CN103555592A - 米曲霉菌株及其孢子粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物制品领域，具体涉及一种米曲霉菌株及其孢子粉的制备方法。该菌株是曲霉属(Aspergillus)中的米曲霉SDKYSW-1#，其保藏号为CGMCC No.8195。米曲霉菌株孢子粉的制备方法是菌种活化、种子液的培养、发酵、后处理即得。本发明生产工艺成熟，技术先进，尤其在菌种筛选和制剂化方面具有先进性，而生产所需要原料价廉易得，产品附加值很高，而且生态和社会效益显著，具备了效益高、成本低、不污染环境、对人畜无害的微生物肥料显著特征。
Description
技术领域
本发明属于微生物制品领域，具体涉及一种米曲霉菌株及其孢子粉的制备方法。
背景技术
人类生存与农业可持续性发展己成为各国农业发展的主题。现代农业(增施水肥、改良品种、集约化栽培、化学化、机械化)的高投入高产出的掠夺式运作方式已经说明是极其有害的。实践证明，将传统农业与现代化农业紧密结合才有利于人类生存和发展。自80年代美国人提出根际促生菌以来，某些根际微生物对作物的促进作用是可以肯定的，具体作用主要有4个方面：①影响作物根细胞的渗透性；②影响根际代谢活动；③微生物对根分泌物的吸收作用；④改变营养物质对植物的有效性。
无论是微生物间的相互作用，还是微生物对植物的作用都是通过各种酶类及代谢产物作为介质而起作用的。虽然各国科学工作者对根际促生菌的生物学和生态学已做了大量研究，但对促生菌通过何种介质对作物及病原菌发生作用，尚无确切研究。因此，深入研究根际促生菌代谢产物对作物的生物活性及其分子结构特点有着十分重要的意义。一方面可以明确根际促生菌的作用机制，另一方面对仿生合成及微生物基因工程改造都有着十分重要的意义。特别是正向调控菌剂的研制成功，在理论与实际上都将有重大突破。
发明内容
本发明的目的是提供一种米曲霉菌株，该菌种能够促进作物的生长发育；本发明同时提供了米曲霉菌株孢子粉的制备方法，简单易行，适合工业化生产。
本发明所述的米曲霉菌株是曲霉属(Aspergillus)中的米曲霉SDKYSW-1#，米曲霉菌株已于2013年9月16日，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)，保藏号为CGMCC No.8195。
米曲霉菌株是从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤中采用土壤稀释分离法分离获得。
本发明所述的米曲霉菌株的筛选方法，包括以下步骤：
一、土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
二、米曲霉的分离：
1、仪器：
高压蒸汽灭菌锅、烘干箱、培养箱、电子天平、搪瓷杯、烧杯、分装漏斗、试管、吸管(10ml)、吸尔球、玻璃棒、棉花、线绳、报纸、培养皿、三角瓶（100ml）、玻璃珠、移液器（1ml）、吸头、药勺、接种针、酒精灯。
2、药品：
可溶性淀粉，磷酸二氢钾，硫酸镁，琼脂，酪蛋白，氢氧化钠、甲酚红、米曲霉。
分离用平板培养基制备：酪蛋白1.25g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.15g，0.05M氢氧化钠60ml，琼脂7.5g，甲酚红指示剂30ml，水500ml，PH自然。
3、试剂配制：
（1）0.05MNaOH配制：称取NaOH，50g溶于50ml无CO2的水中，搅拌均匀，注入密闭的容器中，放置溶液至清亮，按表1规定，取上层清液用无CO2的水稀释至500ml摇匀。
表1NaOH的配制
| NaOH标准溶液的浓度（moL/L） | NaOH的体积（mL） |
| 1 | 56 |
| 0.5 | 28 |
| 0.1 | 5.6 |
| 0.05 | 2.8 |
NaOH的标定：精确称取0.6g在105-110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加80ml新煮沸过的冷水，加2滴酚酞指示液，用NaOH溶液滴定至浅红色0.5min不褪色，同时做空白实验，结果见表2。
表2NaOH的标定
| NaOH标准溶液的浓度（moL/L） | 邻苯二甲酸氢钾质量（mg） | 无CO2水的体积（mL） |
| 1 | 7.5 | 80 |
| 0.5 | 3.6 | 80 |
| 0.1 | 0.75 | 80 |
| 0.05 | 0.375 | 80 |
计算：
公式：m×1000/(V1-V)M，
m-邻苯二甲酸氢钾质量的准确数值g，
V1-NaOH的体积数ml，
V-空白实验NaOH的体积数ml，
M-邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量g/moL。
（2）甲酚红指示剂的配制：称取甲酚红0.04g，加入PH6.88缓冲溶液100ml定容。
（3）培养基配制：
称酪蛋白1.25g放入搪瓷杯中，加入0.05M氢氧化钠60ml，放入电炉上加热溶解，再加入磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.15g，琼脂7.5g，甲酚红指示剂30ml，水500ml，加热溶解，用吸管(10ml)吸培养基10ml分装试管中，塞好棉塞，用纸包好灭菌，备用。
培养基制作：试剂→溶解→校正PH值→分装→加棉塞、包扎→灭菌（0.1P保温30分钟）→备用。
4、操作方法：
（1）准备工作：
将使用仪器培养皿、三角瓶、吸头（若干）、药勺、培养基、10ml试管等，用高压灭菌锅0.1p保压30分钟，灭菌备用。
三角瓶：装入100ml水加入玻璃珠（若干）。
10ml试管：装入9ml水，做好编号，塞好棉塞，8支，备用。
培养皿5个为一组，用报纸包好，6包30个。
1ml吸头，每个单独用报纸包好（若干）。
（2）菌样稀释分离：
将待分离的菌样在无菌条件下，称取1g土样放入三角瓶中，瓶内菌液约含孢子50-100万个/ml，充分振摇5分钟左右，使孢子个个分离混匀，制成8份土壤悬浮液，静置5min，备用。
在接种箱内按无菌操作要求，用移液器吸取1ml三角瓶内菌液放入1号管，再从1号管吸1ml放入2号管，以此类推，直至稀释至7号或8号试管内，要求每往试管吸一次换一次吸头，每毫升稀释液中约含孢子数5-10个之间。
取6号7号8号试管内菌液0.5毫升，放入培养皿中，每个稀释度做10个平板，将培养基（温度50℃）倒入培养皿中与菌液充分混匀，放平、冷却。
大约20分钟左右待培养皿内培养基凝固后取出，倒置放入培养箱内（30℃），培养4天后，即可在平皿培养基上观察到以每个孢子为同心圆而生长的菌落，并在菌落周围有一较大的透明圈。可根据菌落直径与透明圈直径的比值和菌落的大小来筛选优良的菌株。为了增加透明圈的明显度，加入了甲酚红指示剂并用PH6.88缓冲溶液进行溶解，不影响培养基的PH值。
影响透明圈生长主要有两个因素：
NaOH溶液配制的时间，一般保质期在一个月左右。因为：氢氧化钠易与空气中的二氧 化碳发生反应生成碳酸钠和水。
2NaOH+CO2=Na2CO3+H2O
酪蛋白溶解要彻底，溶解后溶液颜色呈酒红色。
所述平板上，反复进行多步纯化，得到多株米曲霉菌株。
注意事项：
本操作一定要在灭过菌的无菌接种箱内进行，并严格按无菌操作要求进行。
使用的培养皿规格及加入的培养基的数量一定要相同，以便于对不同培养皿中的菌落进行比较。
加入培养基的温度不宜过热或过冷，一般控制在45-50℃之间（用手触摸不烫手）否则会使孢子烫死或出现培养基表面不平现象。
每稀释一次试管，换一次吸头。
（3）复筛三角瓶产酶培养基：将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为53-55wt.%时，停止加入无机盐溶液；所述干料的质量百分比组成为：麸皮50%、豆饼粉30%和花生秸秆粉20%；所述无机盐溶液是每升水中含2.0gKH2PO4、1.4g(NH4)2SO4、0.3g尿素、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4·7H2O、1.56mg MnSO4·H2O、1.4mg ZnSO4·7H2O、2.0mgCoCl2。装入三角瓶，500ml三角瓶装入水分85%的湿料40g，灭菌，接入上述分离的米曲霉菌株，30℃培养三天后低温干燥，分析所产生的酶系，见表3。
表3各种酶的活力分析
| 分析方法 | 计算活力 | |
| 蛋白酶活力 | GB | 1382u/g |
| 糖化酶活力 | GB | 43.5u/g |
| 纤维素酶活力 | GB | 6352u/g |
| 木聚糖酶活力 | GB | 2419.2u/g |
| 甘露聚糖酶活力 | GB | 913.9u/g |
| 果胶酶活力 | GB | 1858.7u/g |
综合分析选取一米曲霉菌株，命名为SDKYSW-1#。
菌种特点：点种到PDA培养基上，6天直径达5-6cm，质地疏松，初短绒毛样白色、中间黄色逐步扩大，后全部变为黄褐色至土褐色，背面无色，分生孢子梗2mm，直径22-28μm分生孢子头放射状，顶囊近球形，直径50-70μm，分生小梗着生于顶囊上长13-15μm，直径4-6μm，分生孢子幼时卵圆形，老后变为球形或近球形，一般4.5-7.5μm。
本发明所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，步骤如下：
（1）菌种活化：将米曲霉菌株接种在斜面培养基上培养，
（2）种子液的培养：将活化好的菌种加入到种子培养基中培养得到种子液，
（3）发酵：种子液与灭菌后的配料搅拌，保温发酵，调温发孢；
（4）后处理：将步骤（3）得到的物料低温干燥得到半成品，加入防腐防紫外线物质后干燥，粉碎至标准筛目，孢子收集，复检、分装即得。
步骤（1）中所述的斜面培养基是豆汁斜面培养基，培养温度是28-30℃，培养时间是70-74小时。
步骤（1）中所述的豆汁培养基的基本配方：可溶性淀粉2%、KH2PO40.1%、MgSO40.03%、（NH4）2SO40.05%、琼脂2%、糖1%、豆汁500ml。
步骤（2）中所述的活化好的菌种和种子培养基的体积比是1：8-12。
步骤（2）中所述的培养温度是33-36℃，培养时间是45-48小时。
步骤（2）中培养时中间每隔1小时输送氧气一次。
步骤（2）中所述的种子培养基的制备方法如下：
将麦胚、麸皮按质量比1：9-11的比例混匀，用45-50℃温水反复冲洗，将得到的清洗液在125-130℃、0.15-0.2Mpa下灭菌40-50min，降温至33-36℃，制成种子培养基。
步骤（3）中所述的种子液和配料的质量比是1:10-12。
步骤（3）中所述的保温发酵温度是32-36℃，保温发酵时间是12-15h；调温发孢温度是32-38℃，调温发孢时间是48-50h。
步骤（3）中所述的配料的制备方法如下：
将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为53-55wt.%时，停止加入无机盐溶液；
所述干料的质量百分比组成为：麸皮40-50%、豆饼粉30-40%和花生秸秆粉20-30%；
所述无机盐溶液是每升水中含2.0gKH2PO4、1.4g(NH4)2SO4、0.3g尿素、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4·7H2O、1.56mg MnSO4·H2O、1.4mg ZnSO4·7H2O、2.0mgCoCl2。
步骤（3）中所得的发酵成品可直接使用。
步骤（4）中所述的防腐防紫外线物质是氧化锌，防腐防紫外线物质和半成品的质量比是1-1.2:10000。
步骤（4）中所述的低温干燥是春秋冬季干燥温度是32-34℃，干燥时间是24-36h；夏天干燥温度是34-38℃，干燥时间是36-48h。
步骤（4）中所述的半成品的水分≤10%。
步骤（4）中所述的标准筛目是120筛目。
步骤（4）中的复检是按照Q／SHN--2009检测产品质量。
本发明中菌株筛选取样于土壤和腐烂的植物残体，但以病原菌危害严重的土壤和植物残体筛选概率高，以含多种指示成分培养基为初筛培养基，选取活性高低取舍菌株；复筛则考虑菌株的特性并在一定范围内改变发酵条件，主要不影响其生长速率，进一步提高胞壁酶类活性为主要条件，所筛选的菌株经进一步生物活性测定，确定菌株的性能。
本发明所选用的一株新的米曲霉菌，也是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等。在酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，淀粉水解成糊精、寡糖、单糖，而且可以使辅料中粗纤维等抗营养物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，可广泛应用于酿造、食品、饲料添加剂等行业。
本发明所筛选的米曲霉菌（孢子含量200亿／克，一年存活率≥85％)，已经保藏于国家菌种保藏中心，而且根据大量实验，制成保存和使用都很方便的新剂型，200亿／克水分散粒剂（pH值：7.3-7.8，水分含量：6-8％）；从棉花增产效果看，米曲霉菌对棉花具有明显的促生增产效果，一次施药肥增产率为13.50～20.1%。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明具备了效益高、成本低、不污染环境、对人畜无害的微生物肥料显著特征。本发明生产工艺成熟，技术先进，尤其在菌种筛选和制剂化方面具有先进性，而生产所需要原料价廉易得，产品附加值很高，而且生态和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
（1）菌种活化：用接种环轻轻沾去少量菌落孢子接入到豆汁斜面培养基中培养，温度保持在30℃，培养72小时；
（2）种子液的培养：将活化好的菌种1kg加入1000kg种子培养基中，36℃恒温培养48小时，中间每隔1小时输送氧气一次，制成种子液；
（3）发酵：种子液200kg与灭菌后的配料2000kg搅拌接种，保温发酵，调温发孢，保温发酵温度是32℃，保温发酵时间是12h；调温发孢温度是38℃，调温发孢时间是48h；
（4）后处理：将步骤（3）得到的物料，低温干燥得到半成品，1kg半成品加入氧化锌0.1g后干燥，粉碎至120筛目，孢子收集，复检、分装即得。
步骤（3）中所述配料的制备方法如下：
将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为53wt.%时，停止加入无机盐溶液；
所述干料是麸皮1000kg、豆饼粉600kg、和花生秸秆粉400kg；
所述无机盐溶液是每升水中含2.0g KH2PO4、1.4g(NH4)2SO4、0.3g尿素、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4·7H2O、1.56mg MnSO4·H2O、1.4mg ZnSO4·7H2O、2.0mgCoCl2。
成品中各种酶活力分析见表4。
表4成品中各种酶活力分析
| 分析方法 | 计算活力 | |
| 蛋白酶活力 | GB | 1282u/g |
| 糖化酶活力 | GB | 42u/g |
| 纤维素酶活力 | GB | 4682u/g |
| 木聚糖酶活力 | GB | 2339.5u/g |
| 甘露聚糖酶活力 | GB | 732.6u/g |
| 果胶酶活力 | GB | 1484.6u/g |
总孢子数：280亿 有效活菌数：130亿
实施例2
（1）菌种活化：用接种环轻轻沾去少量菌落孢子接入到豆汁斜面培养基中培养，温度保持在28℃，培养70小时；
（2）种子液的培养：将活化好的菌种1kg加入800kg种子培养基中，33℃恒温培养45小时，中间每隔1小时输送氧气一次，制成种子液；
（3）发酵：种子液200kg与灭菌后的配料2400kg搅拌接种，保温发酵，调温发孢，保温发酵温度是36℃，保温发酵时间是15h；调温发孢温度是32℃，调温发孢时间是50h；
（4）后处理：将步骤（3）得到的物料，低温干燥得到半成品，1kg半成品加入氧化锌0.12g后干燥，粉碎至120筛目，孢子收集，复检、分装即得。
步骤（3）中所述配料的制备方法如下：
将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为55wt.%时，停止加入无机盐溶液；
所述干料是麸皮960kg、豆饼粉960kg、和花生秸秆粉480kg；
所述无机盐溶液是每升水中含2.0g KH2PO4、1.4g(NH4)2SO4、0.3g尿素、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4·7H2O、1.56mg MnSO4·H2O、1.4mg ZnSO4·7H2O、2.0mgCoCl2。
成品中各种酶活力分析见表5。
表5成品中各种酶活力分析
| 分析方法 | 计算活力 | |
| 蛋白酶活力 | GB | 1056u/g |
| 糖化酶活力 | GB | 35u/g |
| 纤维素酶活力 | GB | 4482u/g |
| 木聚糖酶活力 | GB | 2024u/g |
| 甘露聚糖酶活力 | GB | 684.6u/g |
| 果胶酶活力 | GB | 1256.6u/g |
总孢子数：230亿 有效活菌数：95亿
实施例3
（1）菌种活化：用接种环轻轻沾去少量菌落孢子接入到豆汁斜面培养基中培养，温度保持在29℃，培养74小时；
（2）种子液的培养：将活化好的菌种1kg加入1200kg种子培养基中，35℃恒温培养46小时，中间每隔1小时输送氧气一次，制成种子液；
（3）发酵：种子液200kg与灭菌后的配料2200kg搅拌接种，保温发酵，调温发孢，保温发酵温度是35℃，保温发酵时间是14h；调温发孢温度是35℃，调温发孢时间是49h；
（4）后处理：将步骤（3）得到的物料，低温干燥得到半成品，1kg半成品加入氧化锌0.11g后干燥，粉碎至120筛目，孢子收集，复检、分装即得。
步骤（3）中所述配料的制备方法如下：
将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为54wt.%时，停止加入无机盐溶液；
所述干料是麸皮880kg、豆饼粉660kg、和花生秸秆粉660kg。
所述无机盐溶液是每升水中含2.0g KH2PO4、1.4g(NH4)2SO4、0.3g尿素、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4·7H2O、1.56mg MnSO4·H2O、1.4mg ZnSO4·7H2O、2.0mgCoCl2。
成品中各种酶活力分析见表6。
表6成品中各种酶活力分析
| 分析方法 | 计算活力 | |
| 蛋白酶活力 | GB | 1124u/g |
| 糖化酶活力 | GB | 38u/g |
| 纤维素酶活力 | GB | 4026u/g |
| 木聚糖酶活力 | GB | 2149u/g |
[0127]
| 甘露聚糖酶活力 | GB | 701.8u/g |
| 果胶酶活力 | GB | 1182.3u/g |
总孢子数：240亿 有效活菌数：110亿。
Claims (10)
1.一种米曲霉菌株，其特征在于：该菌株是曲霉属(Aspergillus)中的米曲霉SDKYSW-1#，其保藏号为CGMCC No.8195。
2.一种权利要求1所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）菌种活化：将米曲霉菌株接种在斜面培养基上培养，
（2）种子液的培养：将活化好的菌种加入到种子培养基中培养得到种子液，
（3）发酵：种子液与灭菌后的配料搅拌，保温发酵，调温发孢；
（4）后处理：将步骤（3）得到的物料低温干燥得到半成品，加入防腐防紫外线物质后干燥，粉碎至标准筛目，孢子收集，复检、分装即得。
3.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的斜面培养基是豆汁斜面培养基，培养温度是28-30℃，培养时间是70-74小时。
4.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的活化好的菌种和种子培养基的体积比是1：8-12。
5.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的培养温度是33-36℃，培养时间是45-48小时。
6.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的种子培养基的制备方法如下：
将麦胚、麸皮按质量比1：9-11的比例混匀，用45-50℃温水反复冲洗，将得到的清洗液在125-130℃、0.15-0.2Mpa下灭菌40-50min，降温至33-36℃，制成种子培养基。
7.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的种子液和配料的质量比是1:10-12。
8.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的保温发酵温度是32-36℃，保温发酵时间是12-15h；调温发孢温度是32-38℃，调温发孢时间是48-50h。
9.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的配料的制备方法如下：
将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为53-55wt.%时，停止加入无机盐溶液；
所述干料的质量百分比组成为：麸皮40-50%、豆饼粉30-40%和花生秸秆粉20-30%；
所述无机盐溶液是每升水中含2.0gKH2PO4、1.4g(NH4)2SO4、0.3g尿素、0.3gMgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4·7H2O、1.56mg MnSO4·H2O、1.4mg ZnSO4·7H2O、2.0mgCoCl2。
10.根据权利要求2所述的米曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述的防腐防紫外线物质是氧化锌，防腐防紫外线物质和半成品的质量比是1-1.2:10000。
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