CN110699397A - 一种连续酶促酰化花青素的方法 - Google Patents

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Abstract

一种连续酶促酰化花青素的方法，包括以下步骤：（1）底物的制备：将花青素及酰基供体一起溶于含有抗氧化剂的醇类溶剂中，得到底物；（2）酶促酰化：将步骤（1）得到的底物上柱于固定化酶柱，收集流出液；（3）低温除醇：将步骤（2）收集的流出液进行浓缩，回收醇类溶剂，得浓缩液；（4）树脂吸附：将步骤（3）得到的浓缩液稀释后上吸附树脂柱后，用醇类溶剂解吸，收集解吸液；（5）浓缩干燥：将步骤（4）收集的解吸液进行浓缩并干燥，即得酰化花青素产品。本发明方法采用可连续酶促酰化花青素，且整个工艺条件温和，环境友好，比较适宜于规模化生产。

Description

一种连续酶促酰化花青素的方法
技术领域
本发明涉及一种酰化花青素的方法，具体涉及一种连续酶促酰化花青素的方法。
背景技术
花青素广泛存在于植物的根茎叶花果等植物器官的细胞液中，是一种重要的植物色素及生理活性功能成分。花青素安全无毒，具有很强的抗氧化、清除自由基作用；能降低高血脂及甘油酯、胆固醇水平；具有抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃粘膜等多种功能，因此花青素在食品、化妆品、医药领域有巨大的应用潜力。但由于花青素结构的稳定性差，限制了其广泛应用，提高花青素的稳定性，是开发利用天然花青素急需解决的技术问题。
花青素的功能、稳定性与其结构存在密切关系，特别是其酰基结构。酰化反应是提高花青素结构稳定性的重要方法。传统化学酰化方法存在许多不足和缺陷，如反应区域选择性差，易产生副产物，必须采用保护措施，步骤多，耗时长，反应条件剧烈，且引入溶剂多，分离纯化困难。而酶促酰化因其反应条件温和，选择性强，产品质量高的特点，但酶促酰化反应中酶的利用率以及酶促酰化反应的产量依然较低，有待进一步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上不足，提供一种连续酶促酰化花青素的方法，所述方法可连续酶促酰化花青素，且整个工艺条件温和，环境友好，比较适宜于规模化生产。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种连续酶促酰化花青素的方法，包括以下步骤：
（1）底物的制备：将花青素及酰基供体一起溶于含有抗氧化剂的醇类溶剂中，得到底物；
（2）酶促酰化：将步骤（1）得到的底物上柱于固定化酶柱，收集流出液；
（3）低温除醇：将步骤（2）收集的流出液进行浓缩，回收醇类溶剂，得浓缩液；
（4）树脂吸附：将步骤（3）得到的浓缩液稀释后上吸附树脂柱后，用醇类溶剂解吸，收集解吸液；
（5）浓缩干燥：将步骤（4）收集的解吸液进行浓缩并干燥，即得酰化花青素产品。
大孔树脂固定化酶可以实现连续进行酶接触反应，酶可以不间断与底物充分接触并释放，然后再与新的未反应底物接触，实现酶的重复利用，因此，相比液相状态下，酶的利用率得到极大的提高。
优选的，步骤（1）中，所述固定化酶是经载体固定的南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）、毛霉脂肪酶(RML)、洋葱假单胞菌脂肪酶（PSL）、柱状假丝酵母脂肪酶（CCL）或猪胰脂肪酶（PPL）；更为优选的，所述固定化酶是经载体固定的酶为南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）、毛霉脂肪酶(RML)或洋葱假单胞菌脂肪酶（PSL）。
优选的，步骤（1）中，所述固定化酶的载体为为二乙烯苯树脂、苯乙烯树脂或丙烯酸树脂中的一种；更为优选的，所述固定化酶的载体为酶载体为二乙烯苯树脂。
优选的，步骤（1）中，所述醇类溶剂为乙醇；优选的，所述乙醇是体积分数为80%～99%的乙醇/水溶液；优选的，乙醇是体积分数为85%～95%的乙醇/水溶液；所述固定化酶柱的柱径高比为1:2～10；优选的，固定化酶柱的柱径高比为1:4～8。
优选的，步骤（1）中，所述花青素提取自植物的根、茎、叶、花或/和果的组织器官的纯天然花青素，更优选的，所述花青素为提取自植物的花或/和果的组织器官中制得的纯天然花青素。
优选的，步骤（1）中，所述酰基供体为月桂酸、苯甲酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、水杨酸、乙酸、柠檬酸或丙二酸；更为优选的，所述酰基供体为月桂酸、苹果酸或乙酸；
优选的，步骤（1）中，所述酰基供体与花青素的质量比为1:3～6；优选的，所述酰供体与花青素的质量比为1:4～5。
优选的，步骤（1）中，所述醇类溶剂与花青素的质量比为8～15:1；优选的，所述醇类溶剂与花青素的质量比为10～13:1。
优选的，步骤（1）中，所述抗氧化剂选自抗坏血酸、维生素E、β胡萝卜素和辅酶Q中的一种或多种；更为优选的，所述抗氧化剂为抗坏血酸或β胡萝卜素。
优选的，步骤（1）中，所述抗氧化剂添加量为花青素质量的0.01～0.1%。
优选的，步骤（2）中，所述上柱流速为0.1～1BV/h；优选的，所述上柱流速为0.2～0.5BV/h。
优选的，步骤（2）中，所述柱的温度为15～70℃；优选的，所述柱的温度为40～50℃。
优选的，步骤（3）中，所述浓缩采用低温真空浓缩，温度为50～70℃；更为优选的，低温真空浓缩的温度为60～65℃。
优选的，步骤（4）中，所述吸附树脂类型为D101、AB-8、X-5或ADS-7；更为优选的，所述吸附树脂类型为D101或AB-8。
优选的，步骤（4）中，所述解吸所采用醇类溶剂的体积为2.5～5BV，解吸的流速为0.5～2BV/h，所述醇类溶剂是体积分数为60%～80%的乙醇水溶液；优选的，所述解吸所采用醇类溶剂的体积3～4BV，解吸的流速为1～1.5BV/h，所述醇类溶剂是体积分数为65%～70%的乙醇水溶液。
优选的，步骤（5）中，所述真空浓缩的温度为60～80℃，反渗透膜浓缩温度为0～60℃；更为优选的优选的，所述低温浓缩为反渗透膜浓缩，所述浓缩的温度为0～40℃。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明方法采用大孔树脂固定化酶技术与柱层析技术结合，将酶通过大孔树脂固定在层析柱上，反应过程中，大孔树脂固定化酶可以实现连续进行酶接触反应，酶可以不间断与底物充分接触并释放，然后再与新的未反应底物接触，实现酶的重复利用，因此，相比液相状态下，酶的利用率得到极大的提高；
（2）本发明方法的整个工艺条件温和，操作简单，环境友好，比较适宜于规模化生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。
本发明实施的对酶促酰化效果的检测方法如下：根据朗伯比尔定律，溶液的浓度与其吸光度成正比，故而可用紫外-可见分光光度计法测定总花青素的含量，反应后，测定吸光值，通过吸光值的改变来计算保存率作为评价指标。试验以吸光值为衡量指标，保存率计算式如下：保存率（%）=A1*M1/A0*M0*100%。其中A1、M1分别表示在上固定化柱后溶液的吸光度、质量，A0、M0分别表示上固定化柱前溶液的吸光度、质量。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
（1）固定化酶柱的准备：将大孔树脂固定化酶装柱，酶载体为二乙烯苯树脂，酶为CALB，柱体积为200mL，径高比为1:4，用体积分数为85%的乙醇以流速0.5BV/h洗柱5BV；
（2）底物的制备：将20g花青素（提取自玫瑰茄，花青素含量为79.3%）溶解于280g、体积质量分数为85%的乙醇中，然后再加入110g苹果酸和0.01g抗坏血酸钠，室温下充分搅拌溶解，得到底物；
（3）酶促酰化：将步骤（2）的底物以0.5BV/h的流速上柱于固定化酶柱，柱温保持在65±5℃，收集流出液。
（4）低温除醇：将步骤（3）收集的流出液用真空浓缩器进行浓缩，回收乙醇，浓缩温度为65℃，收集浓缩液。
（5）树脂吸附：将步骤（4）得到的浓缩液稀释至8birx，然后以流速为1BV/h上D101型大孔树脂层析柱，柱体积为300mL、径高比1:4，而后用体积质量分数为65%的3BV乙醇，以1.5BV/h的流速解吸，收集解吸液。
（6）浓缩干燥：将步骤（5）收集的解吸液在60℃下进行反渗透膜浓缩至Brix值为53%，得浓缩液，将浓缩液在温度为-10℃、真空度为13Pa的条件下真空冷冻干燥，即得17.5g酰化花青素产品，结果紫外检测，产品中酰化花青素含量为80.16%，酰化后保存率为89.32%。
实施例2
（1）固定化酶柱的准备：将大孔树脂固定化酶装柱，酶载体为苯乙烯树脂，酶为RML，柱体积为200mL，径高比为1:9，用体积质量分数为95%的乙醇以流速1BV/h洗柱3BV；
（2）底物的制备：将20g花青素（提取自蓝莓，花青素含量为92.01%）溶解于180g、体积质量分数为90%的乙醇中，然后再加入70g抗坏血酸和0.004g辅酶Q，室温下充分搅拌溶解，得底物；
（3）酶促酰化：将步骤（1）所得的底物以1BV/h的流速上柱于固定化酶柱，柱温保持在35±5℃，收集流出液。
（4）低温除醇：将步骤（2）收集的流出液用真空浓缩器进行浓缩，浓缩温度为60℃，回收乙醇，得浓缩液。
（5）树脂吸附：将步骤（4）得到的浓缩液稀释至4birx，然后以流速为1BV/h上AB-8型大孔树脂层析柱，柱体积为300mL、径高比为1:5、而后用体积质量分数为60%的4BV乙醇，以2BV/h的流速解吸，收集解吸液。
（6）浓缩干燥：将步骤（5）收集的解吸液载60℃下进行真空浓缩，浓缩至Brix值为60%，得浓缩液，将浓缩液在温度为-10℃、真空度为14Pa的条件下真空冷冻干燥，即得18.3g酰化花青素产品，结果紫外检测，产品中酰基化花青素含量为92.05%，酰化后保存率为91.54%。
实施例3
（1）固定化酶柱的准备：将大孔树脂固定化酶装柱，酶载体为丙烯酸酯树脂，酶为PSL，柱体积为200mL，径高比为1:6，用体积质量分数为90%的乙醇以流速1BV/h洗柱4BV；
（2）底物的制备：将20g花青素（提取自蓝莓，花青素含量为87.96%）溶解于140g、体积质量分数为95%的乙醇中，然后再加入90g月桂酸和0.016gβ胡萝卜素，室温下充分搅拌溶解，得底物；
（3）酶促酰化：将步骤（2）得到的底物以0.5BV/h的流速上柱于固定化酶柱，柱温保持在55±5℃，收集流出液。
（4）低温除醇：将步骤（3）收集的流出液用真空浓缩器浓缩，浓缩温度为70℃，回收乙醇，得到浓缩液。
（5）树脂吸附：将步骤（4）得到的浓缩液稀释至6.5birx，然后以0.6BV/h的流速上ADS-7型大孔树脂层析柱，柱体积为300mL、径高比为1:4，而后用体积质量分数为75%的1.5BV乙醇以1BV/h的流速解吸，收集解吸液。
（6）浓缩干燥：将解吸液在30℃下进行反渗透膜浓缩至Brix值为58%，得浓缩液，在温度为-15℃、真空度为10Pa的条件下真空冷冻干燥，即得17.4g酰化花青素产品，结果紫外检测，酰化后保存率为90.69%%。

Claims (10)

1.一种连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）底物的制备：将花青素及酰基供体一起溶于含有抗氧化剂的醇类溶剂中，得到底物；
（2）酶促酰化：将步骤（1）得到的底物上柱于固定化酶柱，收集流出液；
（3）低温除醇：将步骤（2）收集的流出液进行浓缩，回收醇类溶剂，得浓缩液；
（4）树脂吸附：将步骤（3）得到的浓缩液稀释后上吸附树脂柱后，用醇类溶剂解吸，收集解吸液；
（5）浓缩干燥：将步骤（4）收集的解吸液进行浓缩并干燥，即得酰化花青素产品。
2.根据权利要求1所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述固定化酶是经载体固定的南极假丝酵母脂肪酶B、毛霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶或猪胰脂肪酶；优选的，所述固定化酶的载体为二乙烯苯树脂、苯乙烯树脂或丙烯酸树脂；优选的，所述花青素提取自植物的根、茎、叶、花或/和果的组织器官的纯天然花青素；所述酰基供体为月桂酸、苯甲酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、水杨酸、乙酸、柠檬酸或丙二酸；所述抗氧化剂选自抗坏血酸、维生素E、β胡萝卜素和辅酶Q中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酰基供体与花青素的质量比为1:3～6；优选的，所述酰供体与花青素的质量比为1:4～5；所述醇类溶剂与花青素的质量比为8～15:1；优选的，所述醇类溶剂与花青素的质量比为10～13:1。
4.根据权利要求1-3任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述醇类溶剂为乙醇；优选的，所述乙醇是体积分数为80%～99%的乙醇/水溶液；更为优选的，乙醇是体积分数为85%～95%乙醇/水溶液；所述固定化酶柱的柱径高比为1:2～10；更为优选的，固定化酶柱的柱径高比为1:4～8；所述抗氧化剂添加量为花青素质量的0.01～0.1%。
5.根据权利要求1-4任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述上柱流速为0.1～1BV/h；优选的，所述上柱流速为0.2～0.5BV/h。
6.根据权利要求1-5任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，所述柱的温度为15～70℃；优选的，所述柱的温度为40～50℃。
7.根据权利要求1-6任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述浓缩采用低温真空浓缩，温度为50～70℃；更为优选的，低温真空浓缩的温度为60～65℃。
8.根据权利要求1-7任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述吸附树脂类型为D101、AB-8、X-5或ADS-7。
9.根据权利要求1-8任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述解吸所采用醇类溶剂的体积为2.5～5BV，解吸的流速为0.5～2BV/h，所述醇类溶剂是体积分数为60%～80%的乙醇/水溶液；优选的，所述解吸所采用醇类溶剂的体积为3～4BV，解吸的流速为1～1.5BV/h，所述醇类溶剂是体积分数为65%～70%的乙醇/水溶液。
10.根据权利要求1-9任一项所述连续酶促酰化花青素的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述浓缩为真空浓缩或反渗透膜浓缩，所述真空浓缩的温度为60～80℃，反渗透膜浓缩温度为0～60℃；更为优选的，所述低温浓缩为反渗透膜浓缩，所述浓缩的温度为4～40℃。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304265A (zh) * 2020-02-25 2020-06-19 暨南大学 一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996025500A1 (fr) * 1995-02-17 1996-08-22 Suntory Limited Genes codant pour des proteines ayant une activite acyltransferase
EP1567655A2 (de) * 2002-12-03 2005-08-31 Cognis France, S.A.S. Enzymatische herstellung von acylflavonoidderivaten
CN103435589A (zh) * 2013-09-17 2013-12-11 北京林业大学 一种提高蓝莓花青素稳定性的处理方法
CN110106220A (zh) * 2019-05-24 2019-08-09 湖南华诚生物资源股份有限公司 从芒果籽中制备小肽蛋白的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996025500A1 (fr) * 1995-02-17 1996-08-22 Suntory Limited Genes codant pour des proteines ayant une activite acyltransferase
EP1567655A2 (de) * 2002-12-03 2005-08-31 Cognis France, S.A.S. Enzymatische herstellung von acylflavonoidderivaten
CN103435589A (zh) * 2013-09-17 2013-12-11 北京林业大学 一种提高蓝莓花青素稳定性的处理方法
CN110106220A (zh) * 2019-05-24 2019-08-09 湖南华诚生物资源股份有限公司 从芒果籽中制备小肽蛋白的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱良玉等: "笃斯越橘酰化花青素稳定性分析", 《中国酿造》 *
阚建全等: "《食品化学》", 31 August 2016, 中国农业大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304265A (zh) * 2020-02-25 2020-06-19 暨南大学 一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法

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