加40-45℃温水搅拌均匀，然后用蒸汽灭菌锅125℃、0.15Mpa条件下下灭菌30min，降温至36℃，制成种子培养基。将活化好的1号到6号菌种分别加入到种子培养基中培养得到种子液，活化好的菌种和种子培养基的比例是1：10-15，培养温度是28-30℃，培养时间是75小时。

分析所产蛋白活力的高低，见表3。

表3：蛋白酶酶的活力分析

选取3号菌株作为米曲霉发酵制取大豆肽工艺的使用菌株。

选用3号菌株发酵制取大豆肽的工艺过程：

1、发酵：

配料选用蛋白含量43％的非转基因豆粕；

非转基因豆粕处理：将水与非转基因豆粕按质量比0.85:1的比例混匀搅拌，然后在125℃灭菌30min，最后冷却降温至36℃。

种子液与处理后的非转基因豆粕接种培养，破碎后静置培养即成成曲，成曲在搅拌条件下再经过液态保温水解；其中，种子液中的米曲霉与处理后的配料的质量比为1:1000，发酵培养的料温是32℃，静置培养的时间是28小时，水解时成曲与水的质量比为1:3，水解的温度是40～45℃，水解的时间是26-30小时。

2、后处理：

水解后得到的物料在113℃条件下烘干，然后过60目筛网且80％以上过筛率，即得成品。

3、测定：

最终产成品指标：60目筛网过筛80％以上过筛率，水分<10％，蛋白含量≥52％，小肽含量大于80％，酸溶蛋白≥40％，氨基酸态氮>4％，灰分<10％。

Claims (10)

1.一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：以蛋白含量43～45％的非转基因豆粕为原料，利用米曲霉发酵制取蛋白含量大于52％的大豆肽干粉，且其中小肽含量大于80％。

2.根据权利要求1所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的米曲霉的蛋白酶活力≥1500U/g。

3.根据权利要求1所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)菌种活化：将米曲霉菌株接种在斜面培养基上培养；

(2)种子液的培养：将活化好的菌种加入到种子培养基中培养得到三角瓶菌种；

(3)发酵：三角瓶菌种与处理后的非转基因豆粕接种培养，发酵培养完成后即成成曲，成曲在搅拌条件下再经过液态保温水解；

(4)后处理：将步骤(3)得到的物料烘干制粉，即得成品。

4.根据权利要求3所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中斜面培养基是豆汁斜面培养基，培养温度是30℃，培养时间是72小时。

5.根据权利要求3所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中活化好的菌种和种子培养基的比例是1：10-15，培养温度是28-30℃，培养时间是75小时。

6.根据权利要求3所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中种子培养基的制备方法如下：将麸皮、豆饼粉和玉米粉按质量比7:2:1的比例混匀，添加40-45℃温水搅拌均匀，然后用蒸汽灭菌锅125℃、0.15Mpa条件下下灭菌30min，降温至36℃，制成种子培养基。

7.根据权利要求3所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中三角瓶菌种中的米曲霉与处理后的非转基因豆粕的质量比为1:1000。

8.根据权利要求3或7所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中非转基因豆粕的处理过程如下：将水与非转基因豆粕按质量比0.85:1的比例混匀搅拌，然后在125℃灭菌30min，最后冷却降温至36℃。

9.根据权利要求3所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中发酵培养的料温是32℃，发酵培养的时间是28小时，水解时成曲与水的质量比为1:3，水解的温度是40～45℃，水解的时间是26～30小时。

10.根据权利要求3所述的一种利用米曲霉菌株发酵制取大豆肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)中烘干的温度是113℃，制粉的要求是过60目筛网且80％以上过筛率。