CN116008561A - 一种白介素-6的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种白介素‑6的检测方法及试剂盒，其具有高灵敏度、宽线性范围，能够满足现有的检测需求，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：步骤1、将50μL待测样本、50μL生物素化抗体和50μL酶标记抗体加入至化学发光微孔板中混匀；所述生物素化抗体为生物素与白介素‑6单克隆抗体偶联得到的产物；所述酶标记抗体为辣根过氧化物与白介素‑6单克隆抗体偶联得到的产物；步骤2、进行孵育：在37℃的温度下，一起孵育10min；步骤3、进行清洗：将350μL清洗液加入到微孔中，清洗四次，将未结合在固相上的抗体和被测样本清除；步骤4、进行读数：加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；步骤5、利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的白介素‑6含量。
Description
技术领域
本发明属于白介素-6检测相关技术领域，具体涉及一种白介素-6的检测方法及试剂盒。
背景技术
对急诊感染常用的检测方法包括：血常规、胸部影像以及微生物学检查，但血常规检测不能客观地反映严重感染者的真实情况；胸片可能出现漏诊；胸部CT的敏感性和特异性虽然优于胸片，但不适用于危重患者，且不便随访；微生物学检查虽被视为“金标准”，但其耗时长，而且很多到达急诊室的患者都已接受了抗感染治疗，影响病原体的检出率。所以，急诊科迫切需要更为“理想”的生物标志物能在感染早期发生显著变化，不受非感染因素影响，以实现在紧急情况下的早诊早治；可鉴别诊断病原体类型，在复杂而连续变化的过程中，帮助评估感染的严重程度和预后；准确有效地指导抗菌药的使用，从而提高治疗成功率，降低死亡率，更有效地利用医疗资源。
为了顺应市场需求，近年来用血清标志物作为诊断标准以其快速、便捷、创伤小、费用低的特点越来越受关注。目前研究比较多的血清炎症标志物有降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)。其中，白介素-6有如下临床价值：1)当感染和炎症发生后，白介素-6率先生成且水平迅速升高，可在2h达高峰，其升高水平与感染的严重程度相一致，并诱导降钙素原(PCT)和CRP分别在感染2h和6h后开始升高。2)白介素-6是急性感染早期诊断的灵敏指标，尤其可作为对患者感染早期的鉴别诊断指标，并对制定患儿治疗方案和改善预后具有重要的参考意义。3)白介素-6升高与疾病的严重程度呈正相关，增高幅度反应病情的严重程度。在危重患者中可持续长时间高水平的表达，可作为评估脓毒症和MODS患者严重程度和预后的敏感指标，并能更快反映抗生素治疗的效果。4)白介素-6鉴别感染与非感染的敏感性高于PCT和CRP，还可用来评价感染严重程度和评估预后，当白介素-6>1000pg/mL时预警重症感染患者预后不良，提示临床医师及时调整诊疗方案。因此近年来IL-6作为一种炎症标志物在临床应用上越来越广泛。
由于白介素-6在健康人群中的含量极低＜7pg/mL，现有的检测试剂盒无法满足该项目灵敏度的要求；同时脓毒症患者体内的白介素-6会出现＞5000pg/mL的现象，所以试剂盒需具备宽线性范围。因此当前亟需设计一种新型的白介素-6的检测方法及试剂盒来满足高灵敏度、宽线性范围的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白介素-6的检测方法及试剂盒，其具有高灵敏度、宽线性范围，能够满足现有的检测需求。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
步骤1、将50μL待测样本、50μL生物素化抗体和50μL酶标记抗体加入至化学发光微孔板中混匀；
所述生物素化抗体为生物素与白介素-6单克隆抗体偶联得到的产物；
所述酶标记抗体为辣根过氧化物与白介素-6单克隆抗体偶联得到的产物；
步骤2、进行孵育：在37℃的温度下，一起孵育10min；
步骤3、进行清洗：将350μL清洗液加入到微孔中，清洗四次，将未结合在固相上的抗体和被测样本清除；
步骤4、进行读数：加入发光底物，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；
步骤5、利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的白介素-6含量。
进一步的，所述化学发光微孔板为包被有牛血清白蛋白和链霉亲和素的偶联产物。
进一步的，所述链霉亲和素的包被量约为3.8μg/孔。
进一步的，所述校准品包括浓度约为0pg/mL、5pg/mL、40pg/mL、200pg/mL、1000pg/mL和5000pg/mL的白介素-6抗原溶液。
进一步的，所述生物素化抗体为含有2μg/g白介素-6抗体(鼠源)、11.33mg/g三羟甲基氨基甲烷、5.47mg/g氯化钠、4.68mg/g牛血清白蛋白、4.69μL/g羊血清、4.7μL/g马血清、0.94μL/gPC300抑菌剂和28.2μL/g新生牛血清的水溶液。
进一步的，所述酶标记抗体为含有2μg/g白介素-6抗体(山羊源)-辣根过氧化酶偶联物、11.32mg/g三羟甲基氨基甲烷、5.46mg/g氯化钠、4.68mg/g牛血清白蛋白、4.69μL/g羊血清、4.7μL/g马血清、28.17μL/g新生牛血清、0.01μg/g铁氰化钾和0.01μL/g PC300抑菌剂的水溶液。
进一步的，所述发光底物包括溶液A和溶液B，所述溶液A为含有0.4％鲁米诺，pH9.0的水溶液，所述溶液B为含有0.06％Na2B4O7，pH 5.0的水溶液；所述洗液为含1％吐温20和0.1％Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris-HCl溶液。
进一步的，所述步骤5中校准品的反应条件为37℃下反应1分钟。
基于上述检测方法，本发明还提供了一种白介素-6的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括化学发光微孔板、生物素化抗体、酶标记抗体、校准品、发光底物和洗液。
进一步的，所述发光底物和洗液均为独立包装。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
1、本发明以辣根过氧化物酶为标记酶，通过化学反应标记抗体，有效去除未反应的酶、抗体等反应杂质，降低检测本底，并提高反应的灵敏度；在辣根过氧化物酶的缓冲液中加入了未标记的抗体，有效降低了HOOK现象，并提高了高值样本检测结果的准确性。
2、本发明选用高亲和力抗体，大大缩短了检测时间；并采用生物素-链霉亲和素放大系统，可有效提高检测方法的灵敏度；以鲁米诺为化学发光底物，该底物灵敏度高，且可快速达到平台期，有利于信号的检测，提高了最终试剂盒的灵敏度。
附图说明
图1为计算对比试剂的线性拟合曲线。
图2为计算本试剂的线性拟合曲线。
图3为计算对比试剂样本测试结果。
图4为计算本试剂样本测试结果。
具体实施方式
实施例：基于本发明的检测方法，制作试剂盒进行以下各种性能指标的检测。将本试剂盒作为实验组，对比试剂为国内一家已上市的白介素-6检测试剂盒。
性能指标1、最低检测限：
对“0”浓度校准品(S1)重复检测20次，计算20次发光值的平均值M和标准差SD，然后将M+2SD带入校准曲线方程，其所对应的浓度值即为最低检测限。
表1最低检测限结果
通过检测数据可知，本试剂盒设定的最低检测限为1.0pg/ml，本发明试剂盒添加的其他各种成分对其最低检测限不会造成影响，试剂盒依然保持较好的最低检测限。
性能指标2、准确度：
使用白介素-6国际标准品(英国国家生物标准与检定，NIBSC，89/548)配制成浓度为6.25pg/mL和500pg/mL，作为样本按照上述检测方法进行检测，各重复检测3次，测量浓度结果的平均值记为(Mi)，根据公式(1)分别计算相对偏差(Bi)，相对偏差应≤10％。
公式(1)Bi＝(Mi-T)/T×100％，式中：Bi—相对偏差；
Mi—测量浓度的平均值；
T—标定浓度。
表2准确度测试
表3对比试剂准确度测试
本试剂盒测定国际标准品的相对偏差均优于对比试剂盒。
性能指标3、精密度：
分别重复检测白介素-6质控品1(浓度为6.86pg/mL)和(浓度为524.23pg/mL)10次，计算10次测量浓度结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式CV＝SD/M×100％计算变异系数，结果应≤10％。
表4精密度测试
本试剂盒测定控品1和质控品2的CV均小于对比试剂盒，分别为4.88％和4.47％。
性能指标4、线性范围：
取接近线性范围上限的高值样本，浓度为5321.45pg/mL，标记为H样品，按一定比例稀释为至少5个浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限，浓度为2.1pg/ml，标记为将L样本。按试剂盒说明书进行操作，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数R2。
表5线性范围测试
如图1和图2所示，试剂盒获得的拟合直线线性相关系数R2大于0.990，高于对比试剂的0.98，因此本试剂盒线满足预期设定的线性范围，即2～5000pg/mL。
性能指标5、样本一致性研究：
选取50份血清和血浆样本分别用参比试剂和本试剂盒测定其浓度，每个样本检测1次。以标识的血清或血浆中白介素-6浓度为X轴，以测定的血清或血浆中白介素6浓度结果为Y轴制作散点图，并进行直线回归，获得线性方程Y＝bX+a。
如图3和图4所示，本试剂的R2>0.98，斜率为1.006，而对比试剂的R2>0.96，斜率为0.986，明显看出本试剂测试临床样本的相干性优于对比试剂。
Claims (10)
1.一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
步骤1、将待测样本、生物素化抗体和酶标记抗体加入至化学发光微孔板中混匀；
所述生物素化抗体为生物素与白介素-6单克隆抗体偶联得到的产物；
所述酶标记抗体为辣根过氧化物与白介素-6单克隆抗体偶联得到的产物；
步骤2、进行孵育：在37℃的温度下，一起孵育10min；
步骤3、进行清洗：将清洗液加入到微孔中，将未结合在固相上的抗体和被测样本清除；
步骤4、进行读数：加入发光底物，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；
步骤5、利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的白介素-6含量。
2.根据权利要求1所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述化学发光微孔板为包被有牛血清白蛋白和链霉亲和素的偶联产物。
3.根据权利要求2所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述链霉亲和素的包被量约为3.8μg/孔。
4.根据权利要求1所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述校准品包括浓度约为0pg/mL、5pg/mL、40pg/mL、200pg/mL、1000pg/mL和5000pg/mL的白介素-6抗原溶液。
5.根据权利要求1所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述生物素化抗体为含有2μg/g白介素-6抗体(鼠源)、11.33mg/g三羟甲基氨基甲烷、5.47mg/g氯化钠、4.68mg/g牛血清白蛋白、4.69μL/g羊血清、4.7μL/g马血清、0.94μL/gPC300抑菌剂和28.2μL/g新生牛血清的水溶液。
6.根据权利要求1所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述酶标记抗体为含有2μg/g白介素-6抗体(山羊源)-辣根过氧化酶偶联物、11.32mg/g三羟甲基氨基甲烷、5.46mg/g氯化钠、4.68mg/g牛血清白蛋白、4.69μL/g羊血清、4.7μL/g马血清、28.17μL/g新生牛血清、0.01μg/g铁氰化钾和0.01μL/g PC300抑菌剂的水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述发光底物包括溶液A和溶液B，所述溶液A为含有0.4％鲁米诺，pH 9.0的水溶液，所述溶液B为含有0.06％Na2B4O7，pH 5.0的水溶液；所述洗液为含1％吐温20和0.1％Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris-HCl溶液。
8.根据权利要求1所述的一种白介素-6的检测方法，其特征在于：所述步骤5中校准品的反应条件为37℃下反应1分钟。
9.基于权利要求1-8中任意一项所述检测方法的一种白介素-6的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括化学发光微孔板、生物素化抗体、酶标记抗体、校准品、发光底物和洗液。
10.根据权利要求9所述的一种白介素-6的检测试剂盒，其特征在于：所述发光底物和洗液均为独立包装。
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