CN107278208A - 壳多糖、水解产物和借助于酶促水解的方式用于从昆虫生产至少一种目标期望的产物的方法，其包括在酶促水解前执行的步骤组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从昆虫生产壳多糖和/或脱乙酰壳多糖的方法。更具体地，本发明涉及用于从昆虫角质层生产壳多糖和/或脱乙酰壳多糖的方法，其包括昆虫角质层压榨步骤，随后为涉及使用蛋白水解酶将昆虫角质层酶促水解的步骤，所述角质层在酶促水解前已经使用氧化剂处理。

Description

壳多糖、水解产物和借助于酶促水解的方式用于从昆虫生产 至少一种目标期望的产物的方法，其包括在酶促水解前执行 的步骤组合
本发明涉及用于制备至少一种目标产物，并且更具体地来自昆虫的壳多糖和/或脱乙酰壳多糖的方法。更具体地，本发明涉及借助于昆虫角质层的酶促水解用于制备壳多糖和/或脱乙酰壳多糖的方法。它还涉及具体的壳多糖和水解产物。
根据本发明，“壳多糖”意指任何类型的壳多糖衍生物，即包含N-乙酰葡糖胺单元和D-葡糖胺单元的任何类型的多糖衍生物，特别是壳多糖-多肽共聚物（有时称为“壳多糖/多肽复合物”）。
壳多糖被认为是生物世界中排在纤维素之后的第二大合成聚合物。事实上，壳多糖由生物世界中的许多物种合成：它构成甲壳类和昆虫类的外骨骼以及围绕并保护真菌的侧壁的部分。更具体地，在昆虫中，壳多糖因此构成其外骨骼的3至60%。
根据本发明的“脱乙酰壳多糖”意指壳多糖脱乙酰作用的产物。脱乙酰壳多糖与壳多糖之间的通常限制是由乙酰化的程度决定：乙酰化程度小于50%的化合物称为脱乙酰壳多糖，并且乙酰化程度大于50%的化合物称为壳多糖。
壳多糖和/或脱乙酰壳多糖被用于许多应用中：化妆品（化妆品组合物）、医学和药物（药物组合物、烧伤治疗、生物材料、角膜敷料、缝合材料）、营养学和食品加工、技术（特别是用于水过滤和净化的过滤剂、组织形成剂、絮凝剂或吸附剂）等。事实上，壳多糖和/或脱乙酰壳多糖是生物相容的、可生物降解的和无毒的材料。
传统上，壳多糖以化学方法从甲壳类、头足类，以及更特别地真菌中提取。化学途径使用大量的试剂（如盐酸、氢氧化钠和漂烫剂），所述试剂具有使壳多糖结构（例如其以天然状态存在，例如如存在于甲壳类的壳中）变性的作用，。此外，大多数化学试剂对人类和环境都有害，并且生成大量必须处理的废水。最后，源于甲壳类的壳多糖和/或脱乙酰壳多糖可在敏感人群中产生过敏反应。
用于提取壳多糖的另一种途径是酶促途径。该途径被视为较温和，因此使得能够更好地保存壳多糖和/或脱乙酰壳多糖。然而，通过该途径获得的壳多糖是呈褐色的，需要纯化步骤以便获得可销售的粉末，即白色粉末。现有的方法因此一般包括用于从壳多糖中去除杂质的一个或多个步骤，例如在酶促水解之前进行的用酸脱矿物质的步骤、和/或在酶促水解之后进行的用氧化剂漂烫壳多糖的步骤。不幸的是，用于纯化壳多糖的这两个步骤均具有改变壳多糖的化学结构的作用。
由本发明人开展的工作证实通过在水解之前进行特定的步骤组合，即压榨步骤和用氧化剂处理昆虫角质层的步骤，能够获得更纯净并且结构更接近于壳多糖的原始结构的壳多糖。
本发明因此涉及用于从昆虫角质层生产壳多糖和/或脱乙酰壳多糖的方法，其包括下述步骤：
（i）压榨昆虫角质层，随后
（ii）用蛋白水解酶酶促水解昆虫角质层，
用氧化剂处理角质层已在酶促水解之前进行。
“昆虫”意指在任何发育阶段的昆虫，如成虫期、幼虫期或若虫期。优选地，根据本发明的方法中使用的昆虫是可食用的。
更具体地，昆虫可以选自鞘翅目（Coleoptera）、双翅目（Diptera）、鳞翅目（Lepidoptera）、等翅目（Isoptera）、直翅目（Orthoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、蜚蠊目（Blattoptera）、半翅目（Hemiptera）、异翅目（Heteroptera）、蜉蝣目（Ephemeroptera）和长翅目（Mecoptera），优选选自鞘翅目、双翅目、直翅目和鳞翅目。
优选地，昆虫选自黄粉虫（Tenebrio molitor）、黑水虻（Hermetia illucens）、蜡螟（Galleria mellonella）、黑菌虫（Alphitobius diaperinus）、大麦虫（Zophobas morio）、Blattera fusca、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、红棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus）、家蝇（Musca domestica）、大头金蝇（Chrysomya megacephala）、飞蝗（Locusta migratoria）、沙漠蝗（Schistocerca gregaria）、家蟋蟀（Acheta domesticus）和樗蚕（Samia ricini）。
更优选地，昆虫选自黄粉虫、黑水虻、蜡螟、黑菌虫、大麦虫、Blattera fusca、家蝇、大头金蝇、飞蝗、沙漠蝗、家蟋蟀和樗蚕，且甚至更优选地，黄粉虫。
在根据本发明的方法中可以使用一个或多个昆虫物种，优选单一的昆虫物种。如果使用几个物种，则有利地选择两个密切相关的物种，例如黑水虻和家蝇。
昆虫优选是被养殖的，而不是从自然中获取。例如，昆虫在昆虫农场养殖。在专门农场繁殖昆虫使得不仅能够控制和消除与昆虫传播疾病相关的风险，还可以限制由于例如杀虫剂的存在而与衍生自昆虫的食物产品的毒性相关的风险。此外，养殖使得能够控制昆虫供应的质量并且限制供应的成本。
“昆虫角质层”不仅意指它们已从昆虫分离出的角质层，角质层还意指包括昆虫的其他组成成分中的一些或全部，包括整个昆虫。事实上，能够将根据本发明的方法应用于整个昆虫，如磨碎的昆虫，或仅应用于包含角质层的昆虫的部分，例如天然分离并且通过合适方法收集的昆虫的蜕皮和/或脱皮。
角质层是由昆虫表皮分泌的外层（或外骨骼）。一般地，它由三层组成：
- 上表皮，其为角质层最薄的最外层（小于4 μm）；该层是不透水的，并且包含一层防水蜡、以及较少量的蛋白质和壳多糖；
- 外角质层，其为角质层的中间层；它基本上由通过鞣制硬化并且负责角质层的刚性的蛋白质；壳多糖和任选的黑色素组成；和
- 内角质层，其为由蛋白质和壳多糖的混合物构成的薄的柔性层。
压榨昆虫角质层的主要目的是去除富含脂肪的压榨汁和/或富集压榨饼以产生用于水解的底物。
在根据本发明的方法中，压榨昆虫角质层使得能够获得包含油（或脂质）含量小于或等于20%，优选小于或等于15%，更优选小于或等于12%，甚至更优选小于或等于10%的压榨饼。
在本申请中，值的范围被理解为是包含性的。此外，当“大约”或“约”在数字之前时，这等价于这个数值的正或负10%。
同样地，为了使压榨饼富集成用于水解的底物，压榨昆虫角质层使得能够获得具有干物质含量包含在30%至60%之间，优选包含在40%至55%之间，且更优选包含在45%至50%之间的压榨饼。
可以使用任何压榨系统用于进行昆虫角质层的压榨，例如单螺杆或双螺杆压榨机（Angel型双螺杆压榨机）、压滤机（Choquenet型压滤机）、压板式挤压机等。这些系统是本领域技术人员众所周知的，所述本领域技术人员能够确定压榨条件以便获得上述的油和/或水含量。
在根据本发明的方法中，压榨昆虫角质层随后为酶促水解。
优选地，用至少一种蛋白水解酶，优选蛋白酶进行酶促水解。在本申请中，名称或后缀“肽酶”和“蛋白酶”被无差别地用于指示引起蛋白质的肽键裂解的酶。有利地，这在40至60℃，优选45至55℃的温度下，以及在包含在6至8之间，优选在6.5至7.5之间的pH下进行4至8小时，优选4至5小时的时间。
酶促水解可以用单一蛋白酶或可选地含有至少一种蛋白酶的酶混合物进行，更优选含有几种蛋白酶的酶混合物，例如含有内切蛋白酶和外切蛋白酶、或蛋白酶和多糖酶的混合物。
优选地，蛋白酶选自氨肽酶、金属羧肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶、金属内肽酶。
有利地，酶可以选自下述：
* n.a .：不适用。
有利地，用于水解中的酶是天冬氨酸内肽酶，例如Prolyve NP。这类酶使得能够在获得的壳多糖的纯度方面获得非常良好的结果，尤其是当这类酶应用于从鞘翅目，且更特别地从黄粉虫获得的压榨饼的水解中时。
酶或酶的混合物以范围为按估计的干物质的重量计0.2至10%，优选按重量计0.4至8%，且更优选0.5至2%的量引入。“估计的干物质的重量”意指更特别地来自昆虫或昆虫部分的干物质的重量，例如可以在进入酶促水解步骤时估计。
在酶促活性方面，所引入的酶或酶混合物的量等价于每100 g待转化的底物（即昆虫或含水的昆虫部分，具有30至70%的含水量）的湿重包含2000至5000 SAPU的活性（下文实施例5中描述的“分光光度法酸性蛋白酶单位”），优选3000至4000 SAPU。
有利地，酶促水解步骤在水例如淡水的存在下进行。酶促水解中使用的水量如下确定：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。应当注意，该比率也相当于水重量与昆虫材料重量的比率，水的密度在常温和常压条件下为1.0 g/mL。
在根据本发明的方法中，酶促水解之前是用氧化剂处理角质层的步骤。
优选地，在根据本发明的方法中，用于角质层处理中的氧化剂选自过氧化氢、高锰酸钾、臭氧和次氯酸钠，甚至更优选过氧化氢。
有利地，当氧化剂是过氧化氢时，用于处理昆虫角质层的这种试剂的量是这样的，其使得过氧化氢含量包含在基于昆虫的总重量按重量计1至33%之间，优选包含在基于昆虫的总重量按重量计2至12%之间，优选按重量计约6%。
优选地，用氧化剂处理昆虫角质层在水例如淡水的存在下进行。有利地，用于处理角质层中的水的量如下确定：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。
根据本发明的方法使得能够获得具有高纯度的壳多糖，例如包含在55至95%之间，优选包含在60至95%之间，甚至更优选在70至90%之间，且甚至更优选在80至90%之间的纯度（或重量分析纯度）（参见实施例5和图7）。
优选地，根据本发明的方法包括在压榨步骤之前的研磨步骤。
该研磨步骤的目的是将角质层和/或昆虫粉碎成颗粒，以便在酶促水解期间促进酶对底物的接近。当它随后为压榨步骤时，该步骤还使得能够促进压榨汁的去除和固体物质的分离。
研磨可以有利地用混合机-研磨机，例如刀磨机进行。
优选地，在研磨结束时，昆虫颗粒的尺寸小于1 cm（使用显微镜可观察到的最大粒度），优选小于0.5 cm，甚至更优选包含在300 μm至0.5 cm之间的尺寸，优选500 μm至0.5cm，且甚至更优选在500 μm至1 mm之间。
可以加入一定量的水以促进研磨。该水量如下确定：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。
有利地，在根据本发明的方法中，用氧化剂处理角质层在研磨和/或压榨步骤之前、伴随着研磨和/或压榨步骤和/或在研磨和/或压榨步骤之后进行。
根据本发明的方法还可以包括在压榨和/或研磨步骤之前杀死昆虫的步骤。
该杀死步骤可以通过常规方法在冷血动物和/或小型动物（甲壳类、鱼类、蜗牛等）的养殖中进行，例如冷（冷冻）、热（热烫）、去氧等。有利地，昆虫杀死步骤通过热烫进行。热烫不仅可以杀死昆虫，还可以降低微生物负荷（降低变质风险和健康风险），并且使可以触发自溶且因此触发其快速褐变的昆虫内部酶失活。这种热烫以尽可能快地促使死亡的方式进行，以便尊重动物福利，并且根据科学的建议。
可选地，可以通过漂烫进行杀死。漂烫具有与上述热烫相同的优点。
有利地，昆虫例如通过热烫或漂烫被杀死，随后在被压榨之前研磨。
优选地，热烫步骤在水例如淡水中，在95至105℃，优选约100℃的温度下进行2至20分钟，优选5至15分钟的时间。
在该热烫步骤中引入的水量如下确定：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。
可选地，漂烫步骤用包含在80℃至130℃之间，优选在90℃至120℃之间的温度下的蒸汽和/或水进行。
有利地，用氧化剂处理角质层伴随着杀死步骤和/或在杀死步骤之后，且特别是伴随热烫和/或在热烫之后进行。
更具体地，用氧化剂处理昆虫角质层可以在下述步骤的一个或多个期间进行：
- 伴随着热烫和/或在热烫步骤之后，更优选伴随着热烫，可选地，伴随着漂烫和/或在漂烫步骤之后，更优选伴随着漂烫。更具体地，当在热烫期间进行昆虫角质层的处理时，可以有利地将氧化剂加入用于热烫昆虫的水中。
- 在研磨之前、伴随着研磨和/或在研磨之后。更具体地，当在研磨期间进行昆虫角质层的处理时，可以有利地将氧化剂加入用于研磨的水中。
- 在压榨之前和/或伴随着压榨。
- 在昆虫角质层处理的具体步骤期间。
在酶促水解之后，根据本发明的方法可以进一步包括热失活步骤，目标是使酶促水解中使用的酶或酶混合物失活。
在根据本发明的方法结束时，壳多糖可以通过压榨或酶促水解反应混合物的离心来回收。在这个阶段，也回收了目标壳多糖副产物，即水解产物。
“水解产物”意指可通过蛋白质的酶促水解获得的，包含蛋白质、水解蛋白质、肽、氨基酸和/或衍生自蛋白质的其他化合物的产物。
本发明还涉及水解产物，例如可作为通过根据本发明的任何一种方法的酶促水解的副产物获得的水解产物。
根据本发明的水解产物具有下述特征中的至少任何一个：
- 灰分含量基于干物质的总重量按重量计≤3.5%
- 当从素食昆虫制备水解产物时，灰分含量≤2.5%
- 基于水溶性蛋白质的总重量，尺寸>12,400 g/摩尔的水溶性蛋白质含量按重量计≤20%，优选<18%，
- 蛋白质含量≥70%，优选≥74%，
- 当从非飞行昆虫制备水解产物时，蛋白质含量≥80%，
- 脂质含量基于干物质的总重量按重量计≤10%，
- 当从非飞行昆虫制备水解产物时，脂质含量≤4.5%，
- 蛋白酶消化率相对于蛋白质的总重量>93%，
- 选自ASP、GLU、ALA、GLY、LEU、PRO、TYR、VAL、LYS的至少任何5种氨基酸的相对丰度≥6%，
- 选自ASP、GLU、ALA、LEU、PRO、TYR、VAL的至少任何3种氨基酸的相对丰度≥8%。
“素食昆虫”意指在其通常的饮食中不含动物蛋白质的昆虫。作为素食昆虫的例子，可以提到鞘翅目、鳞翅目或直翅目。
“飞行昆虫”意指能够在成年时飞行的昆虫，与被称为“非飞行”的昆虫相反。作为飞行昆虫的例子，可以提到鳞翅目或双翅目。作为非飞行昆虫的例子，可以提到某些鞘翅目或直翅目。
更具体地，“水溶性蛋白质”意指蛋白质（或粗蛋白质）中可溶于水溶液中的那些，所述水溶液的pH包含在6至8之间，有利地在7.2至7.6之间。
优选地，水溶液是缓冲溶液，其pH包含在6至8之间，有利地在7.2至7.6之间。
优选地，缓冲溶液是磷酸盐缓冲NaCl溶液，其pH等于7.4 ± 0.2。
更具体地，通过下述方法测量水溶性蛋白质的大小：
将100 mg样品引入10 mL磷酸盐/NaCl缓冲液（pH 7.4，0.137 mM）内。将样品搅拌1分钟（涡旋），在900 g下离心1分钟，随后通过0.45 μm膜过滤。使用Nucleogel GFC-300柱，在空间排阻色谱系统上进行分析，所使用的洗脱剂为磷酸盐/NaCl缓冲液（pH 7.4，0.137 mM），流速为1.0 mL/分钟，其中检测通过UV检测器在280 nm处。
有利地，水解产物包含至少70%，优选至少74%的蛋白质，至多3.5%的灰分，以及小于20%，优选小于18%的尺寸大于12,400 g/摩尔的水溶性蛋白质含量。
优选地，水解产物具有所有上述性质。
特别要注意的是，根据本发明的水解产物可以通过其葡糖胺含量和/或其衍生物（优选N-乙酰葡糖胺）区别于任何其他类型的水解产物，更特别地，基于水解产物的干物质的总重量按重量计大于或等于0.01 %，优选大于或等于0.08%的含量。
上述特征的所有单位和测量方法在实施例中，且更具体地在实施例6中进行描述。
该水解产物可有利地补充有用于平衡其营养概况的添加剂，使得其适合于不同类型的动物。
水解产物可以浓缩随后干燥，以获得干燥的水解产物。可选地，水解产物可以是液体形式。这些水解产物可以用作特别用于动物的食品或食物成分，或可选地它们可以被处理，例如分离氨基酸。
下文更详细地描述根据本发明的方法的优选实施方案。
特别地，该优选实施方案描述了用于根据本发明的方法的各个有利步骤，例如壳多糖的温和纯化步骤：第二次压榨、洗涤操作、任选的过滤和干燥。
最后，由于壳多糖一般以粉末的形式销售，所以也可以进行第二次研磨。后者也可以进行以促进脱乙酰化反应，用于从壳多糖制备脱乙酰壳多糖。脱乙酰化反应的条件在下文详细描述的优选实施方案的步骤10中更全面地描述。
根据本发明的壳多糖具有下述性质中的至少任何一种：
- 灰分含量基于干物质的总重量按重量计≤3%，优选≤2.5%，
- 当从黄粉虫制备壳多糖时，灰分含量≤1%，
- 脂质含量基于干物质的总重量按重量计≤6.5%，
- 当从黄粉虫制备壳多糖时，脂质含量≤2%，
- 总氨基酸≤50%，优选≤46%，
- 当从飞行昆虫制备壳多糖时，总氨基酸≤19%，
- 当用Prolyve NP作为酶从黄粉虫制备壳多糖时，氨基酸含量≤23%，
- 选自ALA、GLY、LEU、PRO、SER、TYR、VAL的至少任何3种氨基酸的相对丰度≤10%，
- 当从黄粉虫制备壳多糖时，LEU、PRO、VAL的相对丰度≤10%，
- 比色纯度≥62%，
- 差异纯度≥40%，优选≥46%，
- 当从黄粉虫制备壳多糖时，差异纯度≥51%，
- 当从飞行昆虫制备壳多糖时，差异纯度≥73%，
- 当用Prolyve NP作为酶从黄粉虫制备壳多糖时，差异纯度≥73%。
根据本发明的壳多糖有利地包含小于或等于50%，优选小于或等于46%的氨基酸含量，小于或等于3%，优选小于或等于2.5%的灰分含量，以及大于或等于40%，优选大于或等于46%的差异纯度。
优选地，壳多糖具有所有上述性质。
上述特点的所有单位和测量方法在实施例中，且更具体地在实施例6中进行描述。
用于从昆虫生产壳多糖的特别有利的方法包括下述步骤：
a）杀死昆虫，
b）研磨昆虫，
c）压榨昆虫，
d）用蛋白水解酶酶促水解昆虫角质层，
e）回收壳多糖，
在步骤d）之前用氧化剂处理昆虫角质层。
各个步骤a）至e）和用氧化剂处理昆虫角质层的优选实施方案如上所述或在下文优选实施方案的相应步骤中描述。
本发明还涉及壳多糖，例如可通过根据本发明的方法获得的壳多糖。由于根据本发明的方法使用的温和条件，该壳多糖具有的结构接近于壳多糖的那种，因为它在昆虫角质层中以天然状态出现，同时具有高纯度，例如包含在55至95%之间，优选包含在60至95%之间，甚至更优选在70至90%之间，且甚至更优选在80至90%之间的纯度。
用于从昆虫生产脱乙酰壳多糖的特别有利的方法包括下述步骤：
a）杀死昆虫，
b）研磨昆虫，
c）压榨昆虫，
d）用蛋白水解酶酶促水解昆虫角质层，
e）回收壳多糖，
f）所回收的壳多糖的脱乙酰化，
g）回收脱乙酰壳多糖，
在步骤d）之前用氧化剂处理昆虫角质层。
各个步骤a）至g）和用氧化剂处理昆虫角质层的优选实施方案如上所述或在下文优选实施方案的相应步骤中描述。
本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的脱乙酰壳多糖。
可通过根据本发明的方法获得的壳多糖和/或脱乙酰壳多糖可以有利地用于各种应用中：
- 在化妆品、药​​物、营养或饮食组合物中，
- 作为用于处理烧伤的生物材料，作为第二皮肤，用于制备角膜敷料或缝合材料，
- 作为过滤剂、组织形成剂、絮凝剂和/或吸附剂，特别是用于水过滤和纯化。
根据本发明的优选实施方案，该方法包括在图1中示意性描述的下述步骤。应当注意，在该优选实施方案中，某些步骤被指示为任选的。
●步骤1：杀死昆虫
这种杀死步骤1使得能够在降低微生物负荷（降低变质风险和健康风险），并且通过使昆虫内部酶失活的同时杀死昆虫，所述昆虫内部酶可以触发自溶且因此触发其快速褐变。
杀死可以通过热烫进行。
昆虫，优选幼虫，因此用水热烫2至20分钟，优选5至15分钟。优选地，水在包含在95至105℃之间，优选100℃的温度下。
在该热烫步骤1中引入的水量如下确定：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。
可选地，杀死可以通过漂烫进行。优选地，昆虫用包含在80至130℃之间，优选在90至120℃之间，更优选在95至105℃之间，甚至更优选98℃的温度下的蒸汽（蒸汽喷嘴或床），或包含在95至105℃之间，优选100℃（通过喷嘴）的温度下的水，或包含在80至130℃之间，优选在90至120℃之间，更优选在95至105℃之间的温度下的混合模式（水+蒸汽）进行漂烫。在漂烫室中的停留时间包含1至15分钟之间，优选在3至7分钟之间。
在该步骤中，还能够根据下文中间步骤中指出的细节，使用包含氧化剂的热烫或漂烫水来处理昆虫角质层。
●中间步骤（任选的）：用氧化剂处理角质层
可以在该方法中引入用氧化剂处理角质层的专门步骤。有利地，处理角质层的该中间步骤在杀死步骤1和研磨步骤2之间进行。
该中间步骤优选用选自过氧化氢（H2O2）、高锰酸钾（KMnO4）、臭氧（O3）和次氯酸钠（NaClO）的氧化剂，更优选过氧化氢进行。
根据第一个实施方案，在步骤1结束时，当后者通过热烫进行后，在将热烫水任选冷却至约40至60℃，优选约50℃的温度之后，将氧化剂直接引入热烫罐内。
如销售的过氧化氢通常为水溶液的形式，例如基于水的总重量按重量计30%的溶液。
引入用于处理的过氧化氢的量是这样的，其使得过氧化氢含量包含在基于昆虫的总重量按重量计1至33%之间，优选基于昆虫的总重量按重量计2至12%，优选按重量计约6%。
根据第二个实施方案，将昆虫从热烫罐中取出，筛分并且重新引入罐内。
随后将过氧化氢以稀释水溶液的形式引入罐内，过氧化氢含量随后包含在基于水的重量按重量计1至33%之间，优选基于重量的水按重量计2至12%，且优选按重量计约6%。
●步骤2：研磨
将昆虫从热烫罐或处理罐或者漂烫室中取出，随后将其筛分，并且放置在研磨机例如刀磨机中，使得能够将昆虫粉碎成颗粒。
为了促进研磨，可以添加一定量的水。该水量类似于在热烫步骤1期间引入的水量：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。还能够保留热烫水和/或产生于中间步骤的水，以便进行该步骤。这种水可能含有氧化剂。在这种情况下，角质层的处理可以在热烫步骤1和研磨步骤2期间或者在角质层处理的中间步骤期间和在研磨步骤期间发生。
优选地，在研磨完成时，昆虫颗粒的尺寸小于1 cm（使用显微镜可观察到的最大粒度），优选小于0.5 cm。
优选地，颗粒的尺寸包含在300 µm至0.5 cm之间，更优选在500 μm至0.5 cm之间，且甚至更优选在500 μm至1 mm之间。
无需过度减小粒子的尺寸，例如至小于250 μm的尺寸。
该研磨步骤2促进酶对其底物的接近。
在该步骤中，能够将氧化剂引入研磨机，以便根据前述中间步骤中所示的方法处理角质层。
当角质层的处理不伴随着研磨进行时，在该步骤期间，能够添加通常用于产物保存和稳定性的抗氧化添加剂。
●步骤3：压榨昆虫角质层
随后将源于研磨步骤2的湿糊剂根据程序放置在压榨机中，所述程序使得能够压榨且分离包含脂肪级分和蛋白质级分两者的汁。
优选地，压榨步骤使得能够获得包含油含量小于或等于20%，优选小于或等于15%，更优选小于或等于12%，甚至更优选小于或等于10%的压榨饼。
类似地，压榨步骤使得能够获得干物质含量包含在30%至60%之间，优选包含在40%至55%之间，且更优选包含在45%至50%之间的压榨饼。
任何压榨系统可以用于进行压榨步骤，例如单螺杆或双螺杆压榨机（Angel型双螺杆压榨机）、压滤机（Choquenet型压滤机）、压板式挤压机等。这些系统是本领域技术人员众所周知的，所述本领域技术人员能够确定压榨条件以便获得上述的油和/或水含量。
如果用包含氧化剂的水获得来自研磨步骤2的湿糊剂，则在压榨步骤3之前去除该氧化剂的至少一部分可以是有利的。
该压榨步骤3可以任选地从热烫的昆虫开始在研磨步骤2之前进行。然而，在研磨步骤2之后执行压榨步骤3是有利的。
该压榨步骤3因此使得能够获得压榨汁和压榨饼。
●步骤4：酶促水解
将源于研磨步骤2的湿糊剂或源于压榨步骤3的压榨饼放置在具有水的水解罐中。
任选地，且如下所述，源于分离步骤12的蛋白质级分可以通过将其与压榨饼混合而在该酶促水解步骤4中重新引入。
任选地，且在热烫水不含氧化剂的情况下，可以回收热烫水并且在水解步骤中重新引入。事实上，这种水含有通过这种热烫的动作已溶解的昆虫级分，并且通过在水解中使用后者能够减少损失。任选地，来自热烫的这种水可以脱脂，因为某些蜡可以溶解在水中。
在该酶促水解步骤4中引入的水量类似于在热烫步骤1中引入的水量：以mL计的水体积与以g计的昆虫重量的比率优选包含在0.3至10之间，更优选在0.5至5之间，甚至更优选在0.7至3之间，甚至更优选约1。
在6至8，更特别地6.5至7.5的pH下，在40至60℃，更特别地45至55℃的温度下，酶的水解用蛋白酶如商业蛋白酶进行4至8小时，更特别地4至5小时。
在水解步骤中引入的酶的量基于进入水解的干物质的估计总重量按重量计小于10%，优选小于6%，更优选约2%。
蛋白酶解水解导致含有肽、葡糖胺和寡聚壳多糖的可溶相，以及由壳多糖主要是壳多糖-多肽共聚物形成的固体残余物。
●步骤5：热失活
为了停止反应的酶的活性并且稳定水解的可溶相，通过将该汁在80至105℃之间加热10至25分钟，优选15至20分钟来进行热失活。根据一种程序，根据农业食品工业的通常灭菌技术进行该热失活步骤5。根据另一种程序，通过在IR或UV辐射下加热或通过微波加热进行酶失活。
●步骤6：压榨
主要由壳多糖组成的固体残余物被回收，随后在压榨机中压榨用于使该残余物的排出最大化，以便将该压榨物重新注入可溶相内。因此形成的压榨残余物基本上由壳多糖组成，主要以壳多糖-多肽共聚物的形式。
●步骤7和8（任选的）：洗涤和干燥
随后将固体残余物洗涤、过滤、再次洗涤、随后通过本领域技术人员已知的常规技术干燥。
有利地，干燥系统被设计成保护壳多糖-多肽共聚物的结构：控制液体比重测定法、通风和空气的组成。有利地，干燥可以在通风炉中在60至80℃，优选约70℃的温度下进行。
任选地，这些步骤可以包括最终的脱脂步骤：用HCl处理固体残余物，以去除最后的脂质残留物，特别是角质层蜡。
接下来的步骤9至11用于将壳多糖转化为脱乙酰壳多糖，并且因此仅在所需产物为脱乙酰壳多糖时使用。
●步骤9（任选的）：研磨
随后例如在切割（刀）磨机中，将主要包含壳多糖的干燥的固体残余物研磨。
通过脱乙酰反应从壳多糖生产脱乙酰壳多糖在很大程度上取决于壳多糖颗粒的大小。因此，脱乙酰化之前干燥固体残留物的非常细的研磨使得可能显著增加产率和脱乙酰化反应的速率，如下表1所示：
研磨30秒 研磨45秒 研磨60秒 研磨120秒
50%的颗粒 < 174 µm < 117 µm < 95 µm < 67 µm
90%的颗粒 < 310 µm < 244 µm < 157 µm < 159 µm
DA* 99% 90% 85% 80%
表1：根据壳多糖的先前研磨脱乙酰化的效率。
*乙酰化程度DA的测量。
在表1中报道的测试中进行的脱乙酰化条件如下：反应时间4小时，100℃，以30体积%在水溶液中的NaOH，估计的壳多糖:NaOH溶液的比率等于1:20。
因此，固体残余物优选研磨成小于200 μm，更优选小于160 μm的粒度。
●步骤10：脱乙酰化
随后将任选在步骤9中研磨的固体残余物置于反应器中，向其中加入浓缩氢氧化钠溶液共4至24小时，且优选6至18小时。含量范围为30%至40%的在水溶液中的氢氧化钠以g研磨的壳多糖的重量/以mL水溶液中的氢氧化钠的体积的比率加入，所述比率包含在1:50至1:10之间，优选约1:20。随后将罐加热，脱乙酰化温度在80至150℃之间，优选在90至120℃之间，且更优选在100℃下。
脱乙酰壳多糖因此以粉末形式获得。
随后，脱乙酰壳多糖可以经历本领域技术人员已知的任何操作，允许其被官能化，特别是通过加入自由基（羧基化、羟基化等）。
●步骤11（任选的）：干燥
随后将脱乙酰壳多糖粉末在30至80℃之间，优选在50至70℃之间，优选在约60℃下干燥，以便获得干物质含量大于85%，更特别地大于90%的粉末。
接下来的步骤用于从压榨步骤3中获得的汁中回收脂肪级分和蛋白质级分，并且因此仅在需要这种回收时使用。
●步骤12：分离
压榨汁经历一个或多个分离步骤，以便使脂肪级分（昆虫油）与蛋白质级分（昆虫血淋巴蛋白）分离。这些步骤可以通过本领域技术人员众所周知的任何油分离技术进行，例如离心、倾析、通过反渗透分离、超滤、超临界CO2等、或这些技术中的几种的组合。
考虑到昆虫中存在非常不同组成的油，脂肪级分的分离可能是复杂的，并且脂肪酸可以具有短链（C2-C5）以及非常长的链（例如，对于蜡：> C25）。在离心过程中将温度升高到高于这些油的熔点（大约38℃）使得能够溶解该膏状物，并且促进脂肪级分与汁的剩余部分的分离。离心液随后经历根据（滗析器或Tricanter型）的程序的倾析，用于油和蛋白质的最佳可能分离。
因此，这些步骤使得能够获得脂肪级分。
一旦与脂肪级分分离，蛋白质级分就可以紧在水解步骤4之前与源于压榨步骤3的压榨饼混合。事实上，在压榨步骤3中，通常多于20%的蛋白质在汁中损失，因此回收该级分并且使其经受水解步骤有益。
●步骤13（任选的）：浓缩
根据一种程序，通过水性部分的真空蒸发进行浓缩。浓缩物具有大于10%，优选大于20%的干提取物。该操作促进干燥，并且可以在该步骤中添加通常用于产物保存和稳定性的添加剂。
●步骤14（任选的）：干燥
浓缩物最终通过本领域技术人员已知的技术进行干燥，例如喷雾/雾化（“喷雾干燥”），这使得能够获得提取物，即富含浓缩肽和葡糖胺的浓缩物的干粉，所述葡糖胺特别源于通过H2O2（基本上）的壳多糖部分水解。
参考附图，由给出作为举例说明的下述实施例，本发明的其他特点和优点将变得清楚，所述附图分别表示：
- 图1是根据本发明的方法的优选实施例的流程图，
- 图2是比较通过含和不含过氧化氢的酶促方法获得的壳多糖的纯度的图表，
- 图3是举例说明提取（酶促或化学）方法和用氧化剂处理对获得的壳多糖的影响的图表，
- 图4是比较通过酶促方法获得的壳多糖的纯度的图表，所述酶促方法包括研磨和压榨的一个或多个初步步骤，
- 图5是比较在从其中提取壳多糖的中间产物的不同级分中测量的脂质含量的图表，
- 图6显示了通过酶促方法获得的压榨汁和压榨饼之间的脂质分布，所述酶促方法包括在研磨和压榨之前的步骤或在压榨之前的步骤，
- 图7是比较通过酶促方法获得的壳多糖的纯度的图表，所述酶促方法包括在研磨操作、压榨和用氧化剂处理之前的一个或多个步骤，
- 图8：组合步骤对水解产物中的脂质含量的作用，
- 图9：通过该方法获得的水解产物的消化率，
- 图10：TM + Prolyve：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图11：TM + Sumizyme：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图12：TM + Novozyme：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图13：TM + 中性蛋白酶：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图14：HI + Prolyve：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图15：GM + Prolyve：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图16：AD + Prolyve：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图17：将氧化剂和压榨步骤组合对壳多糖中的灰分含量的作用，
- 图18：组合步骤对壳多糖中的脂质含量的协同作用，
- 图19：TM + Prolyve：壳多糖中的氨基酸的相对丰度，
- 图20：TM + Sumizyme：壳多糖中的氨基酸的相对丰度，
- 图21：TM + Novozyme：壳多糖中的氨基酸的相对丰度，
- 图22：TM + 中性蛋白酶：壳多糖中的氨基酸的相对丰度，
- 图23：HI + Prolyve：水解产物中的氨基酸的相对丰度，
- 图24：GM + Prolyve：壳多糖中的氨基酸的相对丰度，
- 图25：AD + Prolyve：壳多糖中的氨基酸的相对丰度，
- 图26：壳多糖的重量分析纯度 - 不同酶，
- 图27：壳多糖的重量分析纯度 - 不同昆虫，
- 图28：从黄粉虫获得的壳多糖的比色纯度 - 不同酶，
- 图29：通过该方法获得的壳多糖的比色纯度 - 不同昆虫，
- 图30：所获得的壳多糖的差异纯度，和
- 图31：所获得的壳多糖的结晶度。
在下文给出的实例中，对规定或指令的任何参考涉及如对本申请的提交日期有效的所述规定或所述指令。
实施例1：根据本发明的方法的实施例
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL 6%过氧化氢溶液。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用100 mL体积的水研磨。将因此获得的液体传送到双螺杆型压榨机内，这导致具有20.9 ± 1.3%干物质含量的17.89± 0.87 g压榨饼，以及具有4.04 ± 0.05%干物质含量的389.49 ± 6.53 g压榨汁。将因此获得的10 g（湿重）压榨饼转移到含有50 mL水和0.1 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。因此，通过该方法获得0.64 ± 0.05 g壳多糖。
实施例2：用氧化剂处理角质层的存在对所获得的壳多糖纯度的影响
将25 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用25 mL体积的水研磨。在具有过氧化氢的反应的情况下，将因此获得的液体置于过氧化氢溶液下1小时，随后转移到含有4%蛋白酶（Sumizyme LP）溶液的250-mL锥形瓶中，否则将其直接转移到含有蛋白酶溶液的锥形瓶中。将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（pH大约6.5）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。
在使用过氧化氢后因此获得的干燥残余物相对于初始干物质为6.3 ± 0.7%，而产生于不含过氧化氢的方法的干燥残余物相对于初始干物质为9.75 ± 0.9%。
与相对于产生于化学提取的那种获得的干残余物的重量相比，确定了壳多糖的纯度，初始干物质的5%。它因此对于用过氧化物处理后获得的产物确认为79.9 ± 9%，并且在不存在过氧化物的情况下确认为51.5 ± 4.9%（参见图2）。
实施例3：使用氧化剂和酶促水解处理角质层的顺序的影响
酶促获得脱乙酰壳多糖（不添加氧化剂）
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用100 mL体积的水研磨。将因此获得的液体转移到含有150 mL 1%蛋白酶溶液（Prolyve）的500-mL锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（pH大约6.5）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。通过该方法获得1.656 ± 0.021 g壳多糖。
在热烫期间添加H2O2而酶促获得壳多糖
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL 6%H2O2水溶液。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后与100 mL体积的水混合。将因此获得的液体转移到含有150 mL 1%蛋白酶溶液（Prolyve）的500-mL锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。通过该方法获得1.98 ± 0.22 g壳多糖。
通过水解后伴随H2O2添加的酶促途径获得壳多糖
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用100 mL体积的水研磨。将因此获得的液体转移到含有150 mL 1%蛋白酶溶液（Prolyve）的500-mL锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（pH大约6.5）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。随后将残余物置于在65℃下6% H2O2溶液中1小时。将因此获得的壳多糖过滤（0.45-0.5μm），随后在70℃下干燥24小时。通过该方法获得1.304 ± 0.091 g壳多糖。
通过化学途径获得壳多糖
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用60 mL体积的水研磨。将因此获得的液体与50 mL水一起转移至1L瓶中。加入500 mL 1M HCl，并且将整体置于在90℃下的搅拌1小时。随后将反应混合物过滤并且用水洗涤，直到获得澄清的残余物。随后将该残余物转移到1L瓶中，向其中加入500 mL 1M NaOH，并且将整体置于在90℃下的搅拌24小时。随后将反应混合物过滤并且洗涤，直到获得澄清的滤液，并且将残余物最终在70℃下干燥24小时。通过该方法获得0.944 ± 0.005 g壳多糖。
所获得的壳多糖的分子量测定（通过粘度测定法）
将含有1 g壳多糖和10 mL 1M NaOH的烧瓶在90℃下静置4小时。随后将混合物过滤（0.45-0.5μm），并且将因此洗涤的残余物在70℃下静置24小时。
溶剂的制备：将5 g LiCl置于100 mL的N,N-二甲基乙酰胺中，并且搅拌4-5小时（直到完全溶解）。
通过将0.2 mg壳多糖溶解在1 mL溶剂中来获得原液。从该原液开始制备浓度为0.1 mg/mL、0.08 mg/mL和0.04 mg/mL的稀释液。随后用Ostwald型粘度计一式三份地测量这些各种溶液的粘度，并且分子量由下式计算：
[η]= KMw α (1)
其中
[η]：以cm3/g的固有粘度，
Mw：以g/摩尔（或Da）的壳多糖的摩尔质量，和
Mark-Houwink系数α= 0.71和K = 0.000893，
固有粘度由下述获得：
[η]=ηr/C (2)
其中
ηr: 折合粘度（不含单位），
C：以mg/mL的浓度，
折合粘度由下述获得：
ηr = t/t0 (3)
其中
t：以s对于溶液测量的衰减时间，
t0：以s对于溶剂测量的衰减时间。
从图3可以看出，所获得的壳多糖分子的大小根据所使用的提取方法。因此，化学方法损害了分子的完整性（所获得的Mw低于70,000 g/摩尔），但最苛刻的处理是由在水解后用过氧化氢漂烫壳多糖，甚至酶促水解组成的那种（Mw低于9,000 g/摩尔） 。
根据本发明的方法（在热烫期间或紧在热烫之后，即在方法开始时伴随过氧化氢添加的酶促水解）相对于最初在昆虫中可以发现的那种确实降低了分子的尺寸（通过简单酶促水解的壳多糖的Mw为130,000 g/摩尔），但至小得多的程度（Mw接近于80,000 g/摩尔），并且所获得的结果大于与常规化学提取相关的那种。
实施例4：在酶促水解之前的压榨步骤对所获得的壳多糖纯度的影响
测试不同类型的机械预处理：单独的研磨（“研磨1”）、研磨随后为压榨、研磨随后为压榨和第二次研磨（“研磨2”）、以及单独的压榨。
对于压榨，在下述条件下使用Angel型压榨机。
- 速度= 82转/分；
- W（能量）= 3 HP（马力）或2.68 x 106 J；
- 孔隙率（近似值）= 第一部分中为0.5 mm和最后部分中为0.2 mm。
1. 材料与方法
使用一次研磨的壳多糖生产
将200 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，并且置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的200mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后与200 mL体积的水混合。将因此获得的液体转移到含有2 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。因此，通过该方法获得8.13 ± 0.27 g壳多糖。
使用研磨随后为压榨的壳多糖生产
将200 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，并且置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的200mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后与200 mL体积的水混合。将因此获得的液体传送到双螺杆型压榨机内。将30 g因此获得的压榨饼转移到含有150 mL水和0.3g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。因此，通过该方法获得4.71 ±0.11 g壳多糖。
使用第一次研磨（“研磨1”）随后为压榨和第二次研磨（“研磨2”）的壳多糖生产
将200 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，并且置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的200mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后与200 mL体积的水混合。将因此获得的液体传送到双螺杆型压榨机内。使因此获得的压榨饼在70℃的烘箱中干燥24小时，随后研磨至250 μm。将10 g因此获得的粉末转移到含有50 mL水和0.1 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。因此，通过该方法获得4.93 ± 0.12 g壳多糖。
仅使用压榨的壳多糖生产
将200 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，并且置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的200mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后传送到双螺杆型压榨机内。将90 g因此获得的压榨饼转移到含有450 mL水和0.9 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。因此，通过该方法获得6.48 ± 0.28 g壳多糖。
通过化学途径的壳多糖生产
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，并且置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后与60 mL体积的水混合。将因此获得的液体转移到1-L容器中，并且加入500 mL 1M HCl溶液。将整体置于在90℃下的搅拌1小时。随后过滤内容物，并且将固体残余物转移到含有500 mL 1M NaOH溶液的1L瓶中；将整体置于在90℃下的搅拌24小时。随后过滤残余物，并且置于在70℃下的通风炉中24小时。因此，获得0.944 ± 0.005 g化学纯化的壳多糖。
纯度的计算
壳多糖的纯度通过比较获得的干燥残余物的重量相对于产生于化学提取的重量来确定，初始干物质的大约5%。
脂质含量的测量
将2 g样品置于烧杯中，向其中加入0.2 g Na2SO4和15 mL CHCl3/MeOH（2/1 v/v）。将整体置于磁力搅拌下20分钟，随后过滤溶液，并将残留物再次置于具有10 mL CHCl3/MeOH（2/1 v/v）的烧杯中。将整体置于磁力搅拌下15分钟，随后过滤溶液，将溶剂相合并且蒸发至恒重。脂质含量测定为相对于样品的初始重量（2 g）在提取-蒸发后按重量计的百分比。
2. 结果
从由图4可以看出的，该方法对所获得的壳多糖纯度具有影响，使用最小的压榨获得最好的结果。最好的结果使用研磨随后为压榨获得，即纯度为78%的壳多糖，并且最差的结果使用单独的研磨获得，即纯度为48%的壳多糖。
由其提取壳多糖的中间产物的更精细分析显示低脂质含量促进所获得的壳多糖的更大纯度（图5）。“中间产物”意指进入酶促水解的产物，即源于水解前的最后一步，即根据上述生产方法，研磨步骤1或2或压榨步骤。
壳多糖和水解汁中的脂质含量的分析事实上显示，根据中间产物中存在的初始脂质含量，壳多糖中的脂质含量相对稳定，为7至15%，而水解产物中的脂质含量从11%到47%不等（图3）。
更具体地，如果中间产物具有35%的脂质含量，则：
- 产生于水解的壳多糖仅为50%纯的，并且将含有10%的脂质，和
- 水解产物的脂质含量本身将接近于40%。
然而，如果中间产物的脂质含量为7%，则：
- 水解后获得的壳多糖将具有80%的纯度，并且将具有8%的脂质含量，并且水解产物也将具有约10%的低脂质含量。
这指示当初始脂质含量很高，大于12%时，负责水解的酶不仅促使水解蛋白质，还通过催化多功能性（catalytic promiscuity）水解脂质。因此，在初始脂质分别为35%和7%的情况下，获得壳多糖中类似的脂质含量，即8.6和7.9%。然而，壳多糖的纯度在这种情况下分别从48%到84%。因此，一方面52%的杂质和另一方面16%，平均8%是由于脂质，并且仍附着至壳多糖的蛋白质的量因此比更多脂质存在于经受水解的中间产物中的情况下高38个点。
最后，也可以研究压榨上游的研磨的重要性（图6）。因此，可以清楚地看出，当进行初步研磨时，饼和压榨汁之间的脂质分布远远更有效，12.9相对于87.1，针对42.7相对于57.3。
实施例5：在酶促水解之前的步骤组合对所获得的壳多糖纯度的影响
测试不同类型的预处理：单独的研磨、研磨随后为压榨、用氧化剂（H2O2）处理角质层随后为研磨、以及用氧化剂（H2O2）处理角质层随后为研磨和压榨。
对于压榨，使用实施例4中所述的Angel型压榨机，在下述条件下：
- 速度= 82转/分；
- W（能量）= 3 HP（马力）或2.68 x 106 J；
- 孔隙率（近似值）= 第一部分中为0.5 mm和最后部分中为0.2 mm。
1. 材料与方法
使用研磨的壳多糖生产
将200 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的200 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后与200 mL体积的水混合。将因此获得的液体转移到含有2 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。通过该方法获得8.13 ± 0.27 g壳多糖。
使用研磨随后为压榨的壳多糖生产
将200 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的200 mL水。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用200 mL体积的水研磨。将因此获得的液体传送通过双螺杆型压榨机内。将30 g因此获得的压榨饼转移到含有150 mL水和0.3 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。通过该方法获得4.71 ± 0.11 g壳多糖。
用氧化剂（H2O2）处理角质层后随后为研磨的壳多糖生产
将50 g黄粉虫幼虫引入烧杯内，置于100℃下的水浴中，其含有预先煮沸的50 mL 6%过氧化氢溶液。5分钟后，将烧杯从水浴中取出，将幼虫排干，随后用100 mL体积的水研磨。将因此获得的液体转移到含有150 mL水和0.5 g蛋白酶（Prolyve）的锥形瓶中，并且将整体置于在45℃下的磁力搅拌4小时（在大约6.5的pH下）。随后将锥形瓶置于在90℃下的水浴中15分钟，以便使酶失活，随后将溶液在0.45-0.5 μm下热过滤。因此获得的壳多糖在70℃下干燥24小时。通过该方法获得1.98 ± 0.22 g壳多糖。
用氧化剂（H2O2）处理角质层随后为研磨和压榨的壳多糖生产
该测试根据实施例1进行。
纯度的计算
根据最初包含在幼虫中的壳多糖含量，即幼虫干重的大约5%，通过重量分析法计算壳多糖纯度。
2. 结果
结果呈现于图7中。通过酶促水解获得的壳多糖的纯度高度依赖于所使用的预处理方法。因此，当仅在酶促水解之前进行研磨时，该方法仅导致48%的纯度，而压榨步骤或用氧化剂处理角质层的添加使得能够获得50-78%的纯度。最后，将压榨步骤与用氧化剂处理角质层组合使得能够获得纯度88%的壳多糖。
产生于将压榨步骤与用氧化剂处理角质层的步骤组合的协同效应
下表2概括了图7中呈现示的结果。
单独的研磨 研磨+压榨 H2O2+研磨 H2O2+研磨+压榨
所获得的壳多糖的纯度 48% 78% 50% 88%
相对于单独的研磨在壳多糖纯度中的改善 - + 63% + 4% + 83%
表2：根据所使用的预处理方法在壳多糖的纯度中的改善
表2证实了将压榨步骤和用氧化剂处理步骤组合的协同效应。
实施例6：根据所使用的制备方法表征水解产物和壳多糖
I. 材料与方法
a）材料
昆虫
研究了各种昆虫：
- 鞘翅目：黄粉虫（黄粉虫或TM），
- 鳞翅目：蜡螟（蜡螟或GM），
- 双翅目：黑水虻（黑水虻或HI），和
- 直翅目：家蟋蟀（家蟋蟀或AD）。
酶
在水解步骤中使用各种酶。
酶促活性的这种测量基于在通过蛋白水解酶的酪蛋白水解期间在275 nm处的酪氨酸释放的测量原理（通过Karen PRATT的Valley Research SAPU Assay方法）。
SAPU/g = 蛋白酶的一个分光光度计单位
ΔA = 相关吸光度
i = 在原点处的y轴
11 = 最终反应体积
M = 校正曲线的斜率
30 = 反应时间（分钟）
C = 所加入的酶溶液中的酶浓度（g/mL）
1 = 所加入的酶溶液的1 mL体积
校正曲线通过测量在磷酸盐缓冲液（0.2 M，pH 7）中不同浓度的酪氨酸溶液的吸光度而获得。
使5 mL酪蛋白溶液（0.7% w/v，磷酸盐缓冲液0.2 M，pH 7，在90℃下加热30分钟并且具有加入的3.75 g/L溶液）与待测试的1 mL酶溶液（在100 mL甘氨酸缓冲液中0.15 g，0.05M）一起在37℃下温育30分钟。随后加入5 mL TCA溶液（18 g TCA，11.35 g无水乙酸钠，21mL冰乙酸，用脱矿物质的水补足为1升溶液），在涡旋下混合，过滤并测量在275 nm处的吸光度。
对照相同制备但不添加酶，而是加入1 mL脱矿物质的水以便具有相同的反应体积。
因此对于所使用的各种酶（Prolyve NP、Novozyme 37071、中性蛋白酶和Sumizyme）测量的活性列于表3中。
表3. 所使用的酶的活性和酶质量的对应关系。
b）生产方法
仅使用研磨的生产方法（在图中指示为“研磨”）
将600 g新鲜昆虫（在黄粉虫、蜡螟或黑水虻的情况下的幼虫；在家蟋蟀的情况下的蟋蟀）引入腔室内，在其中它们用蒸汽杀死（115℃，5分钟）。随后将昆虫引入混合器内，并且加入75 mL水/100 g昆虫，随后将整体混合。随后将因此获得的100 g（湿重）的产物引入配备有冷凝器和机械搅拌器的三颈烧瓶内，随后加入具有等价于3789 SAPU的活性的蛋白水解酶。随后将反应混合物加热至45℃共4小时。随后将温度升高到90℃共15分钟，并且最后过滤反应混合物（0.40-0.45 μm）。残余物在70℃下干燥24小时：这因此是通过纯化的酶促途径获得的壳多糖；将滤液冷冻且冻干：这因此是水解产物。
无论研究何种昆虫或酶，方法是相同的。
使用研磨随后为压榨的生产方法（图中指示为“研磨+压榨”）
将600 g新鲜昆虫（在黄粉虫、蜡螟或黑水虻的情况下的幼虫；或在家蟋蟀的情况下的蟋蟀）引入腔室内，在其中用蒸汽（115℃，5分钟）杀死它们。随后将昆虫引入混合器内，并且加入75 mL水/100 g昆虫，随后将整体混合且压榨（双螺杆压榨机、或压滤机或其他压榨系统）。随后将因此获得的100 g（湿重）的产物引入配备有冷凝器和磁力搅拌器的三颈烧瓶内，加入500 mL水以及具有等价于3789 SAPU的活性的蛋白水解酶。随后将反应混合物在45℃下加热4小时。随后将温度升高到90℃共15分钟，并且最后过滤反应混合物（0.40-0.45 μm）。残余物在70℃下干燥24小时：这因此是通过纯化的酶促途径获得的壳多糖；将滤液冷冻且冻干：这因此是水解产物。
无论研究何种昆虫或酶，方法是相同的。
使用昆虫角质层的研磨和氧化处理的生产方法（图中指示为“研磨+ H2O2”）
将600 g新鲜昆虫（在黄粉虫、蜡螟或黑水虻的情况下的幼虫；或在家蟋蟀的情况下的蟋蟀）引入腔室内，在其中用水/ H2O2混合物（6%）的蒸气（115℃，5分钟）杀死它们。随后将昆虫引入混合器内，并且加入75 mL水/100 g昆虫，随后将整体混合。随后将因此获得的100 g（湿重）的产物引入配备有冷凝器和机械搅拌器的三颈烧瓶内，随后加入具有等价于3789SAPU的活性的蛋白水解酶。随后将反应混合物在45℃下加热4小时。随后将温度升高到90℃共15分钟，并且最后过滤反应混合物（0.40-0.45 μm）。残余物在70℃下干燥24小时：它因此是通过纯化的酶促途径获得的壳多糖；将滤液冷冻且冻干：这因此是水解产物。
无论研究何种昆虫或酶，方法是相同的。
使用研磨、昆虫角质层的氧化处理和压榨的生产方法（图中指示为“研磨+H2O2+压 榨”）
将600 g新鲜昆虫（在黄粉虫、蜡螟或黑水虻的情况下的幼虫；或在家蟋蟀的情况下的蟋蟀）引入腔室内，在其中用水/ H2O2混合物的蒸气（115℃，5分钟）杀死它们。随后将昆虫置于混合器内，并且加入75 mL水/100 g昆虫，随后将整体混合且压榨（双螺杆压榨机、或压滤机或其他压榨系统）。随后将因此获得的100 g（湿重）的产物引入配备有冷凝器和磁力搅拌器的三颈烧瓶内，随后加入500 mL水以及具有等价于3789 SAPU的活性的蛋白水解酶。随后将反应混合物在45℃下加热4小时。随后将温度升高到90℃共15分钟，并且最后过滤反应混合物（0.40-0.45 μm）。残余物在70℃下干燥24小时：这因此是通过纯化的酶促途径获得的壳多糖；将滤液冷冻且冻干：这因此是水解产物。
无论研究何种昆虫或酶，方法是相同的。
c）分析
灰分含量的测量
灰分含量通过基于日期为27-01-2009的EC Regulation 152/2009的方法确定。
蛋白质含量的测量
蛋白质含量通过Dumas法获得，转换因子为6.25，由标准NF EN ISO 16634-1改编。
脂质含量的测量
脂质含量通过由EC Regulation 152/2009 – 方法B – SN改编的方法获得。
胃蛋白酶消化率
胃蛋白酶消化率通过Directive 72/199/EC中描述的方法测量。
氨基酸的相对丰度
氨基酸的丰度通过衍生自日期为27-01-2009-SN的EC Regulation 152/2009的方法测定。色氨酸含量通过由日期为27-01-2009的EC Regulation 152/2009 – SN改编的方法分开测定。通过将每个氨基酸的含量与氨基酸含量相关联来计算相对丰度。
氨基酸含量
氨基酸含量通过将对于每种氨基酸（包括色氨酸）获得的各个值加在一起来确定。
重量分析纯度
通过比较获得的干燥残余物的重量相对于产生于化学提取的重量，确定重量分析纯度，后者在大约5%的初始干物质下进行评估。
比色纯度
通过使用ImageJ软件，根据三种颜色红色、绿色和蓝色（RGB）分析样品的照片来估计样品的颜色，它们的平均值表示对真实颜色的评价。采取通过Chitine 法国销售的对虾壳多糖样品作为标准（100%纯度），并且所生产样品的比色纯度计算为该颜色的百分比（样品颜色与标准颜色的比率）。
差异纯度
对于该测量，从绝对纯度（100%）的值中减去已知杂质（氨基酸、脂质和灰分）的量，以获得由差异估计的纯度值；即含有30%蛋白质、10%脂质和1%灰分的样品因此被指定为100-30-10-1 = 59%的纯度。
结晶度
根据WAXS（广角X射线散射）技术，在配备有Lynxeye XE检测器的Bruker D8 Advance仪器（A25 DaVinci设计）上进行测量。结果遵循Loelovich, M. Res. Rev.: J. Chem. 2014,3, 7-14中所述的方法加以解释。
II. 水解产物
a）灰分
对各种昆虫和不同酶研究了源于方法“研磨+ H2O2 +压榨”的水解产物的灰分含量。以按水解产物的重量计%所述的这些灰分含量显示于下表4中。
TM + Prolyve 2.3
TM + Sumizyme 2.5
TM + Novozyme 1.95
TM + 中性蛋白酶 2.6
HI + Prolyve 3.3
GM + Prolyve 2.4
AD + Prolyve 2.4
表4：水解产物的灰分含量 - 不同的昆虫和酶。
因此，对于所有测试的昆虫和酶，水解产物中的灰分含量<3.5%，并且即使对于天然具有低至中等灰分含量的昆虫，该含量也<3%。
b）蛋白质含量
对各种昆虫和不同酶研究了源于方法“研磨+ H2O2 +压榨”的水解产物中的蛋白质含量。以按水解产物的重量计%所述的这些含量显示于下表5中。
TM + Prolyve 81.2
TM + Sumizyme 80
TM + Novozyme 83.25
TM + 中性蛋白酶 85.1
HI + Prolyve 74.85
GM + Prolyve 76.6
AD + Prolyve 82.8
表5：水解产物中的蛋白质含量 - 不同的昆虫和酶。
对于所有测试的昆虫和酶，水解产物中的蛋白质含量> 74%，并且即使对于非飞行昆虫，该含量也≥80%。
c）脂质含量
对各种昆虫和不同酶研究了源于方法“研磨+ H2O2 +压榨”的水解产物中的脂肪含量。以按水解产物的重量计%所述的这些含量显示于下表6中。
TM + Prolyve 2.9
TM + Sumizyme 4.4
TM + 中性蛋白酶 2.7
HI + Prolyve 8.3
GM + Prolyve 9.5
AD + Prolyve 3
表6：水解产物中的脂质含量 - 不同的昆虫和酶。
将使用氧化剂的步骤和压榨步骤组合有助于显著降低水解产物中的脂质含量（图8）。因此，对于所有的昆虫，该含量小于10%，并且对于非飞行昆虫甚至小于5%。
d）消化率
该方法使得能够获得具有非常高的消化率水平的水解产物，> 93%，无论研究何种酶或昆虫（图9）。
e）氨基酸丰度
通过该方法获得的水解产物主要由氨基酸如丙氨酸、谷氨酸盐、天冬氨酸和酪氨酸，以及较少程度的缬氨酸、丝氨酸和甘氨酸组成，无论研究何种酶或昆虫（图10-16）。
III. 壳多糖
a）灰分
对各种昆虫和不同酶研究了源于方法“研磨+ H2O2 +压榨”的壳多糖的灰分含量。以按壳多糖的重量计%所述的这些灰分含量显示于下表7中。
TM + Prolyve 0.5
TM + Sumizyme 0.95
TM + Novozyme 0.75
TM + 中性蛋白酶 0.65
HI + Prolyve 2.3
GM + Prolyve 0.7
AD + Prolyve 2.35
表7：壳多糖的灰分含量 - 不同的昆虫和酶。
通过该方法获得的壳多糖中的灰分含量非常低，<2.5%，无论研究何种酶或昆虫。
此外，观察到加入压榨和氧化剂步骤对所获得的壳多糖中的灰分含量的引人注意的协同作用（图17）。因此，对于方法“研磨+ H2O2 +压榨”，存在脱矿物质化，相对于使用单独研磨的方法，所述脱矿物质化可以达到76.2%，针对对于方法“研磨+压榨”的仅66.7%和方法“研磨+ H2O2”的63.5%的脱矿物质化。
b）脂质含量
通过该方法获得的壳多糖中的脂质含量非常低，<6.5%，无论使用何种昆虫或酶（表8），并且在黄粉虫的情况下甚至<3.2%，无论使用何种酶。
TM + Prolyve 3.1
TM + Sumizyme 2.8
TM + Novozyme 2.05
TM + 中性蛋白酶 2.5
GM + Prolyve 6.3
AD + Prolyve 6
表8. 壳多糖中的脂质含量。
此外，观察到将氧化剂添加和压榨步骤组合的引人注意的协同作用（图18）。事实上，在这种情况下，观察到60-77%的脂质含量中的降低，针对在使用单独压榨的方法中的15-60%以及在具有单独的氧化剂添加的方法中的3-3.6%。
c）氨基酸含量和丰度
存在于壳多糖中的氨基酸含量相对较低，<46%，无论研究何种酶或昆虫（表9）。
TM + Prolyve 22.75
TM + Sumizyme 44.74
TM + Novozyme 45.45
TM + 中性蛋白酶 45.20
HI + Prolyve 12.97
GM + Prolyve 18.92
AD + Prolyve 45.56
表9. 壳多糖中存在的氨基酸含量。
可以说对于所有昆虫，丙氨酸、酪氨酸和脯氨酸，以及较少程度的缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸和丝氨酸是附着到壳多糖的主要氨基酸，其含量平均在总氨基酸的15%至35%之间（图19-25）。
d）重量分析纯度
因此获得的壳多糖的重量分析纯度>36%，无论何种昆虫，并且在黄粉虫的情况下甚至>40%，无论何种酶（图27和26）。
e）比色纯度
将添加氧化剂和压榨步骤组合促进所获得的产物的相对高的比色纯度，62-81%，无论使用何种酶或昆虫（图28和29）。
f）差异纯度
所获得的产物的差异纯度相对较高> 46%，无论考虑何种昆虫和酶，并且在黄粉虫的情况下甚至>51%，并且在黄粉虫+Prolyve的情况下，它甚至可以达到73%（图30）。
g）结晶度
用氧化剂的处理趋于使壳多糖更无定形（图31），无论研究何种昆虫。所获得的壳多糖的结晶度，即结晶和无定形面积的比率在0.19至0.58之间，并且在黄粉虫的情况下，甚至在0.45至0.58之间。

Claims (14)

1.壳多糖，其包含基于干物质的总重量按重量计小于或等于55%的氨基酸含量、基于干物质的总重量按重量计小于或等于3.5%的灰分含量、以及大于或等于35%的差异纯度或大于或等于44%的比色纯度。
2.水解产物，其包含基于干物质的总重量按重量计至少40%的蛋白质、基于干物质的总重量按重量计最大10%的灰分、以及小于50%的尺寸大于12,400 g/摩尔的水溶性蛋白质含量。
3.用于从昆虫角质层生产壳多糖和/或脱乙酰壳多糖的方法，其包括下述步骤：
（i）压榨所述昆虫角质层，随后
（ii）用蛋白水解酶酶促水解所述昆虫角质层，
用氧化剂处理所述角质层已在酶促水解之前进行。
4.根据权利要求3的方法，其包括在所述压榨步骤之前的研磨步骤。
5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于，用氧化剂处理所述角质层在所述研磨和/或压榨步骤之前、伴随着所述研磨和/或压榨步骤和/或在所述研磨和/或压榨步骤之后进行。
6.根据权利要求3至5中任一项的方法，其中所述蛋白水解酶是蛋白酶。
7.根据权利要求3至6中任一项的方法，其中所述氧化剂选自过氧化氢、高锰酸钾、臭氧和次氯酸钠。
8.根据权利要求3至7中任一项的方法，其包括在所述压榨和/或研磨步骤之前杀死所述昆虫的步骤。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述杀死昆虫的步骤是热烫步骤。
10.根据权利要求8或9的方法，其特征在于，用氧化剂处理所述角质层伴随着所述杀死步骤和/或在所述杀死步骤之后进行。
11.根据权利要求3至10中任一项的方法，其中所述一种或多种昆虫选自鞘翅目、鳞翅目、直翅目和双翅目。
12.用于从昆虫生产壳多糖的方法，其包括下述步骤：
a）杀死所述昆虫，
b）研磨所述昆虫，
c）压榨所述昆虫，
d）用蛋白水解酶酶促水解所述昆虫角质层，
e）回收所述壳多糖
在步骤d）之前用氧化剂处理所述昆虫角质层。
13.壳多糖，其可通过根据权利要求3至12中任一项的方法获得。
14.用于从昆虫生产脱乙酰壳多糖的方法，其包括下述步骤：
a）杀死所述昆虫，
b）研磨所述昆虫，
c）压榨所述昆虫，
d）用蛋白水解酶酶促水解所述昆虫角质层，
e）回收所述壳多糖，
f）所述回收的壳多糖的脱乙酰化，
g）回收所述脱乙酰壳多糖，
在步骤d）之前用氧化剂处理所述昆虫角质层。
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