CN116806917B - 一种鱼骨明胶钙螯合肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鱼骨明胶钙螯合肽及其制备方法，所制备的产物具有更好的钙螯合活性。本发明所提供的鱼骨明胶钙螯合肽与钙离子结合形成钙肽螯合物，使钙离子在消化过程中尤其是在肠道中始终保持可溶性的状态，有效地缓解了钙离子在肠道内的沉淀，克服了无机钙刺激性强、吸收利用率低、吸收效果差等缺点。与无机钙相比，钙肽螯合物的吸收具有耗能较少、吸收速率快、载体不易饱和等优点。
Description
技术领域
本发明属于水产品精深加工技术领域，具体涉及一种鱼骨明胶钙螯合肽及其制备方法。
背景技术
钙是人体最丰富的无机元素，占总体重的1.5％～2.2％。钙在细胞代谢、骨骼生长、凝血、神经传导、肌肉收缩等方面起着重要作用。缺钙会导致骨质疏松、佝偻病和骨软化症。我国18～50岁人群钙的每日推荐量是800mg，50岁以上人群钙的每日推荐量是1000mg，而我国钙的平均摄入量为364.3mg/d，还不足推荐量的一半。目前我国有骨质疏松症患者9000多万，占总人口的7％左右；随着人口老龄化的加剧，到二十一世纪中叶，我国骨质疏松患者人数将高达2亿。因此如何有效的补钙一直以来都是我国膳食营养研究中的重要课题。研究发现：在消化道内Ca2+容易与膳食中的磷酸盐、草酸和植酸等形成沉积物，从而限制了钙的生物利用度。因此，即使饮食中含有较为丰富的钙，但是由于饮食中钙以无机钙为主，吸收利用率受多种因素的影响。因此，仍需要在膳食之外通过摄入钙营养强化剂或补钙制剂的方式来防止钙的缺乏。
目前常见的补钙制剂分为三类，第一类是无机形式的钙补充剂，第二类是有机形式的钙补充剂，第三类是氨基酸螯合类钙补充剂。无机形式的钙补充剂以碳酸钙、羟基磷灰石、氯化钙等为主。这些无机钙经胃部消化后以Ca2+的形式进入到肠道内，这依然无法克服离子钙易于在肠道环境中形成钙沉积的缺点。因此，这类补钙制剂只能增加钙的摄入量，但并不能提高钙在体内的吸收利用率。此外，无机钙的摄入还具有一定的副作用，例如摄入过量的碳酸钙可能会导致便秘、胀气等胃肠道副作用。有机形式的钙补充剂，主要包括乳酸钙、葡萄糖酸钙、苹果酸钙、柠檬酸钙、磷酸氢钙等。与无机类的钙制剂相比，这些其胃肠刺激性小，但是产品钙含量低，且并未解决Ca2+在消化道中易形成不溶性沉淀的问题。氨基酸螯合类钙补充剂，包括天冬氨酸螯合钙、甘氨酸螯合钙、复合氨基酸螯合钙等。具有促进肠道钙吸收、提高钙生物利用度等优势。但目前市售的氨基酸螯合钙售价较高，导致其市场接受度不高。国内外研究发现钙结合肽可以与钙形成复合物，以提高钙的吸收和生物利用度。钙肽螯合物在消化过程中尤其是在肠道中始终保持可溶性的状态，可以和磷酸盐、植酸盐等化学物质竞争钙离子，有效地缓解了钙离子在肠道内的沉淀，同时克服了无机钙刺激性强、吸收利用率低、吸收效果差等缺点。此外，与无机钙相比，钙肽螯合物的吸收具有耗能较少、吸收速率快、载体不易饱和等优点。因此，相对于其他补钙制剂来说，钙肽螯合物以其成本低廉、刺激性小、吸收利用率高等特点被越来越多的营养学家们认为是目前最优秀的补钙制剂。
目前，现有技术中常用离子交换层析法对钙螯合肽进行纯化，该方法时间周期长，处理量较少，不适合工业化生产，制备的组分钙螯合活性不高。因此，亟需提出一种高效靶向制备技术来解决该问题。
发明内容
本发明提供一种鱼骨明胶钙螯合肽及其制备方法，所制备的产物具有更好的钙螯合活性。
本发明首先提供一种鱼骨明胶钙螯合肽，其制备方法如下：
1)提取鳕鱼鱼骨明胶
将去除鱼肉的鳕鱼鱼骨进行高温软化，然后将软化的鱼骨加水匀浆后进行提取，提取后离心获得鱼骨明胶溶液；
所述的去除鱼肉，是将鳕鱼鱼骨用中性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解来去除鱼肉；
作为实施例的一个具体记载，所述的加水匀浆后进行提取，是在80℃，料液比1：4条件下提取4h；
作为实施例的一个具体记载，所述的高温软化，是在121℃条件下高温软化50分钟。
2)制备鱼骨明胶肽
在鱼骨明胶溶液中加入蛋白酶进行酶解，酶解结束后进行灭酶，酶解液离心后浓缩干燥得到鱼骨明胶肽；
作为实施例的具体记载，所述的鱼骨明胶溶液，其中蛋白的质量浓度为50～150g/L。
所述的蛋白酶，为碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；
作为优选，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶；
作为实施例的具体记载，所述的酶解，是在pH 6～9，50～55℃条件下水解3～5h；
作为优选，所述的酶解，是在质量浓度为100g/L的鱼骨明胶溶液加入1g/L的木瓜蛋白酶，在pH 6.5，55℃条件下水解4h。
3)制备鱼骨明胶钙螯合肽
将鱼骨活性肽溶液加入到活化好的羟基磷灰石中，于室温下结合，用5mM的磷酸盐缓冲液反复洗脱除去未结合的鱼骨明胶肽，然后采用不同浓度的磷酸盐缓冲液对特异性结合在羟基磷灰石上的鱼骨明胶钙螯合肽进行梯度洗脱，分别收集不同梯度的洗脱液，浓缩、透析脱盐、冻干后获得鱼骨明胶钙螯合肽；
所述的活化，是使用0.5M磷酸盐缓冲溶液进行活化；
所述的洗脱，是于离心机中1000rpm/min，离心5min；
所述的梯度洗脱，是用浓度60，120，180mM的磷酸盐缓冲溶液依次进行洗脱，每个浓度重复三次；
所述的鱼骨明胶钙螯合肽，其中包含有序列如下的肽段：SSGPFG、(HyP)GTK、SSGPLG、L(HyP)GPQ、A(HyP)GFL、(HyP)GPK、GPAGP(HyP)、S(HyP)GS(HyP)GPDGKL、TSGPQ、MTGPQ，所述的HyP为羟脯氨酸。
本发明所提供的鱼骨明胶钙螯合肽可用于制备补钙制剂。
本发明再一个方面还提供一种补钙制剂，所述的补钙制剂中包含有上述的鱼骨明胶钙螯合肽。
本发明所提供的鱼骨明胶钙螯合肽与钙离子结合形成钙肽螯合物，使钙离子在消化过程中尤其是在肠道中始终保持可溶性的状态，有效地缓解了钙离子在肠道内的沉淀，克服了无机钙刺激性强、吸收利用率低、吸收效果差等缺点。与无机钙相比，钙肽螯合物的吸收具有耗能较少、吸收速率快、载体不易饱和等优点。
附图说明
图1为鳕鱼骨明胶肽的钙螯合活性图。
图2为羟基磷灰石型号、结合时间、结合温度、多肽浓度、羟基磷灰石质量与多肽体积比、洗脱条件对鱼骨明胶肽钙螯合活性和得率的影响图。
图3为鳕鱼骨明胶肽亲和层析工艺的响应面实验结果图。
具体实施方式
本发明使用羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)对具有钙螯合活性的多肽组分进行捕获，与羟基磷灰石结合的钙螯合活性肽在改变流动相之后会随着新的洗脱液流出，此时收集到的多肽组分即为蛋白水解物中具有较高钙螯合活性的多肽成分，实现了钙螯合活性肽的靶向捕获。因此，羟基磷灰石是实现高钙螯合活性肽靶向捕获的重要手段。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
(1)鳕鱼骨明胶的提取：
鳕鱼排流水解冻后，去掉残余的内脏，剪成小块并用蒸馏水冲洗干净，加入一定质量的蒸馏水使料液比为1：5，加入0.5％中性蛋白酶和0.5％胰蛋白酶，在55℃条件下水解2h去除鱼肉得到洁净的鱼骨。鱼骨在121℃条件下高温软化50分钟，按料液比1：4进行匀浆，并在80℃条件下提取4h。4000rpm/min离心10min出去鱼骨残渣，即得到鱼骨明胶溶液，鱼骨明胶溶液冻干后备用。
(2)鱼骨明胶肽的制备：
质量浓度为50～150g/L的鱼骨明胶溶液加入1～15％蛋白酶，在pH 6～9，50～55℃条件下水解3～5h后煮沸10～15min灭酶，离心后，将水解液浓缩干燥得鱼骨明胶肽；
所述鱼骨明胶质量浓度为100g/L；
蛋白酶的加入为占鱼骨明胶质量的1～15％；
所述的调节体系pH值是用1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节，调节至6～9；
所述水解温度为55℃；
所述水解时间为4h；
所述灭酶时间为15min；
所述的离心是8000r/min离心15min；
步骤(2)所述的蛋白酶包括食品级的碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶；
作为本发明所述的一种优选方案，质量浓度为100g/L的鱼骨明胶溶液加入1g/L木瓜蛋白酶，在pH 6.5，55℃条件下水解4h后煮沸15min灭酶，8000rpm/min离心15min后得浓缩鱼骨明胶肽酶解液。
(3)鱼骨胶原肽的亲和层析：
在500mL离心杯中加入50～200g活化好的羟基磷灰石填料，然后加入鱼骨活性肽，放入水浴摇床中振荡处理，用60mL的Buffer A对未结合的组分进行反复离心洗脱(1000r/min)3次，收集洗脱液并记录体积，用60mL的Buffer B对钙螯合肽进行梯度洗脱，收集洗脱液并记录体积。HAP填料继续用0.5M，pH 6.8的磷酸盐缓冲液反复洗涤-离心3次以充分活化，用Buffer A离心洗脱3次进行平衡，最后将其储存于0.1M的NaOH溶液。对收集的各组分进行浓缩、透析脱盐并冻干；
所述羟基磷灰石加入量为100g；
所述羟基磷灰石填料为80μm针型，80μm球型和60nm针型；
所述鱼骨明胶肽加入量为30～300mL；
所述鱼骨明胶肽浓度为15～55mg/mL；
所述水浴温度为25～65℃；
所述水浴时间为60～360min；
所述的梯度洗脱为采用60、120和180mM的磷酸缓冲溶液依次进行洗脱，每个浓度重复3次。
作为本发明所述的一种优选方案，在500mL离心杯中加入100g活化好的60nm针型羟基磷灰石填料，然后加入33mL质量浓度为25mg/mL鱼骨活性肽，放入水浴摇床中室温振荡处理240min，用60mL的Buffer A对未结合的组分进行反复离心洗脱(1000r/min)3次，用60mL的120mM Buffer B对钙螯合肽进行反复离心洗脱3次，收集洗脱液得高钙螯合活性得鱼骨明胶肽溶液。
鱼骨明胶肽指纹图谱分析利用安捷伦1260高效液相色谱的液相色谱-质谱联用系统(HPLC-MS)进行分析，UHPLC所用色谱柱为Agilent Advance-Bio Peptide Map C18column(2.1×150mm，2.7μm)。UHPLC参数：流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，流速：0.25mL/min，柱温：40℃，梯度洗脱程序0～2min(5％A)、2～27min(5％A～20％A)、27～37min(20％A～35％A)、37～39min(35％A～80％A)。离子化方式采用电喷雾离子源(Electron Spray Ionization，ESI)。扫描范围：50～1500m/z，电喷雾电压5500v。
以下各实施例中，采用福林酚法测定鱼骨明胶肽的得率，方法如下：
(1)试剂的配置
①标准酪蛋白溶液(250ug/ml)：酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定纯度，再称量制备。也可用250ug/ml牛血清蛋白质标准溶液。
②福林酚试剂甲：吸取试剂A(0.2M氢氧化钠与4％无水碳酸钠溶液等体积混合)100ml，加入试剂B(2％酒石酸钾钠溶液与1％五水硫酸铜等体积混合)2ml混合而成。
③福林酚试剂乙：吸取5ml福林酚试剂加入5ml蒸馏水稀释而成。
(2)操作方法
①标准曲线的制作：
分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml标准溶液于小试管中，分别加进不同量的蒸馏水，补足到1ml。各加入5ml试剂甲，混匀后于室温下(25℃左右)放置10min。再加入0.5ml试剂乙，立即混匀，于室温下反应30min。于500nm波长下测定光密度。以吸光值作为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。
②样品蛋白质含量的测定
取1ml样品溶液，加入5ml试剂甲，混匀，于25℃左右放置10min。再加入0.5ml试剂乙，立即摇匀，于25℃左右反应30min，测定吸光值，从标准曲线查出样品蛋白质含量。
以下各实施例中，采用原子吸收法测定鱼骨明胶肽的钙螯合活性，方法如下：
将3mg样品溶于2mL的5mmol/L的CaCl2和4mL的20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)，在37℃孵育30min。然后将混合液以8000rpm/min的速度离心20min以除去磷酸钙沉淀，取上清液稀释至合适浓度后用原子吸收法测溶解钙的含量(GB 5009.92-2016)。设置不加多肽的空白对照组。钙螯合活性结果表示为每mg多肽能结合的Ca(μg)的量(μg/mg)。每个样品设置三个平行。
钙离子螯合量＝样品组上清液中溶解钙的量-空白组上清液钙的量。
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1
一种基于羟基磷灰石的靶向高效制备鱼骨明胶钙螯合肽的方法，包括以下步骤：
(1)鳕鱼骨胶原的提取：
鳕鱼骨流水清洗加1％中性蛋白酶和胰蛋白酶(1:1)于55℃水解2h去肉去杂质，得到洁净鱼骨。将鱼骨冲洗干净后121℃高温软化50min，将软化鱼骨按料液比1:4进行匀浆。鱼骨匀浆液于80℃水浴4h后，离心取上清，得到鱼骨明胶溶液，浓缩冻干后备用。
(2)鱼骨胶原肽的制备：
质量浓度为100g/L的鱼骨明胶溶液加入1％的碱性蛋白酶，在pH8.5，55℃条件下水解4h，煮沸15min灭酶，得到鱼骨明胶肽溶液，酶解液经过8000rpm/min离心15min后，取上清液浓缩干燥得鱼骨明胶肽。
(3)鳕鱼骨钙螯合肽的高效靶向捕获
在500mL离心杯中加入100g活化好的60nm针型羟基磷灰石填料，然后加入33mL质量浓度为25mg/mL鱼骨明胶肽，放入水浴摇床中室温振荡处理240min，用60mL的Buffer A对未结合的组分进行反复离心洗脱(1000r/min)3次，用60mL的120mM Buffer B对钙螯合肽进行反复离心洗脱3次，收集洗脱液得鳕鱼骨钙螯合活性肽溶液。
实施例2
一种基于羟基磷灰石的靶向高效制备鱼骨明胶钙螯合肽的方法，包括以下步骤：
(1)鳕鱼骨胶原的提取：
鳕鱼骨流水清洗加1％中性蛋白酶和胰蛋白酶(1:1)于50℃水解2h去肉去杂质，得到洁净鱼骨。将鱼骨冲洗干净后121℃高温软化50min，将软化鱼骨按料液比1:4进行匀浆。鱼骨匀浆液于80℃水浴4h后，离心取上清，得到鱼骨明胶溶液，浓缩冻干后备用。
(2)鱼骨胶原肽的制备：
质量浓度为100g/L的鱼骨明胶溶液加入1％的复合蛋白酶，在pH 7.5，55℃条件下水解4h，煮沸15min灭酶，得到鱼骨明胶肽溶液，酶解液经过8000rpm/min离心15min后，取上清液浓缩干燥得鱼骨明胶肽。
(3)鳕鱼骨钙螯合肽的高效靶向捕获
在500mL离心杯中加入100g活化好的60nm针型羟基磷灰石填料，然后加入33mL质量浓度为25mg/mL鱼骨明胶肽，放入水浴摇床中室温振荡处理240min，用60mL的Buffer A对未结合的组分进行反复离心洗脱(1000r/min)3次，用60mL的120mM Buffer B对钙螯合肽进行反复离心洗脱3次，收集洗脱液得鳕鱼骨钙螯合活性肽溶液。
如图1所示，鱼骨明胶在1％的木瓜蛋白酶酶解条件下具有较高的钙螯合活性，达到1.56±0.27μg/mg，因此选择木瓜蛋白酶作为制备鳕鱼骨钙螯合肽的专用酶，加酶量为明胶质量的1％。
选取羟基磷灰石作为亲和层析介质，靶向捕获具有高钙螯合活性的鳕鱼骨明胶肽，对羟基磷灰石的型号、多肽与填料的结合时间、结合温度、多肽浓度、羟基磷灰石质量：多肽体积及洗脱条件等因素进行优化。结果如图2，分别对比了三种直径及晶型不同的羟基磷灰石对钙螯合肽的吸附能力，研究结果表明60nm针型的羟基磷灰石对钙螯合肽的吸附能力更强，该型号的羟基磷灰石吸附的钙螯合肽的得率和活性均高于其他两种型号，分别达到30.13±4.83％和4.70±0.31μg/mg，因此选择该填料进行后续研究。随着结合时间的延长钙螯合肽的得率增加，结合360min钙螯合肽得率达到37.20±2.23％，但是螯合活性并未出现显著性变化。结合温度对钙螯合肽的得率和活性影响不显著。随着多肽浓度的增加钙螯合肽得率显著降低，当多肽浓度达25mg/mL时，钙螯合肽得率达13.66±0.44％，但活性无显著性变化，该结果表明羟基磷灰石亲和钙螯合肽的能力是有限的，因此在进行亲和层析时应控制加样浓度，以提高钙螯合肽得率。羟基磷灰石质量：多肽体积对钙螯合肽的得率有显著性影响，当羟基磷灰石质量一定时，加入多肽的体积越大钙螯合肽的得率越低。羟基磷灰石质量：多肽体积＝3：1时钙螯合肽的得率最高，为6.74±0.89％，此时钙螯合活性为2.16±0.52μg/mg显著高于其他组。洗脱条件对于高效制备钙螯合活性肽至关重要，因此选取60、120、180mM磷酸盐对结合后的钙螯合肽进行梯度洗脱并测定鱼骨明胶钙螯合肽的得率和活性。研究结果表明，60mM磷酸盐洗脱时，钙螯合肽的得率为19.61±1.39％，钙螯合活性为1.25±0.11μg/mg；120mM磷酸盐洗脱时，钙螯合肽的得率为14.19±2.85％，钙螯合活性为4.36±0.72μg/mg；180mM磷酸盐洗脱时，钙螯合肽的得率为7.77±2.29％，钙螯合活性为4.28±0.21μg/mg，综合得率与钙螯合活性的结果120mM磷酸盐为最佳洗脱浓度。
在单因素实验的基础上，选择结合时间、多肽浓度和羟基磷灰石质量：多肽体积三个对钙螯合肽得率影响较大的因素继续进行响应面实验，以期探究各因素之间的交互作用，得到最佳的亲和条件提高钙螯合活性肽得率。响应面实验设计如表1所示。
表1亲和层析工艺响应面优化实验设计与结果表
对响应面实验结果的数据进行拟合回归，回归方程的方差分析如表2所示。以结合时间(X1)、多肽浓度(X2)、羟基磷灰石质量：多肽体积(X3)为自变量，钙螯合肽得率为因变量(响应值Y)，建立二次多元回归方程模型：Y＝7.27+0.37X1–0.14X2+2.47X3-0.64X1X2+0.04X1X3-0.21X2X3+0.31X1 2–0.26X2 2–0.55X3 2。其回归方程达到了极显著水平(P＜0.01)，且失拟项不显著(P＞0.05)，表明方程与实验数据之间有较好的拟合程度。
表2亲和层析工艺响应面优化实验方差分析
注：*:P<0.05；**:P<0.01
各因素的耦合作用对螯合肽得率的影响如图3所示。继续利用Design-export 13软件对回归方程进行预测，预测最优亲和工艺条件为：结合时间220min，多肽浓度25mg/mL，HAP质量：多肽体积＝3：1时多肽得率为10.17％；鳕鱼骨钙螯合肽质谱结果如表3所示。
表3为鳕鱼骨钙螯合肽的序列
结果表明钙螯合活性高的肽段符合胶原蛋白肽的特点均含有甘氨酸，部分含有胶原蛋白的特征性氨基酸羟脯氨酸(Hyp)。
Claims (2)
1.一种鱼骨明胶钙螯合肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1）提取鳕鱼鱼骨明胶
将去除鱼肉的鳕鱼鱼骨进行高温软化，然后将软化的鱼骨加水进行提取，提取后离心获得鱼骨明胶溶液；
2）制备鱼骨明胶肽
在鱼骨明胶溶液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，在pH6.5、55℃ 条件下水解 4h，酶解结束后进行灭酶，酶解液离心后浓缩干燥得到鱼骨明胶肽；
3）制备鱼骨明胶钙螯合肽
在离心杯中加入活化好的羟基磷灰石填料，然后加入质量浓度为25 mg/mL的鱼骨明胶肽溶液，且羟基磷灰石填料和鱼骨明胶肽溶液的质量体积比g/mL为 3：1，放入水浴摇床中室温振荡处理240 min用60 mL的Buffer A对未结合的组分进行反复离心洗脱3次，用60 mL的Buffer B对钙螯合肽进行反复离心洗脱3次，收集洗脱液得高钙螯合活性鱼骨明胶肽溶液；
所述的羟基磷灰石，是采用60 nm针型羟基磷灰石；
所述的Buffer A，是5 mM的磷酸盐缓冲液；
所述的离心洗脱，其离心转速为1000 r/min；
所述的Buffer B，是120 mM的磷酸盐缓冲液；
所述的高钙螯合活性鱼骨明胶钙螯合肽，其序列为SSGPFG、HyP-GTK、SSGPLG、L-HyP-GPQ、A-HyP-GFL、HyP-GPK、GPAGP-HyP、S-HyP-GS-HyP-GPDGKL、TSGPQ或MTGPQ，其中HyP为羟脯氨酸。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中的去除鱼肉，是将鳕鱼鱼骨用中性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解来去除鱼肉；所述的加水进行提取，是在80 °C，料液比1：4条件下提取4 h；所述的高温软化，是在121 °C条件下高温软化50分钟。
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| CN105211892A (zh) * | 2015-11-14 | 2016-01-06 | 中国海洋大学 | 一种鱼骨钙肽螯合物及其制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102871121B (zh) * | 2012-10-10 | 2014-07-09 | 中国食品发酵工业研究院 | 一种海洋骨胶原肽钙螯合物生物补钙剂的制备方法 |
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2023
- 2023-07-04 CN CN202310806839.3A patent/CN116806917B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105211892A (zh) * | 2015-11-14 | 2016-01-06 | 中国海洋大学 | 一种鱼骨钙肽螯合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Isolation of a calcium-binding peptide from tilapia scale protein hydrolysate and its calcium bioavailability in rats;Chen D等;《J Funct Foods》;20141231;第6卷(第1期);摘要、第2.4节 * |
| Recovery of a novel Ca-binding peptide from Alaska Pollack(Theragra chalcogramma) backbone by pepsinolytic hydrolysis;Won-Kyo Jung等;《Process Biochem》;20061231;第41卷(第9期);摘要、第2.3小节 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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