CN114441758B - 一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法 - Google Patents

一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法。包括步骤如下：(1)制备海藻酸铜水凝胶和焦磷酸钠溶液；(2)制备梯度浓度的碱性磷酸酶标准溶液和甲胎蛋白标准溶液；(3)绘制碱性磷酸酶标准曲线；(4)绘制甲胎蛋白标准曲线；(5)检测待测样品中碱性磷酸酶和甲胎蛋白的含量。本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，具有操作过程简单，成本低，试剂消耗少等优点，碱性磷酸酶的检测限为1.7mU/mL，甲胎蛋白的定量检测限为0.8ng/mL，有效地解决了现有检测方法复杂、成本高的问题，为临床诊断和应用提供了发展前景。

Description

一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测 方法
技术领域
本发明提供了一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，属于检测分析技术领域。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是广泛分布在动物体内最重要的水解酶之一，它能催化生物分子去磷酸化，调节细胞生长、凋亡、信号转导等细胞周期过程。在临床诊断中，ALP作为重要的生物标记物可指示多种疾病，例如糖尿病，骨骼疾病，前列腺癌和肝功能异常等。此外，ALP由于其催化活性高、稳定性好、底物特异性广、易于与抗体结合等特点，被广泛用于酶联免疫吸附试验(ELISA)中作为标记酶。标记酶的高特异性抗原-抗体识别和高效的生物催化特性使ELISA已经成为临床诊断、食品质量控制、环境监测和实验室研究中最广泛使用的免疫分析形式。
甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。甲胎蛋白在胎儿血液循环中具有较高的浓度，出生后则下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。一般情况下，健康成人的AFP浓度低于25ng/mL，而肝癌的病理变化值可能会超过400ng/mL。
因此，对AFP的临床分子诊断显得十分重要，目前已报道的测定AFP免疫检测方法有荧光免疫法、电化学免疫法、化学发光免疫法和放射免疫法，尽管这些方法对灵敏检测生物标志物做出了巨大贡献，但必须提供和获得复杂的仪器和熟练的专业操作人员。因此，迫切需要开发一种技术简单、绿色、方便的免疫分析方法。即时诊断(POCT)技术产品降低了对配套设备和操作专业性的要求，可用于现场快速检测和疾病前期筛查诊断，可应用到基层医疗单位或在资源有限的偏远地区实现患者在家中实现自检。纸张具有天然的网状多孔结构，因而其比表面积较高，有助于分析物的扩散以及材料的固定化，大大缩短了分析时间。纸张资源丰富且成本很低，易于通过简单的加工技术进行批量化的生产，柔性可折叠的纸张更易于形成双层甚至3D构架的流体通道同时连接实现灵活的流体控制。此外，纸张可燃且生物相容性好，避免环境污染，轻薄柔性，利于运输。并且纸基不需要凭借其它的外力仅通过纸本身的毛细管作用便可以实现流体的运输。
综上所述，开发一种利用纸基，能够简单快速、灵敏检测碱性磷酸酶(ALP)和甲胎蛋白(AFP)浓度的分析方法在临床研讨中起着重要的研究意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法。在无需复杂的仪器和操作程序的情况下，实现对碱性磷酸酶以及肿瘤标志物甲胎蛋白的即时检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，包括步骤如下：
(1)向海藻酸盐溶液中添加铜离子溶液，混合均匀，得到海藻酸铜水凝胶；将焦磷酸钠溶于HEPES缓冲溶液中，得到焦磷酸钠溶液；
(2)将碱性磷酸酶标准品溶解于HEPES缓冲液中，得到梯度浓度的碱性磷酸酶标准溶液；将甲胎蛋白母液用PBS缓冲溶液稀释，得到梯度浓度的甲胎蛋白标准溶液；
(3)向步骤(2)制备的碱性磷酸酶标准溶液中添加焦磷酸钠溶液，混合均匀后在35～40℃下孵育50～70min，继续添加海藻酸铜水凝胶，然后将碱性磷酸酶混合物滴到pH试纸条的一端，爬行2～5min，测量碱性磷酸酶混合物在pH试纸条上的移动距离，绘制碱性磷酸酶标准曲线；
(4)向涂有包被抗体的微孔板中加入甲胎蛋白标准溶液，用封板膜盖上，振荡混匀，在35～40℃下孵育40～50min后，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入生物素标记的检测抗体，在37℃下孵育30min，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，反应20～40min，用洗涤液洗涤3次，拍干；继续加入焦磷酸钠溶液，在35～40℃下孵育50～70min；然后将孵育液添加至海藻酸铜水凝胶中，混合均匀，然后将甲胎蛋白混合物滴到pH试纸条的一端，爬行2～5min，测量甲胎蛋白混合物在pH试纸条上的移动距离，绘制甲胎蛋白标准曲线；
(5)将含碱性磷酸酶的待测样品溶解于HEPES缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤(3)所述的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照碱性磷酸酶标准曲线，得到待测样品中碱性磷酸酶的含量；将含甲胎蛋白的待测样品溶解于PBS缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤(4)所述的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照甲胎蛋白标准曲线，得到待测样品中甲胎蛋白的含量。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述海藻酸盐为海藻酸钠，浓度为0.1～0.3wt％。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述铜离子溶液为硫酸铜溶液，浓度为1～2mM，海藻酸盐溶液和铜离子溶液的体积比为1:1；
进一步优选的，所述硫酸铜溶液的浓度为2mM。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述HEPES缓冲溶液浓度为10mM，pH＝7.4。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述焦磷酸钠溶液中焦磷酸根的浓度为1～1.5mM。
进一步优选的，所述焦磷酸钠溶液中焦磷酸根的浓度为1.5mM。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述碱性磷酸酶标准溶液和焦磷酸钠溶液的体积比为1:1；所述碱性磷酸酶标准溶液和海藻酸铜水凝胶的体积比为1:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述碱性磷酸酶混合物的滴加量为30～40μL，在pH试纸条上爬行时间为3min。
根据本发明优选的，步骤(3)和步骤(4)中，所述pH试纸条为广范试纸条，尺寸为4mm×60mm。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述微孔板为96孔板，包被抗体为甲胎蛋白捕获抗体，检测抗体为生物素标记的甲胎蛋白检测抗体。甲胎蛋白包被抗体和生物素标记的甲胎蛋白检测抗体均来源于间接法检测甲胎蛋白试剂盒，添加量参照该试剂盒说明书。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的浓度为1μg/mL。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述检测抗体、焦磷酸钠溶液、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和海藻酸铜水凝胶的体积比为1:1:1:1。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述甲胎蛋白混合物的滴加量为30～40μL，在pH试纸条上爬行时间为3min。
根据本发明，上述基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，用于血清中碱性磷酸酶或甲胎蛋白的检测。
本发明的检测原理如下：
由于焦磷酸根对Cu2+具有很高的亲和力，Cu2+交联的海藻酸盐水凝胶对焦磷酸根离子具有响应性，焦磷酸根的加入会破坏海藻酸铜水凝胶的网络结构，导致凝胶-溶胶的快速转化。在碱性磷酸酶的存在下，焦磷酸根会被水解成磷酸盐离子，由于磷酸盐离子与Cu2+的亲和力较低，凝胶-溶胶转化将被抑制。基于这一原理，我们设计了一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，用于肉眼检测碱性磷酸酶和免疫分析，凝胶-溶胶转化的程度会影响水凝胶的粘度，进而影响反应混合物在试纸条上爬行距离的变化。
有益效果
1、本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，具有操作过程简单，成本低，试剂消耗少等优点，碱性磷酸酶的检测限为1.7mU/mL，甲胎蛋白的定量检测限为0.8ng/mL，有效地解决了现有检测方法复杂、成本高的问题，为临床诊断和应用提供了发展前景。
2、本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，可实现视觉读出碱性磷酸酶混合物在试纸条上流动的距离。同时通过免疫识别过程用碱性磷酸酶标记的检测抗体孔板上捕获抗体识别的甲胎蛋白，在此过程中甲胎蛋白的浓度最终将影响固定在孔板上碱性磷酸酶的浓度并与混合物在试纸条上爬行的距离建立间接关系，从而实现在不依赖复杂仪器的情况下，仅仅依靠纸基试纸条就能够实现快速定量、简单即时地检测碱性磷酸酶或甲胎蛋白。
附图说明
图1为基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法原理示意图。
图2为实施例1中不同铜离子使用浓度下海藻酸铜水凝胶在试纸条上移动距离示意图。
图3为实施例2中不同焦磷酸钠使用浓度下海藻酸铜水凝胶在试纸条上移动距离示意图。
图4为实施例3中梯度浓度的碱性磷酸酶混合物在试纸条上移动距离示意图。
图5为实施例3中碱性磷酸酶浓度对灰度(Cr)值的校准曲线。
图6为实施例4中检测血清中碱性磷酸酶的结果图。
图7为实施例5中梯度浓度甲胎蛋白混合物在试纸条上移动距离示意图。
图8为实施例5中甲胎蛋白浓度对灰度(Cr)值的校准曲线。
图9为实施例6中检测血清中甲胎蛋白的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明保护范围不限于此。
以下实施例中，海藻酸钠上海阿拉丁生化科技股份有限公司有售，碱性磷酸酶西格玛-奥德里奇上海贸易有限公司有售，甲胎蛋白标准品上海领潮生物有限公司有售，间接法检测甲胎蛋白试剂盒武汉默沙克生物科技有限公司有售。
若无其他特殊说明，本实施例中涉及的药品及试剂均为普通市售产品。
本发明检测方法的原理如图1所示，Cu2+交联的海藻酸盐水凝胶对焦磷酸根离子具有响应性，焦磷酸根的加入会破坏海藻酸铜水凝胶的网络结构，导致凝胶-溶胶的快速转化。在碱性磷酸酶的存在下，焦磷酸根会被水解成磷酸盐离子，由于磷酸盐离子与Cu2+的亲和力较低，凝胶-溶胶转化将被抑制。凝胶-溶胶转化的程度会影响水凝胶的粘度，进而影响反应混合物在试纸条上爬行距离的变化。因此，碱性磷酸酶的浓度将决定水凝胶的破化程度，从而可实现视觉读出混合物在试纸条上流动的距离。通过免疫识别过程用碱性磷酸酶标记的检测抗体孔板上捕获抗体识别的甲胎蛋白，在此过程中甲胎蛋白的浓度最终将影响碱性磷酸酶的浓度并与混合物在试纸条上爬行的距离建立间接关系，从而实现在不依赖复杂仪器的情况下，快速定量、简单即时地检测甲胎蛋白。
实施例1海藻酸铜水凝胶中铜离子浓度的确定
将海藻酸钠溶解于超纯水中，制得0.2wt％的海藻酸钠溶液。将硫酸铜溶于超纯水中，配制成浓度分别为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM的梯度硫酸铜溶液。将100μL海藻酸钠溶液和100μL梯度硫酸铜溶液在室温下分别混合均匀，得到海藻酸铜水凝胶。2h后各取35μL海藻酸铜水凝胶滴加于pH试纸条的一端，3min后海藻酸铜水凝胶在pH试纸条上爬行完成，测量其移动距离，结果如图2所示。
由图2可知，当铜离子浓度小于1mM时，所形成的混合物粘度较小，在试纸条上爬行的距离较长，当铜离子浓度大于2mM时，能够形成不溶的水凝胶并且在试纸条上爬行距离足够短。即在硫酸铜溶液浓度为1～2mM是均为合适的移动距离，其中以硫酸铜溶液浓度为2mM时效果最好，选择2mM的硫酸铜溶液用于后续的检测。
实施例2焦磷酸钠浓度的确定
将焦磷酸钠溶解于10mM HEPES缓冲溶液中，调至pH＝7.4，配制成浓度分别为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM的梯度焦磷酸钠溶液。将200μL梯度焦磷酸钠溶液分别加入到200μL实施例1制备的海藻酸铜水凝胶中，通过涡旋使其在室温下充分混合均匀，得到焦磷酸根-海藻酸铜水凝胶。2h后各取35μL焦磷酸根-海藻酸铜水凝胶滴加于pH试纸条的一端，3min后焦磷酸根-海藻酸铜水凝胶在pH试纸条上爬行完成，测量其移动的距离，结果如图3所示。
由于焦磷酸根与铜离子有很强的配位作用，会抢夺水凝胶中的铜离子。随着焦磷酸根浓度的增大，对水凝胶的破坏程度增大，混合物的粘度降低，因此混合物在试纸条上爬行的距离越长。由图3可知，当焦磷酸根浓度超过1.5mM时，水凝胶的结构基本被完全破坏，因此选择1.5mM的焦磷酸根浓度作为后续检测的最佳浓度。
实施例3碱性磷酸酶的检测
一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶检测方法，包括步骤如下：
将碱性磷酸酶溶解于10mM HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)中，配制成浓度分别为1mU/mL、10mU/mL、25mU/mL、50mU/mL、75mU/mL、100mU/mL的梯度碱性磷酸酶溶液。向200μL梯度碱性磷酸酶溶液分别加入至200μL的1.5mM的焦磷酸根溶液中，在37℃下孵育60min。将各反应混合液分别加入200μL实施例1制备的海藻酸铜水凝胶中，通过涡旋使其在室温下充分混合均匀，得到碱性磷酸酶混合物。2h后各取35μL碱性磷酸酶混合物滴加于pH试纸条的一端，3min后碱性磷酸酶混合物在pH试纸条上爬行完成，测量其移动的距离，结果如图4所示。然后根据碱性磷酸酶混合物在pH试纸条上留下水印的灰度(Cr)和对应的碱性磷酸酶溶液的浓度，绘制标准曲线，如图5所示。灰度(Cr)定义为水印面积与条带总面积的比值。使用Adobe Photoshop和Origin软件进行数据处理和统计。
碱性磷酸酶能够催化焦磷酸根反应生成磷酸根离子，磷酸根离子与铜离子的相互作用较弱，几乎不会对凝胶产生影响。随着碱性磷酸酶浓度的升高，其水解的焦磷酸根越多，从而抑制了水凝胶从凝胶向溶胶的转化，肉眼可清楚地直接看到反应混合物在试纸条上爬行的距离越短。从图5的校准曲线可以看出，混合物在试纸条上留下水的灰度(Cr)与碱性磷酸酶浓度在1-100mU/mL范围内呈线性关系，相关系数为0.991。根据3σ/k，计算碱性磷酸酶的检出限为1.7mU/mL。因此，本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶检测方法能够实现在不依赖复杂仪器的情况下，简单定量地检测碱性磷酸酶。
实施例4本发明方法用于血清中碱性磷酸酶的检测
将正常人血清用HEPES缓冲液中稀释100倍，然后向其中加入碱性磷酸酶溶液，得到浓度为5mU/mL、20mU/mL、35mU/mL、50mU/mL、65mU/mL的血清标准品，然后按照实施例3所述的方法进行检测，结果如图6所示。
由图6可知，随着碱性磷酸酶浓度的升高，梯度血清标准品在试纸条上爬行的距离越来越短，爬行距离对应的灰度(Cr)值分别为63.18、56.62、50.36、43.10和35.29，计算得到的碱性磷酸酶浓度分别为5.72、19.98、33.59、49.37、66.35mU/mL，最大误差不超过15％；在碱性磷酸酶浓度为20～65mU/mL时，最大误差不超过5％。因此，本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶检测方法能够实现血清中碱性磷酸酶的检测。
实施例5甲胎蛋白的检测
一种基于铜离子响应焦磷酸根的甲胎蛋白检测方法，包括步骤如下：
(1)将1mg/mL甲胎蛋白标准溶液用PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)进行稀释，配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、30ng/mL的梯度甲胎蛋白溶液；
(2)在涂有甲胎蛋白捕获抗体的96孔板的每个孔中分别加入50μL梯度甲胎蛋白溶液，用封板膜盖上，轻轻振荡混匀，在37℃下孵育45min后，用洗涤液洗涤孔板3次，拍干；
(3)加入50μL生物素标记的甲胎蛋白检测抗体，在37℃下孵育30min，用洗涤液洗涤孔板3次，拍干；
(4)向孔板中分别加入50μL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素反应30min，用洗涤液洗涤3次，拍干；继续加入50μL焦磷酸钠溶液，在37℃下孵育60min，然后孵育液添加至海藻酸铜水凝胶中加入到50μL实施例1制备的海藻酸铜水凝胶中，通过涡旋使其在室温下充分混合均匀，得到甲胎蛋白混合物；2h后取35μL甲胎蛋白混合物于pH试纸条的一端，3min后甲胎蛋白混合物在pH试纸条上爬行完成，测量其移动的距离，结果如图7所示。然后根据甲胎蛋白混合物在pH试纸条上留下水印的灰度(Cr)和对应的甲胎蛋白溶液的浓度，绘制标准曲线，如图8所示。
通过特异性抗原-抗体免疫反应，将捕获抗体，甲胎蛋白和碱性磷酸酶结合的检测抗体先后固定在96孔板上。在此过程中甲胎蛋白的浓度最终将影响孔板上固定的碱性磷酸酶的浓度，从而与混合物在试纸条上爬行的距离建立间接关系。由图7可知，随着甲胎蛋白浓度的升高，固定的碱性磷酸酶的浓度越高，甲胎蛋白混合物在试纸条上爬行的距离越来越短。由图8可知，甲胎蛋白混合物在试纸条上留下水的灰度(Cr)与甲胎蛋白浓度在0.5-30ng/mL范围内呈线性关系，相关系数为0.982。根据3σ/k，计算碱性磷酸酶的检出限为0.8ng/mL。因此，本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的甲胎蛋白检测方法能够实现在不依赖复杂仪器的情况下，简单定量地检测甲胎蛋白。
实施例6本发明方法用于血清中甲胎蛋白的检测
将正常人血清用PBS缓冲液稀释100倍，然后向其中加入甲胎蛋白溶液，得到浓度为0.8ng/mL、8ng/mL、18ng/mL的梯度血清标准品，然后按照实施例5所述的方法进行检测，结果如图9所示。
由图9可知，随着甲胎蛋白浓度的升高，梯度血清标准品在试纸条上爬行的距离越来越短，爬行距离对应的灰度(Cr)值分别为61.50、61.14、53.72和42.65，计算得到的甲胎蛋白浓度分别为0.47、0.85、7.88、18.42ng/mL，最大误差不超过6.5％。因此，本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的甲胎蛋白检测方法能够实现血清中甲胎蛋白的检测。
以上所述仅为本发明的具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权力要求所界定的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种基于铜离子响应焦磷酸根的以非诊断目的检测碱性磷酸酶或甲胎蛋白的检测方法，包括步骤如下：
（1）向海藻酸盐溶液中添加铜离子溶液，混合均匀，得到海藻酸铜水凝胶；将焦磷酸钠溶于HEPES缓冲溶液中，得到焦磷酸钠溶液；
所述海藻酸盐为海藻酸钠，浓度为0.2 wt%；所述铜离子溶液为硫酸铜溶液，浓度为2mM，海藻酸盐溶液和铜离子溶液的体积比为1:1；所述焦磷酸钠溶液中焦磷酸根的浓度为1.5mM；
（2）将碱性磷酸酶标准品溶解于HEPES缓冲液中，得到梯度浓度的碱性磷酸酶标准溶液；将甲胎蛋白母液用PBS缓冲溶液稀释，得到梯度浓度的甲胎蛋白标准溶液；
（3）向步骤（2）制备的碱性磷酸酶标准溶液中添加焦磷酸钠溶液，混合均匀后在35~40℃下孵育50~70min，继续添加海藻酸铜水凝胶，然后将碱性磷酸酶混合物滴到pH试纸条的一端，爬行2~5min，测量碱性磷酸酶混合物在pH试纸条上的移动距离，绘制碱性磷酸酶标准曲线；所述碱性磷酸酶混合物的滴加量为30~40μL；
（4）向涂有包被抗体的微孔板中加入甲胎蛋白标准溶液，用封板膜盖上，振荡混匀，在35~40℃下孵育40~50 min后，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入生物素标记的检测抗体，在37℃下孵育30 min，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，反应20~40min，用洗涤液洗涤3次，拍干；继续加入焦磷酸钠溶液，在35~40℃下孵育50~70 min；然后将孵育液添加至海藻酸铜水凝胶中，混合均匀，然后将甲胎蛋白混合物滴到pH试纸条的一端，爬行2~5min，测量甲胎蛋白混合物在pH试纸条上的移动距离，绘制甲胎蛋白标准曲线；所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的浓度为1 μg/mL，所述检测抗体、焦磷酸钠溶液、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和海藻酸铜水凝胶的体积比为1:1:1:1；
（5）将含碱性磷酸酶的待测样品溶解于HEPES缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤（3）的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照碱性磷酸酶标准曲线，得到待测样品中碱性磷酸酶的含量；将含甲胎蛋白的待测样品溶解于PBS缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤（4）的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照甲胎蛋白标准曲线，得到待测样品中甲胎蛋白的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述碱性磷酸酶标准溶液和焦磷酸钠溶液的体积比为1:1；所述碱性磷酸酶标准溶液和海藻酸铜水凝胶的体积比为1:1。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，在pH试纸条上爬行时间为3min。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中，所述pH试纸条为广范试纸条，尺寸为4 mm×60 mm。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述微孔板为96孔板，包被抗体为甲胎蛋白捕获抗体，检测抗体为生物素标记的甲胎蛋白检测抗体。
6.权利要求1所述基于铜离子响应焦磷酸根的以非诊断目的检测碱性磷酸酶或甲胎蛋白的检测方法在检测血清中碱性磷酸酶或甲胎蛋白中应用。
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