CN114660286A - 一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种可溶性fms样酪氨酸激酶‑1测定试剂盒及其制备方法，涉及生物检测试剂盒技术领域。一种可溶性fms样酪氨酸激酶‑1测定试剂盒包括：稀释液和检测卡，上述检测卡包括底板、样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；此外本发明还提出一种可溶性fms样酪氨酸激酶‑1测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：样品垫的制备、荧光微球结合物垫的制备、包被膜的制备、检测卡的组装。本发明的优点在于，通过荧光免疫分析仪测定样本浓度，即可完成待检血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶‑1含量的测定，整个过程操作简单，且具有高准确度和灵敏度，通过仪器测定，减少人为因素干扰。

Description

一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂盒技术领域，具体而言，涉及一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
已有研究表明孕中期孕妇血清中可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平的检测对先兆子痫的发生有良好的预测价值，且有研究说明子痫前期胎盘形成不良、胎盘低灌注及胎盘缺氧在子痫前期发病中有重要作用，因此sFlt-1的检测在辅助诊断先兆性子痫方面有重要的意义。但sFlt-1检测值不能作为单一判断早发型子痫前期的依据，更不能作为终止妊娠的依据，需要结合临床症状及子宫动脉血流PI和RI等联检结果。
目前可溶性fms样酪氨酸激酶-1的检测方法主要有：化学发光法、电化学发光法等。化学发光及电化学发光法需要大型的操作仪器，且对操作人员要求很高。因此研发一种检测结果准确性高，操作简便、快速，方便临床应用的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒，该测定试剂盒采用荧光免疫层析法对可溶性fms样酪氨酸激酶-1进行测定，通过荧光免疫分析仪测定检测浓度，即可完成待检人血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1的定量测定，减少了人为因素对结果的误判；且本试剂盒具有高灵敏度、高准确度、高稳定性和高重复性；
本发明的另一目的在于提供一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，该制备方法工艺简单，不需要苛刻的实验条件；经济实用，不需要特别昂贵的试剂和仪器便可以开展。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一方面，本申请实施例提供一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒包括：稀释液和检测卡，检测卡包括底板、样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次连接并固定于所述底板上，荧光微球结合物垫固定有荧光微球标记的鼠抗sFlt-1抗体2，硝酸纤维素膜设有包被鼠抗sFlt-1抗体1的检测线和包被羊抗鼠IgG的质控线。
另一方面，本申请实施例提供一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
样品垫的制备：将玻璃纤维素膜放入表面活性剂溶液中浸泡后干燥；
荧光微球结合物垫的制备：1)、荧光微球经活化剂活化；2)、抗体与活化后的荧光微球偶联，获得荧光微球结合物溶液；3)、将上述荧光微球结合物溶液喷涂在结合物垫上；
包被膜的制备：将上述鼠抗sFlt-1抗体1稀释至工作浓度后划在所述检测线，将羊抗鼠IgG稀释至工作浓度后划在所述质控线；
检测卡的组装：将干燥后的包被膜、荧光微球结合物垫、样品垫及吸水纸依次粘贴于底板上，并裁切成试纸条，装入卡壳得到所述的检测卡。
相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
本发明开发的可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒采用荧光免疫层析法对可溶性fms样酪氨酸激酶-1进行测定，通过荧光免疫分析仪测定检测浓度，即可完成待检人血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1的定量测定，减少了人为因素对结果的误判；且本试剂盒具有高灵敏度、高准确度、高稳定性和高重复性；本试剂盒的制备工艺简单，不需要苛刻的实验条件；经济实用，不需要特别昂贵的试剂和仪器便可以开展；本试剂盒小巧便捷，方便临床使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中检测卡的结构示意图；
图2为本发明实验例2中线性测定结果；
图3为本发明实施例中试剂盒操作示意图。
图标：1-样品垫；2-荧光微球结合物垫；3-硝酸纤维素膜；4-吸水纸；5-底板。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒包括：稀释液和检测卡，检测卡包括底板、样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次连接并固定于所述底板上，荧光微球结合物垫固定有荧光微球标记的鼠抗sFlt-1抗体2，硝酸纤维素膜设有包被鼠抗sFlt-1抗体1的检测线和包被羊抗鼠IgG的质控线。
本发明开发的可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒采用荧光免疫层析法对可溶性fms样酪氨酸激酶-1进行测定，通过荧光免疫分析仪测定检测浓度，即可完成待检人血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1的定量测定，减少了人为因素对结果的误判；且本试剂盒具有高灵敏度、高准确度、高稳定性和高重复性。
在本发明的一些实施例中，上述样品垫为表面活性剂处理干燥后的玻璃纤维膜。表面活性剂(surfactant)被誉为“工业味精”，是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。在表面活性剂存在的条件下，降低水的表面张力，样品垫才更容易被水所润湿，形成水悬液，从而有利于标记物的释放与层析。
在本发明的一些实施例中，上述稀释液包括磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液(PB，Phosphate Buffer)，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，通常使用的有磷酸钠缓冲液(NaH2PO4&Na2HPO4)，由于它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广，具有优良的缓凝性能及稳定性能，因此在试剂盒的制备过程中，采用磷酸盐缓冲液有利于创造合成反应的pH环境。
在本发明的一些实施例中，上述硝酸纤维素膜包被鼠抗sFlt-1抗体1和羊抗鼠IgG的工作浓度分别为0.5～1.0mg/mL和1.0～2.0mg/mL。抗sFlt-1抗体1和羊抗鼠IgG均为蛋白质大分子，硝酸纤维素膜吸附蛋白的最大量为0.004mg/cm，对应工作液体积为0.001mL，即工作液的浓度最大为4mg/mL，羊抗鼠为质控线、鼠抗sFlt-1抗体1为检测线，检测线工作浓度应大于质控线，且工作浓度低于0.5mg/mL时蛋白活性会过于偏低，因此包被鼠抗sFlt-1抗体1和羊抗鼠IgG的最佳工作浓度分别为0.5～1.0mg/mL和1.0～2.0mg/mL。
在本发明的一些实施例中，上述鼠抗sFlt-1抗体1在检测线的喷量为0.5μL/cm～1.0μL/cm，上述羊抗鼠IgG在质控线的喷量为0.5μL/cm～1.0μL/cm。硝酸纤维素膜又称为NC膜，在试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。所以NC膜成为该试验中最重要的耗材。喷点上去的是均匀的抗体溶液，溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷液量低于0.5uL/cm时，受仪器精密度、人员操作及温湿度的影响较大而导致CV偏大；但当喷液量＞1uL/cm时，喷液后由于线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，从而导致线条不均匀且呈中空现象。
一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
样品垫的制备：将玻璃纤维素膜放入表面活性剂溶液中浸泡后干燥；
荧光微球结合物垫的制备：1)、荧光微球经活化剂活化；2)、抗体与活化后的荧光微球偶联，获得荧光微球结合物溶液；3)、将所述荧光微球结合物溶液喷涂在结合物垫上；
包被膜的制备：将上述鼠抗sFlt-1抗体1及羊抗鼠IgG分别稀释至工作浓度后划在上述检测线及质控线；
检测卡的组装：将干燥后的包被膜，荧光微球结合物垫、样品垫及吸水纸依次粘贴于底板上，并裁切成试纸条，装入上述底板得到上述的检测卡。
本试剂盒的制备工艺流程简单，不需要苛刻的实验条件；经济实用，不需要特别昂贵的试剂和仪器便可以开展。
在本发明的一些实施例中，上述荧光微球的活化步骤需要活化剂，上述荧光微球与上述活化剂质量比例为1.0mg/0.1mg～1.0mg/0.5mg。微球表面修饰有羧基，羧基可以通过碳二亚胺法、混合酸酐法等与蛋白上的氨基形成酰胺键，其中碳二亚胺法在这类化合物的偶联反应中的应用最为广泛。为了减少蛋白分子间的自身聚合，可以先将分子上的羧基转化为N—羟基琥珀酰亚胺的活泼酯，然后再与抗体交联。荧光微球与活化剂质量比例为1.0mg/0.1mg～1.0mg/0.5mg，在此比例范围内，可极大提高荧光微球表面羧基转化为N—羟基琥珀酰亚胺活泼酯的产率。
在本发明的一些实施例中，上述活化剂为0.1M的MES缓冲液，所述MES缓冲液包括1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。微球表面修饰有羧基，羧基可以通过碳二亚胺法、混合酸酐法等与蛋白上的氨基形成酰胺键，其中碳二亚胺法在这类化合物的偶联反应中的应用最为广泛。为了减少蛋白分子间的自身聚合，可以加入1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺先将分子上的羧基转化为N—羟基琥珀酰亚胺的活泼酯，而0.1M MES可为生成此活性酯提供酸性环境，然后再与抗体交联。
在本发明的一些实施例中，上述鼠抗sFlt-1抗体2与上述荧光微球的偶联比例为50μg-Ab/mg-beads～200μg-Ab/mg-beads。鼠抗sFlt-1抗体2末端含有氨基可与荧光微球表面的羧基形成共价键，偶联比例为50μg-Ab/mg-beads～200μg-Ab/mg-beads可尽可能地提高抗体与荧光微球的偶联率及灵敏度。
在本发明的一些实施例中，上述荧光微球结合物溶液喷涂的量为2μL/cm2～4μL/cm2。荧光微球结合物喷涂后需要尽快烘干，玻璃纤维素膜单位面积的吸液量最大不超过9μL，喷涂量过小会增大因仪器精度等导致的系统误差，故综合将荧光微球结合物溶液喷涂的量控制在2μL/cm2～4μL/cm2既能保证尽快干燥又能尽可能减小系数误差，又不会超过玻璃纤维吸液量。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
0.1M MES缓冲液(pH 6.0)配制(配制500mL为例)：在分析天平上准确称取9.75gMES充分溶解于400mL纯化水，用1M NaOH溶液调节pH至6.0，再以纯化水定容至500mL。
0.5M PB溶液(pH 7.2)配制(配制500mL为例)：在分析天平上准确称取84.8g十二水合磷酸氢二钠、2.063g二水合磷酸二氢钠充分溶解于400mL纯化水中，再以纯化水定容至500mL。
活化剂的配制(配制100μL为例)：在分析天平上准确称取1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)充分溶解于100μL 0.1MMES(pH 6.0)溶液中。
含有0.5％BSA和5％蔗糖的0.5M的PB缓冲液(pH 7.2)配制(配制100mL为例)：在分析天平上依次称取0.5g BSA、5g蔗糖充分溶于50mL0.5M的PB(pH 7.2)溶液中，再以0.5M的PB溶液(pH 7.2)定容至100mL。
样本稀释液的制备，包括以下步骤：
样本稀释液的配制：用分析天平准确称取1.15g磷酸氢二钠、0.231g磷酸二氢钠，加入装有1000mL纯化水的烧杯中，并用玻璃棒进行搅拌，让其充分溶解。将配制好的样本稀释液进行分装，装量为400μL/管。
样品垫的制备：用移液枪吸取2mL吐温-20加入装有1000mL纯化水的烧杯中，充分混合均匀后得到样品垫处理液。将玻璃纤维素膜放入样品垫处理液中浸泡0.5h后充分干燥，制备好的玻璃纤维素膜外观呈白色。
荧光微球结合物垫的制备：用移液枪吸取0.2mL荧光微球(含2mg荧光微球)于离心管中，然后加入1.8mL 0.1M的MES缓冲液，并充分混悬。向上述溶液中加入50μL活化剂，在旋转混匀器上旋转活化30min。其中活化剂是含有10mg/mL EDC与10mg/mL NHS的0.1M的MES缓冲液，荧光微球与上述活化剂的质量比例为1.0mg/0.1mg。向上述活化后的荧光微球溶液中加入200μg鼠抗sFlt-1抗体2，在旋转混匀器上旋转混匀60min，然后离心15min后弃上清，离心机转速为13000rpm。向沉淀物中加入2mL含有0.5％BSA和5％蔗糖的0.5M PB缓冲液，超声混匀后得到荧光微球结合物溶液。将上述配制好的荧光微球结合物溶液，按照4μL/cm2的喷量喷涂在结合物垫上，喷涂好后将其进行充分干燥，即得到荧光微球结合物垫。
包被膜的制备：用含有5％海藻糖的0.02M的Tris缓冲液将鼠抗sFlt-1抗体1稀释至0.5mg/mL，为检测线工作液。用含有5％海藻糖的0.02M的Tris缓冲液将羊抗鼠IgG稀释至1.0mg/mL，为质控线工作液。在硝酸纤维素膜上使用检测线工作液按照1μL/cm的喷量在检测线区域内划T线，使用质控线工作液按照1μL/cm的喷量在质控线区域内划C线，将划好线硝酸纤维素膜放置在35℃的烘箱中烘干24h。
检测卡的组装：将干燥后的样品垫、荧光微球结合物垫、包被膜及吸水纸依次粘贴于底板上，并裁切成4mm宽试纸条，将试纸条装入卡壳得到所述的检测卡。
实施例2
本实施例与实施例1的制备方法基本相同，区别在于：1、本实施例中包被膜的制备中检测线工作液浓度为1.0mg/mL，质控线工作液浓度为2.0mg/mL；2、荧光微球与上述活化剂质量比例为1.0mg/0.5mg；3、鼠抗sFlt-1抗体2与荧光微球的偶联比例为50μg-Ab/mg-beads；4、荧光微球结合物溶液喷涂的量为2μL/cm2；5、鼠抗sFlt-1抗体1在检测线的喷量为0.5μL/cm，羊抗鼠IgG在质控线的喷量为0.5μL/cm。
实施例3
本实施例与实施例1的制备方法基本相同，区别在于：1、本实施例中包被膜的制备中检测线工作液浓度为0.5mg/mL，质控线工作液浓度为1.0mg/mL；2、荧光微球与上述活化剂质量比例为1.0mg/0.3mg；3、鼠抗sFlt-1抗体2与荧光微球的偶联比例为100μg-Ab/mg-beads；4、荧光微球结合物溶液喷涂的量为3μL/cm2；5、鼠抗sFlt-1抗体1在检测线的喷量为0.8μL/cm，羊抗鼠IgG在质控线的喷量为0.8μL/cm。
实施例4
本实施例与实施例1的制备方法基本相同，区别在于：1、包被膜的制备中检测线工作液浓度为0.8mg/mL，质控线工作液浓度为1.5mg/mL；2、荧光微球与上述活化剂质量比例为1.0mg/0.2mg；3、鼠抗sFlt-1抗体2与荧光微球的偶联比例为150μg-Ab/mg-beads。
实施例5
本实施例与实施例1的制备方法基本相同，区别在于：1、本实施例中荧光微球与上述活化剂质量比例为1.0mg/0.4mg；2、鼠抗sFlt-1抗体2与荧光微球的偶联比例为180μg-Ab/mg-beads。
实验例1
本实施例中所涉及内控品为医院收集的真实临床样本，选用的样本类型为血清，试剂盒检测所用仪器为北京泰格科信生物科技有限公司生产的荧光免疫分析仪(Tigsun-600)，根据样本相对荧光信号处理值(T/C：T为检测线荧光信号，C为质控线荧光信号。)及试剂自带的校准曲线，计算出该样本浓度值，即可完成待检血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1含量的测定。
空白限的测定：以实施例1中所制的20个检测卡对样本稀释液进行80-120μL加样检测，计录其测定值并计算其均值
Figure BDA0003522246300000101
及标准差SD，其空白限的标准区间设定为＜15pg/mL，其测定结果如表1所示。
表1空白限测定结果
Figure BDA0003522246300000111
由表1可知，针对实施例1中制得的检测卡所测出的空白限为8.23pg/mL<15pg/mL，该实验结果表明本检测卡的灵敏度满足要求。
实验例2
本实施例中所涉及内控品为医院收集的真实临床样本，选用的样本类型为血清，试剂盒检测所用仪器为北京泰格科信生物科技有限公司生产的荧光免疫分析仪(Tigsun-600)，根据样本相对荧光信号处理值(T/C：T为检测线荧光信号，C为质控线荧光信号。)及试剂自带的校准曲线，计算出该样本浓度值，即可完成待检血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1含量的测定。
线性范围的测定：用上述样本稀释液将样本分别稀释至25pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL、4000pg/mL、6000pg/mL、8000pg/mL、10000pg/mL，用上述实施例1中制得的21个检测卡对上述不同浓度的样本进行检测，计录其测定值并计算其平均值和相关系数R，其相关系数R≥0.990为满足要求，其测定结果如表2、图2所示。
表2线性范围的测定结果
Figure BDA0003522246300000112
Figure BDA0003522246300000121
由表2及图2分析可知，在线性范围30-10000pg/mL内，反应曲线的相关系数R为0.998>0.990，该实验结果表明本检测卡线性良好，满足要求。
实验例3
本实施例中所涉及内控品为医院收集的真实临床样本，选用的样本类型为血清，试剂盒检测所用仪器为北京泰格科信生物科技有限公司生产的荧光免疫分析仪(Tigsun-600)，根据样本相对荧光信号处理值(T/C：T为检测线荧光信号，C为质控线荧光信号。)及试剂自带的校准曲线，计算出该样本浓度值，即可完成待检血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1含量的测定。
重复性变异系数(CV)的测定：以实施例1中所制的3个批号的60个检测卡分别针对5000±1500pg/mL和50±15pg/mL的样本各测30个检测卡，计录其测定值并计算其平均值及标准差SD，从而计算其批内及批间的重复性变异系数(CV)，批内CV应≤15.0％，批间CV应≤20.0％为满足要求，其测定结果如表3所示。
表3重复性变异系数测定
Figure BDA0003522246300000122
Figure BDA0003522246300000131
由表3可知，3个批号的60个检测卡对于样本浓度为5000pg/mL和50pg/mL的批内CV均在10％以内、批间CV均在11％以内，满足批内CV应≤15.0％，批间CV应≤20.0％的标准，该实验结果表明本检测卡重复性良好，满足要求。
实验例4
本实施例中所涉及内控品为医院收集的真实临床样本，选用的样本类型为血清，试剂盒检测所用仪器为北京泰格科信生物科技有限公司生产的荧光免疫分析仪(Tigsun-600)，根据样本相对荧光信号处理值(T/C：T为检测线荧光信号，C为质控线荧光信号。)及试剂自带的校准曲线，计算出该样本浓度值，即可完成待检血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1含量的测定。
准确度的检测：以实施例1中的6个检测卡分别将浓度约为6000pg/mL(允许其浓度偏差为±20％)的可溶性fms样酪氨酸激酶-1样品A加入到血清或者其他相应基质的样品B中，所加入样品A的体积为样品A和B总体积(A+B)的10％，回收样本与低值样本各测3个检测卡并分别求其平均值，根据公式计算回收率R，回收率R的标准区间为85％～115％，其测定结果如表4所示。
Figure BDA0003522246300000141
式中：R-回收率；V-样品A的体积；V0-样品B的体积；C-样品B中加入样品A后的检测浓度；C0—样品B的浓度；Cs—样品A的浓度。
表4准确度测定
Figure BDA0003522246300000142
由表4可知，其回收率为101.26％，在标准区间85％～115％内，该实验结果表明本检测卡准确度良好，满足要求。
由表1-表4可知，本实施例1中所制备的检测卡，其空白限为8.23pg/mL<15pg/mL；线性相关系数R为0.998>0.990；对于样本浓度为5000pg/mL和50pg/mL的批内CV均在10％以内、批间CV均在11％以内，满足批内CV应≤15.0％，批间CV应≤20.0％的标准；准确度回收率为101.26％，在标准区间85％～115％内，上述实验结果表明本试剂盒性能良好，满足要求。
实验例5
本实验例将联合一种市售的人胎盘生长因子(PLGF)测定试剂盒提供一种子痫前期测定试剂的临床应用。本实验例所以样本均为临床样本，样本类型为：
根据试剂盒不同孕周段参考区间判定结果，试剂盒的参考区间一般由正常人血样或其它样本测定值的5％-95％来作为参考区间值，不同孕周段参考区间见表5。
表5子痫前期测定试剂盒参考区间
Figure BDA0003522246300000151
表6临床样本检测结果
Figure BDA0003522246300000152
Figure BDA0003522246300000161
表6中+代表阳性，-代表阴性，↑代表高于参考范围上限，↓代表低于参考范围下限。从表5和表6可知，临床诊断阳性样本11例，阴性样本14例，试剂盒检测出10例阳性样本，灵敏度高达90％，12例阴性样本，与临床结果一致。另外有G8、G24两例临床阴性样本试剂盒检测为阳性，需进行更多的临床观察检测。
综上所述，本发明实施例的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒包括：稀释液和检测卡，检测卡包括底板、样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次连接并固定于所述底板上，荧光微球结合物垫固定有荧光微球标记的鼠抗sFlt-1抗体2，硝酸纤维素膜设有包被鼠抗sFlt-1抗体1的检测线和包被羊抗鼠IgG的质控线。本试剂盒采用荧光免疫层析法对可溶性fms样酪氨酸激酶-1进行测定，通过荧光免疫分析仪测定检测浓度，即可完成待检人血清、血浆样本中可溶性fms样酪氨酸激酶-1的定量测定，减少了人为因素对结果的误判；且本试剂盒具有高灵敏度、高准确度、高稳定性和高重复性。本试剂盒小巧便捷，方便临床使用。
本发明实施例的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法包括如下步骤：样品垫的制备、荧光微球结合物垫的制备、包被膜的制备和检测卡的组装。本试剂盒的制备工艺流程简单，不需要苛刻的实验条件；经济实用，不需要特别昂贵的试剂和仪器便可以开展。
本发明提供的子痫前期测定试剂的临床应用，先于临床症状出现前鉴别正常妊娠和先兆子痫，成本低，准确性高，操作简便、快速，可实现随到随诊，方便临床应用，实现对子痫患者早诊断、早治疗，具有较高的临床应用价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒，其特征在于，其包括：稀释液和检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、荧光微球结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次连接并固定于所述底板上，所述荧光微球结合物垫固定有荧光微球标记的鼠抗sFlt-1抗体2，所述硝酸纤维素膜设有包被鼠抗sFlt-1抗体1的检测线和包被羊抗鼠IgG的质控线。
2.根据权利要求1所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒，其特征在于，所述样品垫为经表面活性剂处理干燥后的玻璃纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜包被鼠抗sFlt-1抗体1和羊抗鼠IgG的工作浓度分别为0.5～1.0mg/mL和1.0～2.0mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒，其特征在于，所述鼠抗sFlt-1抗体1在检测线的喷量为0.5μL/cm～1.0μL/cm，所述羊抗鼠IgG在质控线的喷量为0.5μL/cm～1.0μL/cm。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
样品垫的制备：将玻璃纤维素膜放入表面活性剂溶液中浸泡后干燥；
荧光微球结合物垫的制备：1)、荧光微球经活化剂活化；2)、抗体与活化后的荧光微球偶联，获得荧光微球结合物溶液；3)、将所述荧光微球结合物溶液喷涂在结合物垫上；
包被膜的制备：将所述鼠抗sFlt-1抗体1稀释至工作浓度后划在所述检测线，将羊抗鼠IgG稀释至工作浓度后划在所述质控线；
检测卡的组装：将干燥后的包被膜、荧光微球结合物垫、样品垫及吸水纸依次粘贴于底板上，并裁切成试纸条，装入卡壳得到所述的检测卡。
7.根据权利要求6所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述荧光微球的活化步骤具体为：将所述荧光微球经活化剂活化，所述荧光微球与所述活化剂质量比例为1.0mg/0.1mg～1.0mg/0.5mg。
8.根据权利要求6所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述活化剂为0.1M的MES缓冲液，所述MES缓冲液包括1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
9.根据权利要求6所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述鼠抗sFlt-1抗体2与所述荧光微球的偶联比例为50μg-Ab/mg-beads～200μg-Ab/mg-beads。
10.根据权利要求6所述的一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述荧光微球结合物溶液喷涂的量为2μL/cm2～4μL/cm2。
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