CN114846148A - 使用两次酶促水解获得甲壳素和/或壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从昆虫角质层中获得甲壳素和/或壳聚糖的方法。更特别地，根据本发明的方法包括使用至少一种内肽酶对昆虫角质层进行第一次酶促水解，从水解介质中分离由第一次酶促水解产生的水解角质层，以及使用至少一种内肽酶(不包括外肽酶)对水解角质层进行第二次酶促水解。
Description
本发明涉及一种用于从昆虫角质层中获得甲壳素的方法。
“甲壳素”是指主要由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖单元组成的聚合物，所述单元任选地被氨基酸和/或肽取代。
众所周知，甲壳素是由生物界的许多物种合成的，特别是昆虫，因为甲壳素构成了昆虫外骨骼的3％至60％。
角质层是昆虫表皮分泌的外层(或外骨骼)。它一般由三层组成：上表皮、外表皮和内表皮。
昆虫是一种可再生且丰富的原料，因此从昆虫中提取甲壳素是非常有利的。
还已知甲壳素是壳聚糖的来源，该壳聚糖在甲壳素脱乙酰化后获得。
根据本发明，“壳聚糖”是指甲壳素的脱乙酰化产物。壳聚糖和甲壳素之间的通常界限是由乙酰化程度决定的：乙酰化程度低于50％的化合物称为壳聚糖，除此之外，乙酰化程度超过50％的化合物称为甲壳素。
甲壳素和壳聚糖有许多应用，特别是在食品、化妆品或医疗领域。
甲壳素通常通过化学或酶促方法获得，这些方法的目的是消除与甲壳素结合的蛋白质。酶促法的使用是尤其有利的，因为特别地，该方法允许甲壳素的结构尽可能保持接近其原始结构。
然而，通常使用的酶促法涉及反应时间长，并且不能令人满意地使甲壳素脱蛋白。
本发明诸位发明人所做的工作使得开发一种克服这些缺点的酶促提取方法成为可能。
因此，本发明涉及一种用于从昆虫角质层中获得甲壳素的方法，该方法包括：
-使用至少一种内肽酶对昆虫角质层进行第一次酶促水解，
-从水解介质中分离由第一次酶促水解产生的水解角质层，
-使用至少一种内肽酶(不包括外肽酶)对该水解角质层进行第二次酶促水解。
“昆虫”是指处于任何发育阶段的昆虫，例如成虫、幼虫或若虫阶段。
有利地，根据本发明优选的昆虫是鞘翅目、双翅目、鳞翅目、直翅目、膜翅目、网翅目(其中特别地，蜚蠊目属于网翅目，其中包括等翅目和螳螂目)、虫修目、半翅目、异翅目、蜉蝣目和长翅目或其混合物，优选鞘翅目、双翅目、鳞翅目、直翅目或其混合物，更优选鞘翅目。
优选地，双翅目属于短翅目亚目。
优选地，鳞翅目属于双孔亚目，更优选地属于螟蛾总科。
优选地，鞘翅目属于扁虫下目，特别是拟步甲科、瓢虫科、天牛科、椰象鼻虫科或其混合物。
更优选地，鞘翅目选自黄粉虫、黑菌虫、大麦虫、黑粉虫、赤拟谷盗、红棕象甲及其混合物，更优选地黄粉虫。
有利的是，昆虫角质层从上述昆虫物种的幼虫阶段获得。
“酶促水解”是指化学键被水破坏的化学反应，这种破坏由酶或酶组合物催化。
根据本发明，酶或酶组合物具有蛋白水解(蛋白酶)活性。
“肽酶”或“蛋白酶”是指能够切割肽链的肽键的酶。
名称或后缀“蛋白酶”和“肽酶”在整个本申请中可互换使用。
“内肽酶”是指能够切割肽链内部的肽键的肽酶，其因此优选地远离肽链的末端肽键(即位于肽链的C-或N-末端)起作用。
“外肽酶”是指一种酶，其作用机制使得可以仅切割肽链的末端肽键，从而导致氨基酸、二肽或三肽的释放。
有时市售的酶并不纯。因此，酶的选择意味着存在具有相同类型活性(例如其他类型的内肽酶)或甚至不同活性(例如外肽酶、脂肪酶)的其他酶(以较少量)。
因此，根据本发明，“内肽酶”或“外肽酶”是指主要酶分别是内肽酶或外肽酶。“主要酶”是指对其活性有需求的酶。更特别地，该活性由制造商在市售的产品中指定。该规范可以通过与产品相关的数据表(安全性、营销)中的指示来制定。
产品也可能是一种酶组合物，即几种主要酶的混合物。在这种情况下，酶中的每一种都由制造商在市售的产品中指定。
有利地，在根据本发明的方法的第一次和第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶是相同或不同的酶或蛋白水解酶组合物，排除除了蛋白水解酶之外的主要酶(由制造商指定)的存在，以促进蛋白水解活性。
有利地，在根据本发明的方法的第一次酶促水解中使用的至少一种内肽酶选自一种内肽酶、多种内肽酶的混合物以及一种或多种外肽酶和一种或多种内肽酶的混合物，优选地选自一种内肽酶和多种内肽酶的混合物，并且更优选地是一种内肽酶。
有利地，在第一次水解中使用的至少一种内肽酶选自丝氨酸内肽酶(EC/IUB3.4.21.XX)、半胱氨酸内肽酶(EC/IUB 3.4.22.XX)、天冬氨酸蛋白酶(EC/IUB 3.4.23.XX)、金属内肽酶(EC/IUB 3.4.24.XX)和苏氨酸内肽酶(EC/IUB 3.4.25.XX)。
优选地，在第一次水解中使用的至少一种内肽酶选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸蛋白酶和金属内肽酶，更优选丝氨酸内肽酶和金属内肽酶，甚至更优选丝氨酸内肽酶。
当仅在第一次水解中使用的至少一种内肽酶是呈一种或多种外肽酶和一种或多种内肽酶的混合物形式的酶组合物时，该一种或多种外肽酶选自氨肽酶(EC/IUB3.4.11.XX)、二肽酶(EC/IUB 3.4.13.XX)、二肽或三肽基肽酶(EC/IUB 3.4.14.XX)、肽基二肽酶(EC/IUB 3.4.15.XX)、丝氨酸羧肽酶(EC/IUB 3.4.16.XX)、金属羧肽酶(EC/IUB3.4.17.XX)、半胱氨酸羧肽酶(EC/IUB 3.4.18.XX)和ω肽酶(EC/IUB 3.4.19.XX)。
优选地，可以在第一次水解中使用的一种或多种外肽酶选自氨肽酶、二肽或三肽基肽酶和丝氨酸羧肽酶，更优选地氨肽酶。
例如，在第一次酶促水解中，当该至少一种内肽酶是酶组合物时，其是一种或多种外肽酶和一种或多种内肽酶的混合物，该内肽酶如上所述。
优选地，至少一种内肽酶是丝氨酸内肽酶、天冬氨酸蛋白酶和氨肽酶的混合物。
“从水解介质中分离”更特别地是指水解角质层的分离和回收。
有利地，由第一次酶促水解产生的水解角质层的分离通过离心、倾析或过滤，优选地通过过滤进行。
有利地，该过滤使用Büchner过滤器、压滤机、带式过滤器或筛滤器进行，优选地使用具有金属网的Büchner过滤器。
优选地，在该过滤中使用的过滤器的孔径或筛孔尺寸在4μm和800μm之间，更优选地40μm和550μm之间，甚至更优选地140μm和530μm之间，例如160μm。
应注意，在本申请的上下文中，除非另有说明，否则所指示的数值范围应理解为包括在内。
应当理解，在分离水解角质层的过程中，第一次酶促水解中使用的至少一种内肽酶(作为酶或酶组合物)随水解介质排出；因此，在第二次酶促水解过程中它不存在或以极少量存在。
第二次酶促水解使用至少一种内肽酶，不包括外肽酶。
类似地，“至少一种内肽酶，不包括外肽酶”是指如上定义的内肽酶，条件是第二次水解不包含外肽酶，即至少一种内肽酶是内肽酶或者是不包含外肽酶的酶组合物。
优选地，参与该第二次酶促水解的至少一种内肽酶是一种内肽酶或多种内肽酶的混合物，更优选地一种内肽酶。
更特别地，在根据本发明的方法中，用于所述第二次酶促水解的所述至少一种内肽酶是选自以下的一种内肽酶或多种内肽酶的混合物：丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸蛋白酶、金属内肽酶和苏氨酸内肽酶。
优选地，用于所述第二次酶促水解的所述至少一种内肽酶是选自以下的一种内肽酶或多种内肽酶的混合物：丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸蛋白酶和金属内肽酶。
更优选地，在第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶是选自以下的一种内肽酶或多种内肽酶的混合物：丝氨酸内肽酶和金属内肽酶。
特别地，在根据本发明的方法中，用于所述第二次酶促水解的至少一种内肽酶是一种丝氨酸内肽酶或多种丝氨酸内肽酶的混合物，和/或一种金属内肽酶或多种金属内肽酶的混合物，每种丝氨酸内肽酶选自由枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶组成的组，每种金属内切蛋白酶选自由枯草杆菌金属蛋白酶和嗜热菌蛋白酶组成的组。
更特别地，在第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶更优选是丝氨酸内肽酶和/或金属内肽酶，丝氨酸内肽酶是枯草杆菌蛋白酶，并且金属内肽酶是枯草杆菌金属蛋白酶。
最后，还更优选地，在第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶是选自丝氨酸内肽酶的内肽酶。
在第一和第二水解步骤中使用的内肽酶可以是相同的，例如相同的丝氨酸内肽酶或相同的金属内肽酶。
根据具体的实施例，在第一次酶促水解中使用的至少一种内肽酶包含丝氨酸内肽酶，并且优选地是丝氨酸内肽酶，并且在第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶也是丝氨酸内肽酶，该丝氨酸内肽酶的组有利地如下所述。
在根据本发明的方法中，用于任何水解步骤的丝氨酸内肽酶有利地选自由以下组成的组：枯草杆菌蛋白酶(EC/IUB 3.4.21.62)、胰凝乳蛋白酶(EC/IUB 3.4.21.1)、胰蛋白酶(EC/IUB 3.4.21.4)、曲霉碱性蛋白酶(oryzin)(EC/IUB 3.4.21.63)、谷氨酰内肽酶(EC/IUB 3.4.21.19)、链霉素A(EC/IUB 3.4.21.80)和/或链霉素B(EC/IUB 3.4.21.81)，优选地枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶和/或曲霉碱性蛋白酶，更优选地枯草杆菌蛋白酶和/或胰蛋白酶，甚至更优选地枯草杆菌蛋白酶。
类似地，用于任何水解步骤的半胱氨酸内肽酶有利地选自由以下组成的组：菠萝蛋白酶(EC/IUB 3.4.22.32)和/或木瓜蛋白酶(EC/IUB 3.4.22.2)，优选地菠萝蛋白酶。
类似地，用于任何水解步骤的天冬氨酸蛋白酶有利地是曲霉胃蛋白酶I(aspergillopepsin I)(EC/IUB 3.4.23.18)。
类似地，用于任何水解步骤的金属内切蛋白酶有利地选自由以下组成的组：枯草杆菌金属蛋白酶(EC/IUB 3.4.24.28)、嗜热菌蛋白酶(EC/IUB 3.4.24.27)、胶原酶I(EC/IUB 3.4.24.3)、弧菌溶血素(EC/IUB 3.4.24.25)、假溶素(EC/IUB 3.4.24.26)、金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(aureolysin)(EC/IUB 3.4.24.29)、球菌溶素(coccolysin)(EC/IUB3.4.24.30)、霉菌溶素(mycolysin)(EC/IUB 3.4.24.31)、β-裂解金属内肽酶(EC/IUB3.4.24.32)、deuterolysin(EC/IUB 3.4.24.39)和/或沙雷氏菌溶素(serralysin)(EC/IUB3.4.24.40)，优选地枯草杆菌金属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和/或胶原酶I，更优选地枯草杆菌金属蛋白酶和/或嗜热菌蛋白酶，还更优选地枯草杆菌金属蛋白酶。
有利地，在第一次水解步骤中使用的氨肽酶是亮氨酰氨肽酶(EC/IUB 3.4.11.1)。
有利地，在根据本发明的方法的任何酶促水解步骤中使用的至少一种内肽酶是细菌、真菌、动物和/或植物来源的，优选地细菌和/或真菌来源，更优选地细菌来源。
例如，该至少一种植物来源的内肽酶是菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶，优选地菠萝蛋白酶。特别地，该至少一种植物来源的内肽酶可以来自凤梨或番木瓜。
例如，该至少一种动物来源的内肽酶是胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶，更优选地胰蛋白酶。特别地，该至少一种动物来源的内肽酶可以来自猪胰腺(家猪)。
例如，该至少一种真菌来源的内肽酶是曲霉碱性蛋白酶和/或亮氨酰氨肽酶和/或曲霉胃蛋白酶I，优选地曲霉碱性蛋白酶或曲霉碱性蛋白酶、亮氨酰氨肽酶和曲霉胃蛋白酶I的混合物，更优选地曲霉碱性蛋白酶、亮氨酰氨肽酶和曲霉胃蛋白酶I的混合物。特别地，该至少一种真菌来源的内肽酶可以来自曲霉属，更特别地米曲霉或链霉菌，更特别地灰色链霉菌，优选地来自米曲霉。
例如，该至少一种细菌来源的内肽酶是枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌金属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶I或其混合物，优选地枯草杆菌蛋白酶和/或枯草杆菌金属蛋白酶，更优选地枯草杆菌蛋白酶。特别地，该至少一种细菌来源的内肽酶可以来自芽孢杆菌或溶组织梭菌，优选地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌，更优选来自地衣芽孢杆菌。
特别地，在根据本发明的方法中，该用于第二次酶促水解的至少一种内肽酶是细菌来源的。
有利地，根据本发明的方法的酶或酶组合物选自下表1的市售酶：
[表1]
*由供应商声明
优选地，在根据本发明的方法的第一次水解中使用的至少一种内肽酶选自Promod439L、Novo-Pro D、Novozym 37071、碱性蛋白酶2.5L PF和Sumizyme LP，更优选地Promod439L、碱性蛋白酶2.5L PF和Sumizyme LP。
优选地，在根据本发明的方法的第二次水解中使用的至少一种内肽酶选自Promod439L、Novo-Pro D、Novozym 37071和碱性蛋白酶2.5L PF，更优选地Promod 439L和碱性蛋白酶2.5L PF。
根据特别优选的实施例，在第一次酶促水解中使用的至少一种内肽酶是细菌或真菌来源的，并且在第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶是细菌来源的。
在该实施例中，水解步骤中使用的每种至少一种内肽酶有利地是上述那些中的一种。
因此，根据该实施例，在第一次酶促水解中使用的至少一种内肽酶优选是枯草杆菌蛋白酶，或曲霉碱性蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶和曲霉胃蛋白酶I的混合物，或枯草杆菌金属蛋白酶，更优选地枯草杆菌蛋白酶，并且在第二次酶促水解中使用的至少一种内肽酶优选是枯草杆菌蛋白酶或枯草杆菌金属蛋白酶，更优选地枯草杆菌蛋白酶。
在根据本发明的方法的水解步骤中使用的至少一种内肽酶(酶或酶组合物)的热灭活可以在任何酶促水解步骤之后进行。有利地，在第二次酶促水解之后仅进行一次热灭活。
优选地，该热灭活通过将水解介质加热至80℃至105℃，例如85℃，持续10至30分钟，更优选地15至20分钟来进行。
有利地，将在根据本发明的方法的第二次酶促水解结束时获得的反应介质加热到以下温度：大于70℃、优选地大于75℃、更优选地大于80℃，例如85℃，以将至少一种内肽酶灭活。
有利地，根据本发明的方法进一步包括在第一次酶促水解之前研磨昆虫角质层的步骤。
优选地，在水的存在下研磨昆虫角质层，更优选地角质层与水的重量比在1∶5和1∶7之间，例如1∶6。
在整个本申请中，水优选是自来水。
优选地，研磨步骤使得有可能将昆虫角质层的尺寸减小到在0.5mm和10mm之间、更优选地1.0和7mm之间、还更优选地1.0和5mm之间，例如1.0和2.0mm之间。
该研磨步骤特别使得有可能提高水解步骤的效率并因此缩短这些步骤的持续时间。
有利地，昆虫角质层的研磨步骤用绞肉机、锤磨机、刀片磨机、刀磨机和/或分散机进行，优选地用刀磨机例如Thermomix。
有利地，在研磨步骤之后和第一次酶促水解之前用水洗涤昆虫角质层。该步骤促进了未与角质层结合的蛋白质的去除。
有利地，通过过滤收集这些经洗涤的昆虫角质层，优选地使用Büchner过滤器、压滤机、带式过滤器或筛滤器进行，优选地使用具有金属网的Büchner过滤器。
优选地，该过滤器的孔径或筛孔尺寸在4μm和800μm之间，更优选地40μm和550μm之间，还更优选地140μm和530μm之间。
有利地，经洗涤的角质层在其收集之后通过过滤步骤进行按压以去除多余的水。优选地，按压所述角质层以获得相对于角质层的总重量，按重量计在35％和65％之间、更优选地按重量计在45％和55％之间的干物质含量。
本领域技术人员知道该按压步骤使用哪种类型的按压机，例如来自Angel的Angelia 7500按压机。
可以在第一次酶促水解步骤之前冷冻经按压的昆虫角质层。
有利地，通过将昆虫的角质层与柔软部分分离的步骤获得根据本发明的方法的昆虫角质层。
“柔软部分”是指昆虫的肉(特别包括肌肉和内脏)和肉汁(特别包括体液、水和血淋巴)。特别地，该柔软部分不包含昆虫的肉汁。
将角质层与柔软部分分离的这一步骤通常在杀死昆虫的步骤之前进行，该步骤可以有利地通过热冲击(例如通过热烫或通过漂烫)来进行。
对于热烫，昆虫，优选地幼虫，因此用水烫2至20分钟、优选地5至15分钟。优选地，水的温度为87℃至100℃、优选地92℃至95℃。
热烫时添加的水的量确定如下：水的体积(以ml计)与昆虫的重量(以g计)的比率优选地在0.3和10之间、更优选地0.5和5之间、甚至更优选地0.7和3之间、并且还更优选地大约1。
对于漂烫，昆虫，优选地幼虫，在以下温度下用水或蒸汽(蒸汽喷嘴或床)漂烫：80℃和105℃之间，优选地87℃和105℃之间，更优选地95℃和100℃之间，还更优选地98℃，或在以下温度下用水漂烫：90℃和100℃之间，优选地92℃和95℃之间(通过喷嘴)，或在以下温度下以混合模式(水+蒸汽)漂烫：80℃和130℃之间、优选地90℃和120℃之间、更优选地95℃和105℃之间、还更优选地98℃。当昆虫仅用蒸汽漂烫时，漂烫有利地在强制蒸汽漂烫机中进行。在漂烫室中的停留时间在5秒至15分钟之间、优选地1至7分钟之间。
有利地，在杀灭步骤之后，昆虫直接用于执行将昆虫的角质层与柔软部分分离的步骤，即昆虫在这两步骤之间不经过任何处理，例如研磨、冷冻或脱水。
优选地，将昆虫的角质层与柔软部分分离的该步骤使用压滤机或带式分离器进行，更优选地使用带式分离器。
术语“带式分离器”是指具有挤压带(或压带)和穿孔滚筒的装置。
挤压带允许昆虫输送至穿孔滚筒并施加在穿孔滚筒上，从而使昆虫的柔软部分通过压力通过滚筒的穿孔，而角质层留在滚筒外面。
然后可以用刮刀回收角质层并任选地冷冻。
例如，可以提及来自巴德尔公司(Baader)的带式分离器，例如带式分离器601至607(“软分离器601至607”)或例如来自BFD公司的
带式分离器(410至4000V范围)。
有利地，滚筒的穿孔直径在0.5和3mm之间，优选地1和2mm之间。
关于压力，本领域技术人员能够确定待施加的压力，从而能够将昆虫的角质层与柔软部分分离。
该分离昆虫的步骤不同于可以用例如单螺杆或双螺杆按压机进行的常规按压，因为该步骤允许昆虫的柔软部分与角质层(干净)分离，而不是肉汁与固体部分的分离。
特别地，角质层与柔软部分的分离是在不进行昆虫(尤其是颗粒形式的昆虫)的任何预先研磨步骤的情况下进行的。
有利地，根据本发明的方法的水解步骤的总时间少于6小时。
“水解步骤的总时间”是指第一和第二水解步骤的反应时间的总和。
通常，对于每次水解，水解反应时间可以定义为从将至少一种内肽酶添加到水解介质中到将水解介质与水解的角质层分离的步骤或水解介质失活所经过的时间。
优选地，水解步骤的总时间为2小时至5小时30分钟之间、更优选地3小时至5小时之间、甚至更优选地4小时。
有利地，每个水解步骤的持续时间为30分钟至4小时之间、优选地1小时至3小时之间、更优选地1小时30分钟至2小时30分钟之间，例如等于2小时。
有利地，在根据本发明的方法中使用的所述至少一种内肽酶的总量以干重计为10U至500U/克昆虫角质层。
应当理解，在整个本申请的上下文中，“U”，也称为酶单位，表示在37℃和pH 7.5下在一分钟内(从酪蛋白)释放一微摩尔酪氨酸所需的酶量。
“所述至少一种内肽酶的总量”是指在根据本发明的方法的第一次和第二次酶促水解中引入的至少一种内肽酶的量的总和，这些量以如在上段确定的酶单位表示。
优选地，在根据本发明的方法中使用的所述至少一种内肽酶的总量以干重计为10U至500U/克昆虫角质层、更优选地20U和150U/克昆虫角质层、还更优选地30U和60U/克昆虫角质层，例如40U/克昆虫角质层。
有利地，在第一次U-水解中使用的至少一种内肽酶的量/克昆虫角质层(以干重计)与在第二次U-水解中使用的至少一种内肽酶的量/克昆虫角质层(以干重计)的比率在0.5和10之间、优选地0.8和5之间、更优选地1和2之间，例如约1。
有利地，每次酶促水解的温度在35℃和70℃之间、优选地45℃和60℃之间。
表2总结了观察到的表1市售酶的来源和酶活性。此外，指出了当用于根据本发明的方法时与每种酶相关的特别优选的酶促水解温度。
[表2]
有利地，根据本发明的方法的酶促水解步骤在水的存在下以以下的水(以g计)/角质层(以g计)的比率且基于干重进行：在5和50之间、优选地10和40之间、更优选地15和30之间、还更优选地20和25之间，例如大约22。
有利地，酶促水解步骤的pH在6和9之间、优选地6.5和7.5之间、更优选地6.8和7.3之间。
有利地，根据本发明的方法进一步包括收集由第二次酶促水解产生的水解角质层的步骤。优选地，该收集步骤通过离心、倾析或过滤进行，更优选地通过过滤进行。
有利地，该过滤步骤使用Büchnr过滤器、压滤机、带式过滤器或筛滤器进行，更优选地使用具有金属网的Büchner过滤器。
优选地，在该过滤中使用的过滤器的孔径或筛孔尺寸在4μm和800μm之间、更优选地40μm和550μm之间、还更优选地140μm和530μm之间。
因此，本发明更特别地涉及一种用于从昆虫角质层中获得甲壳素的特别方法，该方法包括：
-将昆虫的角质层与柔软部分分离的步骤，
-研磨昆虫角质层的步骤，
-使用至少一种内肽酶对研磨的昆虫角质层进行第一次酶促水解，
-从水解介质中分离由第一次酶促水解产生的水解角质层，
-使用至少一种内肽酶(不包括外肽酶)对该水解角质层进行第二次酶促水解。
-对所使用的所述至少一种内肽酶进行热灭活，
-收集由第二次酶水解产生的水解角质层的步骤。
该特别方法的步骤有利地如上所述，包括实施例。特别地，在第一次水解中使用的至少一种内肽酶是丝氨酸内肽酶，金属内肽酶，或丝氨酸内肽酶、天冬氨酸蛋白酶和氨肽酶的混合物，并且在第二次水解中使用的至少一种内肽酶特别是丝氨酸内肽酶或金属内切蛋白酶。
由第二次酶促水解产生的水解角质层是甲壳素。然而，该甲壳素的纯度对于某些应用可能不令人满意。
因此，为了获得纯化的甲壳素，对于根据本发明的方法可能有利的是在第二次水解之后进一步包括化学处理步骤。
有利地，化学处理用强碱进行。
有利地，强碱选自氢氧化钠或苏打、氢氧化钾和氢氧化铵。优选地，强碱是氢氧化钠或氢氧化钾，更优选氢氧化钠。
优选地，用于化学处理的碱呈碱性水溶液的形式。在该情况下，碱在水溶液中的摩尔浓度有利地在0.1和4mol.L-1之间、优选地0.5和2mol.L-1之间、还更优选地等于1mol.L-1。
化学处理有利地持续进行以下时间：5和60小时之间、优选地15和25小时之间，例如19小时。
因此，通过使得减少水解角质层表面上的蛋白质残留量成为可能，根据本发明的方法还具有缩短化学处理时间的优点。
有利地，碱性处理在以下的温度下进行：70℃和120℃之间、优选地80℃和100℃之间、更优选地大约90℃。
有利地，根据本发明的方法进一步包括收集由化学处理步骤产生的纯化的甲壳素的步骤。优选地，该收集步骤通过离心、倾析或过滤进行，更优选地通过过滤进行。
优选地，该过滤步骤使用Büchnr过滤器、压滤机、带式过滤器或筛滤器进行，更优选地使用筛滤器。
优选地，在该过滤中使用的过滤器的孔径或筛孔尺寸在4μm和800μm之间、更优选地40μm和550μm之间、还更优选地140μm和530μm之间。
任选地，根据本发明的方法进一步包括洗涤纯化的甲壳素的步骤。
该任选的洗涤纯化的甲壳素的步骤有利地用自来水、优选地温水(即具有在15℃和60℃之间的温度)进行。
优选地，对纯化的甲壳素进行洗涤直到pH被中和。
任选地，根据本发明的方法进一步包括干燥纯化的甲壳素的步骤。
该任选的干燥纯化的甲壳素的步骤有利地在40和105℃之间、优选地约60℃的温度下进行。
纯化的甲壳素的干燥步骤有利地进行如下时间：10和80小时之间、优选地约24小时。
有利地，纯化的甲壳素的干燥使用干燥炉进行，例如来自宾德公司
的FED 115或FP53型号。
本发明还涉及一种用于获得壳聚糖的方法，该方法包括一种用于获得如上所述的根据本发明的甲壳素的方法，并且进一步包括使甲壳素脱乙酰化的步骤。
有利地，甲壳素的脱乙酰化是用强碱进行的。
优选地，强碱选自氢氧化钠或苏打、氢氧化钾和氢氧化铵。优选地，强碱是氢氧化钠或氢氧化钾，还更优选氢氧化钠。
优选地，用于碱处理的碱呈碱性水溶液的形式，优选地浓缩的碱性水溶液。
在该情况下，碱在水溶液中的摩尔浓度有利地在6和25mol.L-1之间、优选地在8和19mol.L-1之间、更优选地在10和19mol.L-1之间、还更优选地在12和19mol.L-1之间。
优选地，脱乙酰化进行1至24小时、并且优选地2至18小时。
有利地，该脱乙酰化分两个阶段进行，具有中间pH中和步骤。例如，脱乙酰化可以在两个小时内进行，进行两次(即持续4小时)，具有中间pH中和步骤。
脱乙酰化温度有利地在80℃和150℃之间、优选地90℃和120℃之间并且更优选地在100℃。
有利地，用于获得根据本发明的壳聚糖的方法进一步包括壳聚糖收集的步骤。优选地，该收集步骤通过离心、倾析或过滤进行，更优选地通过过滤进行。
优选地，该过滤步骤使用Büchnr过滤器、压滤机、带式过滤器或筛滤器进行，更优选地使用筛滤器。
优选地，在该过滤中使用的过滤器的孔径或筛孔尺寸在4μm和800μm之间、更优选地40μm和550μm之间、还更优选地140μm和530μm之间。
任选地，用于获得根据本发明的壳聚糖的方法进一步包括洗涤壳聚糖的步骤。
该任选的洗涤壳聚糖的步骤有利地用自来水、优选地温水(即具有在15℃和60℃之间的温度)进行。
优选地，进行壳聚糖的洗涤直到pH中和。
任选地，用于获得根据本发明的壳聚糖的方法进一步包括干燥壳聚糖的步骤。
该任选的干燥壳聚糖的步骤有利地在40℃和105℃之间、优选地约60℃的温度下进行。
壳聚糖干燥步骤有利地进行如下的时间段：10至80小时之间、优选地约24小时。
有利地，壳聚糖的干燥使用干燥炉进行，例如来自宾德公司
的FED115或FP53型号。
本发明通过以下实例和附图以非限制性方式进行说明：
-[图1]图1是表示黄粉虫(Tenebrio molitor)角质层的残留蛋白质含量(以蛋白质毫克数/克固体残留物计)随使用碱性蛋白酶2.5L PF的酶促水解的三种不同提取方法变化的图。
-[图2]图2是表示黄粉虫(Tenebrio molitor)角质层的残留蛋白质含量(以蛋白质毫克数/克干固体残留物计)随使用不同丝氨酸内肽酶的酶促水解的两种不同提取方法(同时或顺序+过滤)变化的图。
-[图3]图3是表示根据使用不同金属内肽酶进行酶促水解的两种不同提取方法(同时或顺序+过滤)的黄粉虫(Tenebrio molitor)角质层的残留蛋白质含量(以蛋白质毫克数/克干固体残留物计)的图。
-[图4]图4是表示根据用仅包含外肽酶(ProteAX)的蛋白酶和/或仅包含丝氨酸内肽酶(碱性蛋白酶2.5L PF)的蛋白酶实施酶促水解的两种不同提取方法(同时或顺序+过滤)的黄粉虫(Tenebrio molitor)角质层的残留蛋白质含量(以蛋白质毫克数/克干固体残留物计)的图。
-[图5]图5是表示根据用包含内肽酶和外肽酶(Sumizyme LP)的混合物的蛋白酶和/或仅包含丝氨酸内肽酶(Promod 439L或碱性蛋白酶2.5L PF)的蛋白酶进行酶促水解的两种不同提取方法(同时或顺序+过滤)的黄粉虫(Tenebrio molitor)角质层的残留蛋白质含量(以蛋白质毫克数/克干固体残留物计)的图。
实例1：获取地面昆虫角质层
将已接受基于谷物副产品(麦麸型)饮食的黄粉虫(Tenebrio molitor)活幼虫在带穿孔(1mm)的带上以2至10cm之间的厚度的层输送到漂烫室。然后将幼虫用92℃的水(喷嘴)漂烫5分钟。漂烫后幼虫的温度在75℃和92℃之间。
漂烫后，将幼虫输送到带式分离器(来自巴德尔公司的带式分离器601)的进料斗，以便将幼虫的角质层与柔软部分分离。滚筒穿孔的直径为1.3mm。杀死后立即进行分离，使幼虫没有时间冷却至室温。将昆虫的柔软部分收集在箱中，并使用刮刀收集角质层。
然后使用Thermomix Vorwerk在速度10下在水的存在下(以1∶6的角质层与水的重量比，例如1200mL水与200g角质层)研磨角质层1分钟，导致研磨的角质层尺寸为约1-2mm。然后将它们在Büchner上用筛孔尺寸为500μm的金属过滤器过滤，并用水(与研磨所用的水体积相同，即在该实例中为1200mL水)洗涤。
最后，按压(Angelia 7500，安捷利公司(Angel))洗涤的角质层以去除多余的水分，从而获得以重量计52％±5的干物质含量。
实例2：过滤在用细菌来源蛋白酶-碱性蛋白酶2.5L PF进行的两次酶提取之间的
效果
碱性蛋白酶25L PF是一种源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)且由诺维信(Novozymes)市售的丝氨酸内肽酶。
使用三种不同的方法将总共260U碱性蛋白酶25L PF添加到根据实例1中描述的方法获得的86g研磨的角质层(湿重)和86g自来水的混合物中。在这三种方法中添加蛋白酶前反应介质的pH为73。三种方法均在55℃的温度下进行，结果如图1所示：
-“碱性蛋白酶1X”：单次添加260U碱性蛋白酶，且水解反应5小时。
-“碱性蛋白酶/碱性蛋白酶无过滤”：添加130U碱性蛋白酶，第一次水解2小时，再添加130U碱性蛋白酶，且第二次水解3小时。
-“碱性蛋白酶/碱性蛋白酶”：添加130U碱性蛋白酶，第一次水解2小时，然后过滤反应介质(具有160μm金属网的Büchner过滤器)。然后将回收的角质层与86g自来水混合并且再次添加130U碱性蛋白酶，然后进行第二次水解3小时。
在85℃使酶失活15分钟后，过滤反应介质(具有160μm金属网的Büchner过滤器)。
通过BCA(二辛可宁酸含量测定)方法使用2mg干固体残留物测定残留蛋白质含量。将由BCA方法获得的反应介质在分光光度计测量之前用水稀释，其中稀释倍数为4。
因此，对于添加的相同总量的蛋白酶，与单次水解(分别为41mg和38mg残留蛋白质/克固体残留物)相比，当连续进行两次水解且不进行过滤时，去蛋白的效率略低。
然而，当连续进行两次水解并且在两次水解之间进行过滤时，与单次进行的水解相比，脱蛋白程度显著增加(分别为31mg和38mg残留蛋白质/克固体残留物)。
因此，两次连续水解之间的过滤步骤具有提高昆虫角质层脱蛋白程度的作用，从而提高所得甲壳素的纯度。
实例3：根据本发明的方法和比较方法-丝氨酸内肽酶
本实例3中使用的丝氨酸内肽酶是枯草杆菌蛋白酶和胰酶。枯草杆菌蛋白酶来自两个不同的供应商：碱性蛋白酶2.5L PF(诺维信)和Promod 439L(生物催化公司)，且源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。胰酶来自西格玛奥德奇(Sigma-A1drich)并且源自家猪(Sus scrofa domesticus)。
使用了两种不同的方法：同时(比较方法)和顺序+过滤(根据本发明的方法)，其结果呈现于图2中。
·同时法
将蛋白酶添加到根据实例1中描述的方法获得的2g研磨的角质层(干重)与39.8gpH 7.3的自来水的混合物中。
通过向角质层和水的混合物中添加总共40U的一种或多种蛋白酶/克角质层(干重)进行同时方法，反应时间为4小时，且温度取决于所使用的蛋白酶。
碱性蛋白酶2.5L PF/碱性蛋白酶2.5L PF：40U碱性蛋白酶2.5L PF/克角质层(干重)且在55℃的温度下的单一水解步骤。
Promod439L/Promod439L：用40U Promod439L/克角质层(干重)且在57℃的温度下进行单一水解步骤。
碱性蛋白酶2.5L PF/Promod 439L：用20U碱性蛋白酶2.5L PF/克角质层(干重)和20U Promod 439L/克角质层(干重)且在56℃的温度下进行单一水解步骤
胰酶/胰酶：用40U胰酶/克角质层(干重)且在45℃的温度下进行单一水解步骤。
·顺序法+过滤
将蛋白酶添加到根据实例1中描述的方法获得的2g研磨且洗涤的角质层(干重)与39.8g pH7.3的自来水的混合物中。
还通过向角质层和水的混合物中添加总共40U蛋白酶/克角质层(干重)进行顺序+过滤方法，总反应时间为4小时，且温度取决于所使用的蛋白酶。然而，在该方法中，用20U蛋白酶/克角质层(干重)进行第一次水解持续2小时，然后过滤水解介质(160μm筛孔)；然后将回收的水解角质层再次与39.8g pH为7.3的自来水混合，并再次用20U的蛋白酶/克角质层(干重)进行第二次水解持续2小时。
碱性蛋白酶2.5L PF/碱性蛋白酶2.5L PF：用20U碱性蛋白酶2.5L PF/克角质层(干重)在55℃的温度下第一次水解，然后过滤水解介质，并且用20U碱性蛋白酶2.5L PF/克角质层(干重)在55℃的温度下进行第二次水解。
Promod 439L/Promod 439L：用20U Promod 439L/克角质层(干重)在57℃的温度下第一次水解，然后过滤水解介质，并且用20U Promod 439L/克角质层(干重)在57℃的温度下第二次水解。
碱性蛋白酶2.5L PF/Promod 439L：用20U碱性蛋白酶2.5L PF/克角质层(干重)在55℃的温度下第一次水解，然后过滤水解介质，并且用20U Promod 439L/克角质层(干重)在57℃的温度下第二次水解。
胰酶/胰酶：用20U胰酶/克角质层(干重)在45℃的温度下第一次水解，然后过滤水解介质，并且用20U胰酶/克角质层(干重)在45℃的温度下第二次水解。
在两种方法(同时或顺序+过滤)中，蛋白酶随后在85℃下灭活15分钟，然后过滤反应介质(160μm筛孔大小)。
通过BCA(二辛可宁酸含量测定)方法使用2mg干固体残留物测定残留蛋白质含量。将由BCA方法获得的反应介质在分光光度计测量之前用水稀释，其中稀释倍数为4。
图2示出了当用蛋白酶进行两次连续水解并且在两次水解之间进行过滤(顺序+过滤)时，与单次水解(同时)相比，脱蛋白程度显著增加，这是针对三种测试的蛋白酶(参见碱性蛋白酶2.5L PF/碱性蛋白酶2.5L PF、Promod 439L/Promod 439L和胰酶/胰酶)，或针对交替的蛋白酶(参见碱性蛋白酶2.5L PF/Promod 439L)。
因此，在用丝氨酸内肽酶的两次水解之间的过滤步骤具有显著提高昆虫角质层脱蛋白程度的效果，从而提高所得甲壳素的纯度。
实例4：根据本发明的方法和比较方法-金属内肽酶
本实例4中使用的金属内肽酶是枯草杆菌金属蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。枯草杆菌金属蛋白酶是来自杜邦丹尼斯克公司的FoodPro PNL，并且源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。嗜热菌蛋白酶是来自德国AB酶制剂公司的Corolase 2TS并且源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
用这些金属内肽酶重复实例3的同时和顺序+过滤方法，并且对于FoodPro PNL的温度为50℃且对于Corolase 2TS的温度为60℃。结果呈现于图3。
图3示出了当使用FoodPro PNL或Corolase 2TS进行两次连续水解并且在两次水解之间进行过滤(连续+过滤)时，与单次水解(同时)相比，脱蛋白程度显著增加。
因此，在用金属内肽酶的两次水解之间的过滤步骤具有显著提高昆虫角质层脱蛋白程度的效果，从而提高所得甲壳素的纯度。
实例5：蛋白酶性质的影响：要求在每个水解步骤中存在内肽酶
为了研究内肽酶或外肽酶的性质对脱蛋白程度的影响，使用了主要包含氨肽酶(外肽酶)的蛋白酶(源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的ProteAX且由阿玛诺天野酶公司(Amano Enzyme)出售；供应商规定的IUB编号：3.4.11.1)，以及枯草杆菌蛋白酶(碱性蛋白酶2.5L PF)。
重复实例3的同时和顺序+过滤方法，结果如图4所示：
-ProteAX/ProteAX：温度为50℃。
-碱性蛋白酶2.5L PF/ProteAX：对于同时法，温度为52.5℃；对于顺序法，首先在55℃的温度下添加碱性蛋白酶2.5L PF，然后在50℃的温度下添加ProteAX。
-ProteAX/碱性蛋白酶2.5L PF：对于同时法，温度为52.5℃；对于顺序法，首先在50℃的温度下添加ProteAX，然后在55℃的温度下添加Alcalase 2.5L PF。
图4示出了当用ProteAX进行两次连续水解并且在两次水解之间进行过滤时，与单次进行的水解相比，脱蛋白速率显著降低。此外，在碱性蛋白酶2.5L PF之前或之后用ProteAX进行两次连续水解的事实，与用两种蛋白酶(同时添加)单次进行的水解相比，不能提高脱蛋白程度：因此，在顺序方法+过滤中使用ProteAX可显著降低脱蛋白程度。
因此，在根据本发明的方法中，在每个水解步骤中存在内肽酶是必要的以提高脱蛋白速率。
实例6：第二次酶促水解中蛋白酶性质的影响：要求在第二个水解步骤中蛋白酶不
包括外肽酶
为了研究使用同时包含内肽酶和外肽酶的蛋白酶对脱蛋白程度的影响，使用了包含曲霉碱性蛋白酶、曲霉胃蛋白酶I(内肽酶)和亮氨酰氨基肽酶(外肽酶)的混合物的蛋白酶(源自米曲霉(Aspergillus oryzae)且由新日本化学公司出售的Sumizyme LP)，任选地与枯草杆菌蛋白酶(碱性蛋白酶2.5L PF和Promod 439L)交替使用。
重复实例3的同时和顺序+过滤方法，结果如图5所示：
-Sumizyme LP/Sumizyme LP：温度为45℃。
-Promod 439L/Sumizyme LP：对于同时法，温度为50℃；对于顺序法，首先在57℃的温度下添加Promod 439L，然后在45℃的温度下添加Sumizyme LP。
-Sumizyme LP/Promod 439L：对于同时法，温度为50℃；对于顺序法，首先在45℃的温度下添加Sumizyme LP，然后在57℃的温度下添加Promod 439L。
-Sumizyme LP/碱性蛋白酶2.5L PF：对于同时法，温度为50℃；对于顺序法，首先在45℃的温度下添加Sumizyme LP，然后在55℃的温度下添加碱性蛋白酶2.5LPF。
当用Sumizyme LP进行两次连续水解并且在两次水解之间进行过滤时，脱蛋白程度类似于单次进行的水解。此外，与单次进行的水解相比，在用Promod 439L进行第一次水解然后过滤之后用Sumizyme LP进行的第二次水解显著降低了脱蛋白程度。
然而，如果在顺序+过滤法(Sumizyme LP/Promod439L)中用Sumizyme LP进行第一次水解，用Promod439L进行第二次，则与单次进行的水解相比，脱蛋白程度显著提高。当Promod439L替换为碱性蛋白酶2.5L PF(Sumizyme LP/碱性蛋白酶2.5L PF)时，情况类似。
因此，当在两次酶促水解之间进行过滤时，第一次水解中使用的蛋白酶不包含外肽酶这个要求不是必要的。然而，该条件对于第二次水解中使用的蛋白酶是必不可少的，并且可以显著提高脱蛋白程度。
Claims (10)
1.一种用于从昆虫角质层中获取甲壳素的方法，所述方法包括：
-使用至少一种内肽酶对昆虫角质层进行第一次酶促水解，
-从水解介质中分离由所述第一次酶促水解产生的水解角质层，
-使用至少一种内肽酶，不包括外肽酶，对所述水解角质层进行第二次酶促水解。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于所述第二次酶促水解的所述至少一种内肽酶是选自以下的一种内肽酶或多种内肽酶的混合物：丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸蛋白酶、金属内肽酶和苏氨酸内肽酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，用于所述第二次酶促水解的至少一种内肽酶是一种丝氨酸内肽酶或多种丝氨酸内肽酶的混合物，和/或一种金属内肽酶或多种金属内肽酶的混合物，每种丝氨酸内肽酶选自由枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶组成的组，每种金属内切蛋白酶选自由枯草杆菌金属蛋白酶和嗜热菌蛋白酶组成的组。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，用于所述第二次酶促水解的所述至少一种内肽酶是细菌来源的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述第一次酶促水解之前研磨所述昆虫角质层的步骤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，通过将所述昆虫的角质层与柔软部分分离的步骤获得所述昆虫角质层。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述水解步骤的总时间少于6小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，使用的所述至少一种内肽酶的总量以干重计为10U至500U/克昆虫角质层。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法进一步包括所述第二次水解之后的化学处理步骤。
10.一种获得壳聚糖的方法，所述方法包括根据权利要求1至9中任一项所述的获得甲壳素的方法，并且进一步包括所述甲壳素脱乙酰化的步骤。
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