CN110144374B - 一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，包括如下步骤：S1.蛋清肽的提取：(1)灭酶；(2)碱性蛋白酶酶解；(3)风味蛋白酶酶解；(4)活性炭吸附；S2.蛋清肽的分离纯化：(1)超滤(2)冻干；S3.葡聚糖凝胶层析，得到能促皮肤创面愈合的蛋清肽，于‑20℃保存。本发明以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH 11和55℃、pH 7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法。
背景技术
食源性多肽是以食用蛋白为原料，经酶解、分离、纯化得到蛋白肽，按照来源的不同可分为动物源肽和植物源肽两大类。目前，在动物源肽的研究方向主要集中于乳蛋白肽、胶原蛋白肽和蛋清蛋白肽等；植物源肽的研究则以大豆肽、玉米肽等为主。而根据分子量大小的差异，又可以将食源性肽分为低聚肽(小于1kDa)和多肽(大于1kDa)。通常食源性多肽的长度约为3～20个氨基酸，包括疏水氨基酸残基和赖氨酸、脯氨酸以及精氨酸等亲水氨基酸残基。这些多肽可能具备除满足人体系统正常营养以外的某些生物调节功能。当人体消化食物时，来源于这些食物的食源性多肽可能会影响到心血管、消化、神经和免疫系统等重要身体系统的功能。近年来，研究表明，许多食源性多肽具有相似的生物活性，如抗菌、抗氧化、抗血栓、抗高血压降血脂、促消化和免疫调节活性等。不同种肽其特殊的序列组成产生了不同的生物活性[2]。此外，相较于化学药物，食源性多肽对人体毒性更小，副作用更少，安全性更高，并且其制备成本更低。
蛋清蛋白的水解产物具有多种功能特性。单独或组合应用不同的酶水解蛋清粉，可以得到多种不同的酶解产物。在过去的几十年中，科研人员已经通过胃蛋白酶，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等开发并标记了很多有益身体健康效果的功能性多肽。
蛋清粉经由嗜热菌蛋白酶水解获得了可抑制ACE活性的生物活性肽。包含Tyr-Arg-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu、Arg-Ala-AspHis-Pro-Phe-Leu和Ile-Val-Phe氨基酸序列的多肽具有强烈的ACE抑制剂功能。对自发性高血压大鼠给药处理，与对照组相比可有效降低大鼠的血压。Fujita等用胃蛋白酶，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶水解卵白蛋白并产生7种ACE抑制肽：LKA，LKP，LAP，IKW，FQKPKR，FKGRYYP和IVGRPRHQG。清蛋白分解产生一些具ACE抑制作用的多肽，并且这些多肽能够降低血脂含量。这些来自蛋清和卵清蛋白的多肽还对血管舒张有效。来自卵转铁蛋白的肽具有非常好的抗微生物活性和抗氧化性。不过水解后的卵转铁蛋白丧失了结合铁的能力。研究人员利用复合蛋白酶，碱性蛋白酶，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等处理卵转铁蛋白，得到能够保护人体白细胞免受氧化损伤(包括DNA损伤)的酶解产物。含Lys-Val-Arg-Glu-Gly-Thr肽序列的卵转铁蛋白水解产物也具有强烈的ACE抑制活性和血管舒张活性。研究表明，卵类粘蛋白酶解得到的小肽对T细胞的具有免疫调节活性，卵粘蛋白小肽具有体外巨噬细胞刺激活性。合成的卵粘蛋白肽也显示出免疫调节活性，诱导T细胞分泌细胞因子白细胞介素(IL)-4，IL-10，IL-13，干扰素(IFN)γ和IL-6。
目前，国内工业化规模水解蛋白几乎都是采用间歇式直接加酶的生产方式，首先蛋白质底物与酶在反应器中水解，当到达预期的水解度后，钝化酶，再通过盐析或者膜分离的方法分离出多肽。间歇式生产有很多不足之处：①由于酶的一次性使用，生产成本高；②反应体系中反应程度难于控制，造成了各批次间产品分子组成的差异；③反应结束后，需改变水解条件或热处理钝化酶，增加了费用；④劳动强度大，需要投入大量劳力，人工费用高；⑤由于反应的起动与终止，生产效率低；⑥由于反应体系中底物浓度的抑制，导致反应速度慢，产品转化率偏低。
公开号为“CN 101724675 A”公开了一种蛋清蛋白多肽的制备工艺，该工艺将蛋清匀浆后进行第一次酶解，然后用β-环糊精包裹，接着进行第二次酶解，最后进行吸附、过滤、真空干燥，制得无苦味的蛋清蛋白多肽粉。该方法的缺陷同样是采用间歇式直接加酶的方法制备多肽，用量酶大，成本高，工业上应用前景较低。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽及其制备方法，其目的在于，提供一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽，通过以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH 11和55℃、pH 7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果。
本发明提供一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，包括如下步骤：
S1.蛋清肽的提取：
(1)灭酶：称取蛋清粉溶解于双蒸水中，充分搅拌使其溶解后，置于90℃恒温水浴锅中，不断搅拌，水浴10min，以达到灭酶的蛋清液A；
(2)碱性蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液A温度降至到60℃左右，置于50℃恒温水浴锅中，pH调至11，加入Alcalase碱性蛋白酶酶解4h，完成后，沸水浴10min对蛋白液灭酶，得到灭酶的蛋清液B；
(3)风味蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液B降至55℃后，置于55℃恒温水浴锅中，调节pH为7，加入5％风味蛋白酶,反应4h，结束后，再次沸水浴10min灭酶，得到灭酶的蛋清液C；
(4)活性炭吸附：待灭酶的蛋清液C温度降至室温，加入活性炭静置2h，纱布过滤后，离心15min，收集上清，得到酶解液，放置在-20℃保存；
S2.蛋清肽的分离纯化：
(1)超滤：将步骤S1得到的酶解液稳定通过超滤系统，保留含有分子量小于1kDa的小分子蛋清肽的超滤液，于-20℃保存；
(2)冻干：将超滤获得的小分子蛋清肽超滤液，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉；
S3.葡聚糖凝胶层析：将步骤S2得到的冻干粉按比例溶于双蒸水中，通过葡聚糖凝胶层析分离得到的一系列蛋清肽组分，选择其中保留时间为100-120min的组分，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉，得到能促皮肤创面愈合的蛋清肽，于-20℃保存。
作为本发明进一步的改进，步骤S1中所述Alcalase碱性蛋白酶的质量浓度为5wt％，所述离心转速为7000-7500r/min，所述活性炭含水量为2-5％。
作为本发明进一步的改进，步骤S3中所述葡聚糖凝胶为Sephadex G-15凝胶。
作为本发明进一步的改进，步骤S3中所述葡聚糖凝胶层析的流动相为双蒸水，流速为1.4mL/min。
作为本发明进一步的改进，步骤S3中所述葡聚糖凝胶层析中采用紫外检测仪检测洗脱液吸光度，得到不同分子量大小范围的吸收峰。
作为本发明进一步的改进，所述紫外检测仪选择280nm处检测吸光度值。
本发明进一步保护一种根据上述制备方法制得的蛋清肽。
本发明进一步保护一种能促进皮肤创面愈合的组合物，包括上述蛋清肽。
本发明具有如下有益效果：本发明以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH 11和55℃、pH 7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明测试例1中蛋清肽对小鼠伤口愈合的影响图；
图2为本发明实施例1制得的蛋清肽的葡聚糖凝胶层析图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
实施例1
S1.蛋清肽的提取
(1)溶液配制
用双蒸水配制HCI 200mL、3M NaoH 250mL、pH 9.14、pH 6.86标准液各250mL。
(2)pH计校准
将配制好的pH 9.14、pH 6.86标准液从冰箱中拿出，室温放置。
将pH计置于pH 6.86标准液中校准，双蒸水清洗探头后置于pH9.18标准液中校准再次校准。根据pH值标准溶液的温度对照表进行比对，误差小于0.2。
(3)酶解反应
灭酶：称取蛋清粉75g溶解于1.5L双蒸水中，充分搅拌使其溶解。将完全溶解的蛋清液倒入容量为3L的酶解瓶中，置于90℃恒温水浴锅中，水浴锅液面必须高于蛋清液液面。用温度计测量蛋清液温度达90℃以上，水浴10min，以达到灭酶的效果。沸水浴过程中使用搅拌器不断进行搅拌。
碱性蛋白酶酶解：灭酶结束后，待蛋清液温度降至到60℃左右，将酶解瓶置于50℃恒温水浴锅中，pH调至11，即Alcalase碱性蛋白酶最适反应条件。温度计测量蛋清液温度为50℃时，加入5％Alcalase碱性蛋白酶(3.75mL)酶解4h。
灭酶：碱性蛋白酶水解完成后，沸水浴10min对蛋白液灭酶。
风味蛋白酶酶解：在55℃，pH为7的条件下进行酶解反应。降温后，酶解瓶置于55℃恒温水浴锅中，温度计测量蛋清液温度为55℃时，加入5％风味蛋白酶(3.75g)反应4h。
灭酶：风味蛋白酶酶解结束后，再次沸水浴10min灭酶。
活性炭吸附：酶解结束后，待酶解液温度降至室温，加入5％活性炭(75g)静置2h，纱布过滤后，于7200r/min离心15min，收集上清。将酶解液放置在-20℃保存。
S2.蛋清肽的分离纯化
(1)超滤
用MILLIPORE超滤系统进行超滤。
先用温水(30～40℃)清洗超滤系统0.5h，再用0.01M NaoH碱洗0.5h，再次用温水清洗0.5h；调整压力泵压力大小，使得蛋清蛋白酶解液稳定通过超滤系统，压力表不能超过0.25kg/cm2；上样结束后先进行碱洗30min，再水洗30min。通过四种不同分子量大小孔径的超滤膜进行分离，最后保留含有分子量小于1kDa的小分子蛋清肽的超滤液，于-20℃保存。
(2)冻干
将超滤获得的小分子蛋清肽超滤液，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉。
冻干：浓缩液倒入平皿中-20℃冷冻过夜后-80℃预冻24小时。将预冻完成的样品放入清理干净的干燥盘，仔细检查密封性，严格按照真空冷冻干燥机操作规范操作，冻干机不得过夜使用。冻干结束后，用药匙小心收集冻干粉，于-20℃保存。
S3.葡聚糖凝胶层析
(1)凝胶溶胀
取Sephadex G-15凝胶200g、500mL双蒸水于烧杯中，在电磁炉上加热，使凝胶处于沸腾状态保持两个小时，并且用玻璃棒不断缓慢轻轻搅拌，防止凝胶发生爆沸。搅拌速度不可过快，否则会破坏凝胶结构。将煮好的凝胶冷却至室温，将其中的杂质小心去除，并倒出上层多余的水。
(2)凝胶柱装填
将内径25mm，高700mm的层析柱洗净后用双蒸水润洗3次。加入3～5mL双蒸水封住底部出液口；沿层析柱壁缓慢加入溶胀后的凝胶，由于凝胶容易沉积在底部，装柱过程中需及时添水且避免产生气泡；拧紧进样口，静置2～3h；观察凝胶柱状态，凝胶装柱内不能有气泡、不能含有杂质或出现明显断层，胶上表面必须水平且平整。若有如上问题，则需要重新煮胶装柱。
(3)平衡
以双蒸水为流动相，流速调至280μL/min，缓慢平衡葡聚糖凝胶层析柱1～2天。
(4)上样
调整蠕动泵流速，每隔0.5h增加一到两个倍速，直至流速达到1.4mL/min；调平与层析柱相连接的紫外检测仪，选择280nm处检测吸光度值，打开电脑开始测量基线；稳定半个小时左右，直到基线完全平衡并且没有异常小峰出现，重新调平紫外检测仪，开始上样；称取500mg蛋清蛋白超滤冻干粉，溶解于1mL双蒸水中，打开层析柱进样口，沿层析柱壁缓慢进样。
(5)洗脱
以双蒸水为流动相，1.4mL/min流速洗脱样品。紫外检测仪检测洗脱液吸光度，得到不同分子量大小范围的吸收峰。收集各个峰的洗脱液并做好标记，于-20℃保存。
(6)浓缩和冻干
将葡聚糖凝胶层析分离得到的蛋清粗肽组分，分别通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉。
(7)冻干
将浓缩液按照冻干步骤制成冻干粉，于-20℃保存。制成冻干粉以后经过凝胶层析柱分离，于280nm处检测紫外吸光度值，得到葡聚糖凝胶层析图谱如附图2。小分子蛋清肽分离后收集到一共四个小肽组分，留用保留时间为100-120min的组分，即标号为2的组分。
对比例1
按照专利CN201210305037.6“一种蛋清多肽的制备方法”的方法制备
试验例1
1.实验材料
雌性Balb/c小鼠30只；一次性注射器1mL；无菌透明敷料(施乐辉IV3000)；脱毛膏(薇婷)；酒精棉球、酒精面片、碘伏棉棒；生理盐水；青霉素钠(160万单位)；戊巴比妥钠；无菌医用打孔器；4％多聚甲醛；手术镊子剪刀(灭菌)。
2.实验设备
IVC无菌笼架(鼠房提供)；紫外超净工作台(苏净安泰)
3.小鼠皮肤创伤愈合实验
S1.预约鼠房IVC系统笼位，订购雌性Balb/c小鼠30只，小鼠必须有质量合格证才可接入鼠房。
S2.小鼠接入鼠房后每隔一天观察小鼠状态，称量小鼠体重并记录，当小鼠体重达到25±2g开始进行创伤愈合实验。观察期间，注意及时补充鼠笼内食物和水，若有小鼠死亡应及时处理。
S3.分组：小鼠饲养一周后体重达到实验要求，对其进行分组。一共分为三组：对照组(生理盐水)、对比例1组和实施例1组，每组10只。每组同笼小鼠剪脚趾作为标记。
S4.脱毛：均匀涂抹适量脱毛膏于小鼠背部，5min后轻轻将其背毛脱去面积为3cm×3cm的一块正方形区域。脱毛后用酒精棉片或碘伏棉片轻轻将其后背清理干净。
S5.休息一天防止脱毛导致的皮肤渗血使得小鼠背部皮肤过于敏感从而影响实验进程。
S6.伤口愈合模型建立：
对小鼠腹腔注射1.5％的戊巴比妥钠进行麻醉处理(4μL/g)。
用医用酒精棉球轻轻擦拭小鼠背部皮肤后，用无菌打孔器在小鼠背部表皮切开一个直径为7mm的圆形伤口。使用碘伏棉球止血，用事先准备好的敷贴包好伤口，以免二次创伤。实验期间敷贴每天更换。
用生理盐水配制30单位/mL的青霉素钠溶液，每只小鼠腹腔注射100μL，防止伤口感染。给药期间每隔一天注射一次青霉素钠，青霉素钠溶液现配现用，粉末4℃保存。
S7.多肽处理：伤口模型建立当天起记为第0天，每隔一天给药一次，称量体重并记录，观察伤口变化并拍照。
用生理盐水分别配制蛋清肽溶液，浓度为200μmol/L，以液体滴加的方式对小鼠背部伤口进行给药，对照组用同等体积生理盐水处理。
对照组用生理盐水替代。
4.HE染色
在第0天、第4天、第8天、第10天时，观察到伤口有明显变化。每组分别随机处死两只小鼠。用无菌的手术刀小心地沿处死小鼠伤口边缘取宽3mm的组织，于4％多聚甲醛中4℃保存。注意取样时不要破坏伤口的组织形状。将取好的HE染色样品由长春一向生物科技有限公司进行HE染色制片。用荧光倒置显微镜对切片进行观察并拍照。
5.实验结果
实验结果见附图1。
我们建立了动物创伤模型，探究经葡聚糖层析得到的第二组分对于伤口愈合的影响。在脱毛后的小鼠背部用尺子画一个1cm2的正方形，用消毒的剪刀沿着画好的线条减去小鼠的全层皮肤组织，每隔一天给药及拍照，通过观察小鼠背部伤口的愈合速度进一步确定实施例1制备的蛋清肽的作用，以便进行后续的实验。实验结果如附图1所示，伤口形成48h后，均会产生渗出液，实施例组出现鲜红的肉芽组织；第四天，各组伤口周围皮肤开始皱缩，低浓度组炎症反应严重；到第八天，各组炎症反应基本消失，与对照组和对比例组相比，高浓度组伤口面积更小。说明实施例1制备的蛋清肽对于小鼠的伤口愈合有一定的促进作用，其效果明显优于现有技术制备的蛋清液，具有一定的特殊性。
与现有技术相比，本发明以蛋清浓缩粉为原料，使用Alcalase碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分别在50℃、pH 11和55℃、pH 7条件下顺序酶解4h，获得最佳酶解效率的酶解产物，超滤后得到分子量小于1kDa的小分子蛋清蛋白肽混合物，经葡聚糖凝胶层析得到四个蛋清肽组分，其中第二组分蛋清肽够有效促进细胞迁移，具有良好的皮肤创面愈合的效果，具有广阔的应用前景。
本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。

Claims (5)

1.一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.蛋清肽的提取：
(1)灭酶：称取蛋清粉溶解于双蒸水中，充分搅拌使其溶解后，置于90℃恒温水浴锅中，不断搅拌，水浴10min，以得到 灭酶的蛋清液A；
(2)碱性蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液A温度降至到60℃左右，置于50℃恒温水浴锅中，pH调至11，加入Alcalase碱性蛋白酶酶解4h，完成后，沸水浴10min对蛋白液灭酶，得到灭酶的蛋清液B；
(3)风味蛋白酶酶解：待灭酶的蛋清液B降至55℃后，置于55℃恒温水浴锅中，调节pH为7，加入5％风味蛋白酶,反应4h，结束后，再次沸水浴10min灭酶，得到灭酶的蛋清液C；
(4)活性炭吸附：待灭酶的蛋清液C温度降至室温，加入活性炭静置2h，纱布过滤后，离心15min，收集上清，得到酶解液，放置在-20℃保存；
所述Alcalase碱性蛋白酶的质量浓度为5wt％，所述离心转速为7000-7500r/min，所述活性炭含水量为2-5％。
S2.蛋清肽的分离纯化：
(1)超滤：将步骤S1得到的酶解液稳定通过超滤系统，保留含有分子量小于1kDa的小分子蛋清肽的超滤液，于-20℃保存；
(2)冻干：将超滤获得的小分子蛋清肽超滤液，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉；
S3.葡聚糖凝胶层析：将步骤S2得到的冻干粉按比例溶于双蒸水中，通过葡聚糖凝胶层析分离得到的一系列蛋清肽组分，选择其中保留时间为100-120min的组分，通过旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液，并进行冷冻干燥制备成冻干粉，得到能促皮肤创面愈合的蛋清肽，于-20℃保存；
所述葡聚糖凝胶为Sephadex G-15凝胶，所述葡聚糖凝胶层析的流动相为双蒸水，流速为1.4mL/min。
2.根据权利要求1所述一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述葡聚糖凝胶层析中采用紫外检测仪检测洗脱液吸光度，得到不同分子量大小范围的吸收峰。
3.根据权利要求2所述一种能促皮肤创面愈合的蛋清肽的制备方法，其特征在于，所述紫外检测仪选择280nm处检测吸光度值。
4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述制备方法制得的蛋清肽。
5.一种能促进皮肤创面愈合的组合物，其特征在于，包括权利要求4 所述的蛋清肽。
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