CN110106220A - 从芒果籽中制备小肽蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：（1）将芒果籽去皮、取仁后，进行一次破碎；（2）将一次破碎的芒果籽仁加入有机溶剂中进行回流脱脂后，挥干；（3）将挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，加入酶解体系中，在搅拌条件下进行酶解；（4）将酶解液在加热条件下搅拌浸提，然后冷却后离心得上清液；（5）将上清液依此进行大孔径超滤和小孔径超滤，收集截留液；（6）将收集的截留液作为上柱液过大孔树脂固定化酶柱进行二次酶解，收集流出液；（7）将收集的流出液进行超滤，收集透过液，并将所得截留液返回重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；（8）将透过液浓缩、干燥，即得小肽蛋白。本发明制得小肽蛋白的产率高。

Description

从芒果籽中制备小肽蛋白的方法

技术领域

本发明涉及小肽蛋白的制备，具体涉及一种从芒果籽中制备小肽蛋白的方法。

背景技术

芒果属无患子目漆树科芒果属，广泛分布于热带、亚热带区域，现今超过100个国家种植，有“水果之王”之美誉。中国是第二大芒果主产国，其产量约为440万吨，约占世界总产量的11%。研究表明，芒果经加工后，将产生占果实总重35%～60%的废弃物，其中芒果核占废弃物总重的15%～20%，芒果籽占核总重的45.7%～72.8%。据报道，芒果籽中含6.74%～9.20%的蛋白质，是非常好的植物蛋白来源，其中具有生理活性的小分子小肽，相比大分子蛋白质，则具有不可比拟的优势。小肽蛋白在血液循环中能直接参与组织蛋白质的合成，此外肝脏、肾脏、皮肤和其他组织也能完整地利用小肽蛋白；小肽蛋白还能促进矿物质的吸收利用，主要以络合物形式与矿物质结合，增加矿物质吸收，并可避免氨基酸间的吸收竞争，以及具有生理调节作用，可以通过诱导小肠中一些酶活性的提高，促使小肠消化功能发育提前，促进健康和提高其生产性能，促进营养物质的消化吸收。

到目前为止，仍未见从芒果籽中制备高活性小肽蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种从芒果籽中连续制备高得率、高含量、低分子量的小肽蛋白的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将芒果籽去皮、取仁后，进行一次破碎；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁加入有机溶剂中进行脱脂后，挥干；

（3）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，加入酶解体系中，在搅拌条件下进行酶解；

（4）将所得酶解液在加热条件下搅拌浸提，然后冷却后离心得上清液；

（5）将所得上清液依此进行大孔径超滤和小孔径超滤，收集截留液；

（6）将收集的截留液作为上柱液过大孔树脂固定化酶柱进行二次酶解，收集流出液；

（7）将收集的流出液进行超滤，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（6）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（8）将所得透过液浓缩、干燥，即得小肽蛋白。

在本发明中，所述芒果籽可以选无霉烂无外来杂质的鲜芒果籽或干芒果籽，优选鲜芒果籽。

进一步，所述芒果籽中粗蛋白含量为5～10%。

进一步，步骤（1）中，所述一次破碎的粒度为过10～40目筛，优选16～30目筛。

在本发明中，芒果籽中富含大量的脂类，会严重影响后续的酶解，选用用有机溶剂可有效的溶出。

进一步，步骤（2）中，所述一次破碎的芒果籽仁与有机溶剂的料液比kg/L为1∶3～8，例如，可以为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值，优选1：4～6。其中，所述有机溶剂为乙醇或丙酮，优选乙醇。

在本发明，回流的方式只要能使用少量溶剂有效的溶出可溶性脂类物质，包括部分色素，并回流至流下溶剂为清澈透明即可。例如，可以选索氏回流。

在本发明中，挥干的方式只要能挥干至无有机溶剂气味即可。例如，可以选真空蒸馏挥干或鼓风挥干，优选真空蒸馏挥干，可有效的在低温条件下快速挥干残留的有机溶剂，同时挥发的有机溶剂也便于回收，有效避免空气污染。

进一步，所述真空蒸馏挥干的真空度为-0.1～-0.05MPa，温度为60～90℃，优选70～80℃。

进一步，鼓风挥干的温度为80～100℃，优选85～90℃。

在本发明中，二次破碎的粒度为过30～60目筛。

进一步，步骤（3）中，所述酶解体系为含复酶的水溶液；其中，所述复酶为纤维素酶、半纤维素和果胶酶的混合物；所述酶解的温度为20～60℃，优选30～40℃，恒温正负偏差≤5℃。

在本发明中，所述搅拌条件包括：搅拌转速为30～60rpm，搅拌时间为1～5h，优选2～3h。

进一步，所述复酶的添加量为挥干的芒果仁质量的0.05～0.1%，优选0.06～0.08%；所述水的添加量为挥干的芒果仁质量的5～20倍，优选10～15倍。

进一步，以所述复酶的总重量为基准，所述纤维素酶的含量为35～55%、所述半纤维素酶的含量为20～30%、所述果胶酶的含量为20～40%。

在本发明中，纤维素酶、半纤维素和果胶酶三种酶复合配伍应用可有效破坏芒果籽植物细胞壁的主要组成成分包括纤维素、半纤维素及果胶，从而释放出细胞内的小肽蛋白，显著提高小肽蛋白的收率；同时酶解需要一定的温度，且恒温更有助于保持酶活，使得酶解效果最佳。

进一步，步骤（4）中，所述加热条件包括：在2h内温度升高至80～100℃，并恒温保持0.5～4h，优选1～3h，这种采用快速加热的方式，可以有效灭酶，同时又可浸提蛋白质；所述冷却为水冷至0～60℃，优选30～40℃，水冷有利于不溶物沉淀，便于离心去杂，以及便于后续过超滤膜。

在本发明中，离心只要能去杂即可。例如，可以为碟片式离心。

在本发明中，通过不同孔径的超滤膜可以有效将分子量适中的大分子物质，尤其是蛋白质截留下来，而小分子和其他更大粒径的分子或杂质则被除去，从而实现在温和条件下初步纯化蛋白质。

进一步，步骤（5）中，所述大孔径超滤选用超滤膜的截留相对分子量为50～2000万Da，所述小孔径超滤选用超滤膜的截留相对分子量为1000～10000Da。

进一步，步骤（6）中，所述大孔树脂固定化酶柱选用的酶载体为乙二烯苯、苯乙烯或丙烯酸脂为骨架的大孔树脂，优选乙二烯苯和苯乙烯；选用的酶为中性蛋白酶，为了让酶在中性环境下与底物接触且能保持良好的活性。

进一步，步骤（6）中，所述大孔树脂固定化酶柱的柱子径高比为1：3～9，优选1：4～6，上柱流速为0.1～1.0bv/h，优选0.3～0.5bv/h；所述上柱液的温度与大孔树脂固定化酶柱的柱温均为20～60℃，优选30～40℃，恒温正负偏差≤5℃。

在本发明中，以大孔树脂为载体来固定酶，其表面积大，吸附酶量多，可在有限的单位体积固定更多的酶，且能较好的保持酶的活性；同时树脂固定化酶便于酶的重复利用，固定在树脂上的固定相酶可以不断与流动相中的蛋白发生接触与酶解，实现酶的最大利用率。再则，保持柱子恒温也是为了更好的保持酶的活性。

在本发明中，超滤可有效将酶解的小肽蛋白与酶解不彻底的大分子蛋白分离，小肽蛋白可透过超滤膜，而大分子蛋白则被截留后再次上柱进行酶解。

进一步，步骤（7）中，所述超滤选用超滤膜的截留相对分子量为1000～10000Da，优选2000～6000Da。

在本发明中，浓缩只要能蒸发大部分的水，减小溶液体积，便于后续快速干燥即可。

在本发明中，干燥只要能保证得到的产品粒度均匀，品相美观即可。

进一步，步骤（8）中，所述浓缩为低温真空浓缩；更进一步，所述低温真空浓缩的条件包括：温度为50～90℃，相对真空度为-0.1～-0.05MPa，浓缩至可溶性固形物的含量为10～40brix

进一步，步骤（8）中，所述干燥为喷雾干燥；更进一步，所述喷雾干燥的进口温度为150～180℃，出口温度70～90℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）本发明不仅可连续获得数均分子量范围为500～7000Da的低分子量小肽蛋白，而且所得小肽蛋白的含量和得率也高；

（2）本发明中蛋白酶解工艺条件温和，树脂固定化酶连续酶解，酶的利用率高，而且工艺连续性强，对设备要求低，可操作性强，环境友好，适宜于规模化生产。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

小肽蛋白的得率、含量和数均分子量通过凯氏定氮法和高效液相色谱外标法测得；

芒果籽来源于喀麦隆，其中，芒果籽中粗蛋白含量为8.3%；

酶制剂购于青岛根源生物技术集团有限公司；

大孔树脂固定化酶购于杭州创科生物科技限有公司，且在新购进使用前无需活化，装柱后纯水洗柱2～3bv后即可使用。

在没有特别说明的情况下，其他材料均采用普通市售产品。

实施例1

从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将1kg鲜芒果籽去皮、取仁，用组织破碎机进行一次破碎，过20目筛网；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁置于索氏提取器进行回流脱脂，直至下流液清澈透明；其中，回流溶剂为乙醇，体积用量为3L；

（3）将所得脱脂芒果籽仁置于真空蒸馏器内，在真空度为-0.08MPa、温度75℃条件下进行蒸馏挥干，直至无有机溶剂气味；

（4）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，投入含0.4g复酶10L水溶液中，在温度为30±5℃、搅拌速度为30rpm的条件下进行酶解2h；其中，复酶含有35%纤维素酶、25%半纤维素酶和40%果胶酶；

（5）将所得酶解液置于夹层加热锅中2h内快速升温至95℃，并在搅拌条件下浸提2h，然后通过蝶式离心机分离得上清液；

（6）将所得上清液冷却至40±5℃后，依次过截留分子量为100万Da的超滤膜和截留分子量为1000Da的超滤膜，收集截留液；

（7）将收集的截留液作为上柱液以0.2bv/h的流速、40±5℃的温度通过大孔树脂固定化酶柱，收集流出液；其中，柱体积为150ml，径高比为1：3，大孔树脂固定化酶是以苯乙烯为骨架，以中性蛋白酶为活性基团；

（8）将收集的流出液通过截留分子量为2000Da超滤膜，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（7）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（9）将收集的透过液在真空度-0.07Mpa、温度80℃条件下浓缩至10brix，然后在进口温度160℃、出口温度80℃条件下进行喷雾干燥，收集称重后，即得127g小肽蛋白产品。

实施例2

从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将1kg干芒果籽去皮、取仁，用组织破碎机进行一次破碎，过30目筛网；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁置于索氏提取器进行回流脱脂，直至下流液清澈透明，其中，回流溶剂为丙醇，体积用量为4L；

（3）将所得脱脂芒果籽仁置于真空蒸馏器内，在真空度为-0.08MPa、温度75℃条件下进行蒸馏挥干，直至无有机溶剂气味；

（4）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，投入含0.7g复酶20L水溶液中，在温度为55±5℃、搅拌速度为55rpm条件下进行酶解5h；其中，复酶含有55%纤维素酶、20%半纤维素酶和25%果胶酶；

（5）将所得酶解液置于夹层加热锅中2h内快速升温至90℃，并在搅拌条件下浸提1h，然后通过蝶式离心机分离得上清液；

（6）将所得上清液冷却至55±5℃后，依次过截留分子量为1000万Da的超滤膜和截留分子量为5000Da的超滤膜，收集截留液；

（7）将收集的截留液作为上柱液以0.5bv/h的流速、55±5℃的温度通过大孔树脂固定化酶柱，其中，柱体积为120ml，径高比为1：6，收集流出液，大孔树脂固定化酶是以乙二烯为骨架，以中性蛋白酶为活性基团；

（8）将收集的流出液过截留分子量为5000Da超滤膜，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（7）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（9）将收集的透过液在真空度-0.08Mpa、温度70℃条件下浓缩至40brix，然后在进口温度180℃、出口温度70℃条件下进行喷雾干燥，收集称重后，即得102g小肽蛋白产品。

实施例3

从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将1kg鲜芒果籽去皮、取仁，用组织破碎机进行一次破碎，过10目筛网；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁置于索氏提取器进行回流脱脂，直至下流液清澈透明；其中，回流溶剂为乙醇，体积用量为5L；

（3）将所得脱脂芒果籽仁置于鼓风干燥箱内，在温度80℃条件下进行蒸馏挥干，直至无有机溶剂气味；

（4）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，投入含0.6g复酶15L水溶液中，在温度为40±5℃、搅拌速度为40rpm的条件下进行酶解3h；其中，复酶含有45%纤维素酶、30%半纤维素酶和25%果胶酶；

（5）将所得酶解液置于夹层加热锅中1.5h内快速升温至80℃，并在搅拌条件下浸提4h，然后通过蝶式离心机分离得上清液；

（6）将所得上清液冷却至25±5℃后，依次过截留分子量为200万Da的超滤膜和截留分子量为8000Da的超滤膜，收集截留液；

（7）将收集的截留液作为上柱液以1bv/h的流速、25±5℃的温度通过大孔树脂固定化酶柱，其中，柱体积为200ml，径高比为1：9，收集流出液，大孔树脂固定化酶是以丙烯酸酯为骨架，以中性蛋白酶为活性基团；

（8）将收集的流出液通过截留分子量为10000Da超滤膜，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（7）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（9）将收集的透过液在真空度-0.1Mpa、温度55℃条件下浓缩至20brix，然后在进口温度170℃、出口温度90℃条件下进行喷雾干燥，收集称重后，即131g小肽蛋白产品。

实施例4

从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将1kg鲜芒果籽去皮、取仁，用组织破碎机进行一次破碎，过10目筛网；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁置于索氏提取器进行回流脱脂，直至下流液清澈透明；其中，回流溶剂为丙酮，体积用量为8L；

（3）将所得脱脂芒果籽仁置于鼓风干燥箱内，在温度75℃条件下进行蒸馏挥干，直至无有机溶剂气味；

（4）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，投入含0.5g复酶5L水溶液中，在温度为20±5℃、搅拌速度为50rpm的条件下进行酶解5h；其中，复酶含有55%纤维素酶、25%半纤维素酶和20%果胶酶；

（5）将所得酶解液置于夹层加热锅中2h内快速升温至90℃，并在搅拌条件下浸提0.5h，然后通过蝶式离心机分离得上清液；

（6）将所得上清液冷却至30±5℃后，依次过截留分子量为60万Da的超滤膜和截留分子量为1200Da的超滤膜，收集截留液；

（7）将收集的截留液作为上柱液以0.7bv/h的流速、30±5℃的温度通过大孔树脂固定化酶柱，其中，柱体积为150ml，径高比为1：5，收集流出液，大孔树脂固定化酶是以乙二烯为骨架，以中性蛋白酶为活性基团；

（8）将收集的流出液通过截留分子量为1500Da超滤膜，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（7）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（9）将收集的透过液在真空度-0.1Mpa、温度75℃条件下浓缩至35brix，然后在进口温度165℃、出口温度75℃条件下进行喷雾干燥，收集称重后，即102g小肽蛋白产品。

实施例5

从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将1kg鲜芒果籽去皮、取仁，用组织破碎机进行一次破碎，过40目筛网；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁置于索氏提取器进行回流脱脂，直至下流液清澈透明；其中，回流溶剂为乙醇，体积用量为6L；

（3）将所得脱脂芒果籽仁置于鼓风干燥箱内，在温度75℃条件下进行蒸馏挥干，直至无有机溶剂气味；

（4）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，投入含0.8g复酶15L水溶液中，在温度为60±5℃、搅拌速度为40rpm的条件下进行酶解4h；其中，复酶含有40%纤维素酶、30%半纤维素酶和30%果胶酶；

（5）将所得酶解液置于夹层加热锅中1.5h内快速升温至97℃，并在搅拌条件下浸提3h，然后通过蝶式离心机分离得上清液；

（6）将所得上清液冷却至60±5℃后，依次过截留分子量为1500万Da的超滤膜和截留分子量为7000Da的超滤膜，收集截留液；

（7）将收集的截留液作为上柱液以1bv/h的流速、60±5℃的温度通过大孔树脂固定化酶柱，其中，柱体积为240ml，径高比为1：7，收集流出液，大孔树脂固定化酶是以丙烯酸酯为骨架，以中性蛋白酶为活性基团；

（8）将收集的流出液通过截留分子量为10000Da超滤膜，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（7）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（9）将收集的透过液在真空度-0.06Mpa、温度90℃条件下浓缩至25brix，然后在进口温度175℃、出口温度85℃条件下进行喷雾干燥，收集称重后，即153g小肽蛋白产品。

对比例1

按照实施例1的方法制备小肽蛋白，不同的是，步骤（4）中，复酶含有35%纤维素酶和65%半纤维素酶。

对比例2

按照实施例1的方法制备小肽蛋白，不同的是，步骤（4）中，复酶含有35%纤维素酶和65%果胶酶。

对比例3

按照实施例1的方法制备小肽蛋白，不同的是，步骤（4）中，复酶含有55%半纤维素酶和45%果胶酶。

对比例4

按照实施例1的方法制备小肽蛋白，不同的是，步骤（4）中，复酶含有25%半纤维素酶和75%果胶酶。

对比例5

按照实施例5的方法制备小肽蛋白，不同的是，步骤（4）中，复酶含有40%纤维素酶和60%果胶酶。

测试例

将实施例1-5和对比例1-5制得的小肽蛋白通过凯氏定氮法和高效液相色谱外标法测定数均分子量、含量和得率。结果如表1所示。

表1

实施例编号	数均分子量Da	含量%	得率%
				实施例1	740	53.20	12.70
实施例2	4200	62.10	10.20
				实施例3	6730	49.20	13.10
实施例4	940	74.20	10.20
				实施例5	5900	59.90	15.30
对比例1	820	52.21	4.70
				对比例2	600	44.20	3.90
对比例3	530	42.70	7.10
				对比例4	800	57.40	6.30
对比例5	6300	53.10	8.30

通过表1的结果可以看出，复酶对产品得率影响较大，采用本发明的三种酶配合使用可以有效提高产品得率。同时数均分子量适中，含量也相对较高，综合效果更好。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从芒果籽中制备小肽蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将芒果籽去皮、取仁后，进行一次破碎；

（2）将所得一次破碎的芒果籽仁加入有机溶剂中进行回流脱脂后，挥干；

（3）将所得挥干的芒果籽仁进行二次粉碎后，加入酶解体系中，在搅拌条件下进行酶解；

（4）将所得酶解液在加热条件下搅拌浸提，然后冷却后离心得上清液；

（5）将所得上清液依此进行大孔径超滤和小孔径超滤，收集截留液；

（6）将收集的截留液作为上柱液过大孔树脂固定化酶柱进行二次酶解，收集流出液；

（7）将收集的流出液进行超滤，收集透过液，并将所得截留液返回步骤（6）中作为上柱液重复过大孔树脂固定化酶柱继续酶解；

（8）将所得透过液浓缩、干燥，即得小肽蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述一次破碎的粒度为过10～40目筛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述一次破碎的芒果籽仁与有机溶剂的料液比kg/L为1：3～8，其中，所述有机溶剂为乙醇或丙酮。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述酶解体系为含复酶的水溶液，其中，所述复酶为纤维素酶、半纤维素和果胶酶的混合物；所述酶解的温度为20～60℃，恒温正负偏差≤5℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述复酶的添加量为挥干的芒果仁质量的0.05～0.1%，所述水的添加量为挥干的芒果仁质量的5～20倍。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以所述复酶的总重量为基准，所述纤维素酶的含量为35～55%、所述半纤维素酶的含量为20～30%、所述果胶酶的含量为20～40%。

7.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述加热条件包括：在2h内温度升高至80～100℃，并恒温保持0.5～4h；所述冷却为水冷至0～60℃。

8.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述大孔径超滤选用超滤膜的截留相对分子量为50～2000万Da，所述小孔径超滤选用超滤膜的截留相对分子量为1000～10000Da。

9.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述大孔树脂固定化酶柱选用的酶载体为乙二烯苯、苯乙烯或丙烯酸脂，选用的酶为中性蛋白酶；所述大孔树脂固定化酶柱的柱子径高比为1：3～9，上柱流速为0.1～1.0bv/h；所述上柱液的温度与大孔树脂固定化酶柱的柱温均为20～60℃，恒温正负偏差≤5℃。

10.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（7）中，所述超滤选用超滤膜的截留相对分子量为1000～10000Da。