CN116125060A

CN116125060A - 一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN116125060A
Application number: CN202211742299.9A
Authority: CN
Inventors: 晏盼盼; 席再军; 王颖; 林苗; 张维
Original assignee: Wuhan Easydiagnosis Biomedicine Co ltd
Current assignee: Wuhan Easydiagnosis Biomedicine Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-05-16

Abstract

本发明公开一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液，生物素标记的碱性磷酸酶溶液，重组GFAP抗原系列校准品，化学发光液及清洗液，用于检测胶质纤维酸性蛋白，操作快速简单、灵敏度及重复性高。

Description

一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒。

背景技术

胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，以下简称GFAP)是一种分子大小为55kDa、存在于中枢神经系统星形胶质细胞(AS)胞质内的特异性酸性蛋白，是AS细胞骨架体系中三类中间丝的结构蛋白，其在AS几乎唯一存在且有丰富的表达；而星形胶质细胞(AS)在支持、引导、供养和传导神经元信号、结构和活动中发挥至关重要的作用，使得GFAP成为一种理想的脊椎动物中广泛存在的星形细胞标志物。20世纪90年代末，有研究表明GFAP可以作为一种生物标志物应用于化学诱导癌症和恶性胶质瘤的早期检测，进入21世纪后，新的研究表明，GFAP水平的升高可见于外伤性脑损伤(TBI)且GFAP水平的升高与脑损伤严重程度显示直接相关。目前，脑部CT是可广泛获得的唯一客观、简单、可靠的选择用以协助临床医生评估TBI。但CT扫描可能会增加辐射致癌的风险；同时，TBI按照严重程度分型从轻微至严重，且轻微TBI例数可占所有TBI例数的90％及以上。超90％的病人因轻微TBI被送至急救科，但CT结果为阴性，而这些病人中最多只有1％需要神经外科干预。因此，需要一种简单且客观的生物标志物以排除脑CT扫描的必要性。

目前用于GFAP检测的主要方法是酶联免疫吸附分析法(ELISA)。酶联免疫吸附测定检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量反应待测样本中靶分子的含量。

但该方法自动化程度低且灵敏度，重复性均不够，操作上也不够方便，因此，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，用于检测胶质纤维酸性蛋白，操作快速简单、灵敏度及重复性高。

为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：

第一方面，本申请提供一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液，生物素标记的碱性磷酸酶溶液，重组GFAP抗原系列校准品，化学发光液及清洗液。

优选的，偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液的制备方法如下：将纯化后的GFAP捕获抗体与甲苯磺酰基磁珠混合后，加入硫酸铵溶液孵育，而后加入封闭剂封闭，封闭结束后清洗定容，即得偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液。

优选的，甲苯磺酰基磁珠的粒径为1.0-4.0μm。

优选的，每1mg甲苯磺酰基磁珠上GFAP捕获抗体的用量为10-40μg。

优选的，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体的制备方法如下：将N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐活化的GFAP检测抗体与Traunt’s试剂活化的链霉亲和素混合搅拌孵育，而后进行柱纯化。

优选的，N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐活化的GFAP捕获抗体与Traunt’s试剂活化的链霉亲和素的投料比为1:1.5-2。

优选的，化学发光液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇的AMPPD底物液。

优选的，GFAP检测抗体与GFAP捕获抗体为不同的鼠源单克隆抗体。

优选的，偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液的浓度为0.2-0.4mg/ml。

优选的，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液的浓度为0.1-4.0ug/mL。

优选的，生物素标记的碱性磷酸酶的制备方法如下：将碱性磷酸酶进行柱纯化，将纯化后的碱性磷酸酶与生物素-NHS进行混合孵育，孵育结束后再次进行柱纯化。

优先的，碱性磷酸酶与生物素的投料比为1：10-20。

优选的，生物素标记的碱性磷酸酶溶液的浓度为0.5-2.0μg/mL。

本申请的有益效果如下：本方案将双抗夹心法与磁微粒化学发光技术相结合，制备试剂盒测定GFAP的含量，具有灵敏度高、准确度好、稳定性佳且可实现自动化操作简单便捷；检测快速，试剂量程宽，线性范围广。

附图说明

图1为本方案试剂盒GFAP的标准曲线；

图2为临床诊断为脑损伤测试对照结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本申请提供一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液，生物素标记的碱性磷酸酶溶液，重组GFAP抗原系列校准品，化学发光液及清洗液。

本试剂盒的使用原理为：采用双抗体夹心法与磁微粒化学发光技术相结合，定量检测样本中的GFAP，在偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒溶液中，加入GFAP检测样本或重组GFAP抗原系列校准品，通过抗原抗体反应，形成磁微粒-GFAP捕获抗体-GFAP的复合物，再加入链霉亲和素标记的GFAP检测抗体，通过抗原抗体反应，GFAP检测抗体与GFAP的另一结合位点特异性结合，形成磁微粒-GFAP捕获抗体-GFAP-GFAP检测抗体-链霉亲和素的“三明治”夹心免疫复合物结构，再加入生物素标记的碱性磷酸酶，通过链霉亲和素与生物素的亲和反应，形成“磁微粒-GFAP捕获抗体-GFAP-GFAP检测抗体-链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶”的复合结构。通过磁分离清洗过程，将复合物吸附在加样结构中，加入化学发光液，由仪器检测溶液的发光值(RLU)，根据标准曲线定量计算出测试样品中GFAP的浓度。

偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液的制备方法如下：将GFAP捕获抗体进行柱纯化，将纯化后的GFAP捕获抗体与甲苯磺酰基磁珠混合后，在37℃的条件下混匀18h；反应结束后再加入封闭剂于37℃的条件下混匀6h，封闭结束后进行清洗定容，即得偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液；

在一些实施例中，甲苯磺酰基磁珠的粒径为1.6-2.0μm，即偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液为表面偶联有GFAP捕获抗体与甲苯磺酰基基团的粒径为1.6-2.0μm的四氧化三铁悬浮于含有磁微粒包被物缓冲液中所形成的悬浮液；

在一些实施例中，偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液的浓度为0.2-0.4mg/ml。

在一些实施例中，每1mg甲苯磺酰基磁珠上GFAP捕获抗体的用量为10-40μg。

链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液的制备方法为，将链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶于链霉亲和素标记缓冲液中，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液的浓度为0.1-4.0ug/mL；链霉亲和素标记的GFAP检测抗体的制备方法如下：将N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐活化的GFAP捕获抗体与Traunt’s试剂活化的链霉亲和素混合搅拌，而后进行柱纯化而得。

在一些实施例中，N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐活化的GFAP捕获抗体与Traunt’s试剂活化的链霉亲和素的投料比为1:1.5-2。

生物素标记的碱性磷酸酶溶液的制备方法为，将生物素标记的碱性磷酸酶溶于酶标缓冲液中，生物素标记的碱性磷酸酶溶液的浓度为0.5-2.0ug/mL；生物素标记的碱性磷酸酶的制备方法如下：将碱性磷酸酶进行柱纯化，将纯化后的碱性磷酸酶与生物素-NHS按照摩尔比1:10进行混合，并于25℃孵育反应45min，孵育结束后再次进行柱纯化。

在一些实施例中，化学发光液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇的AMPPD底物液。

在一些实施例中，重组GFAP抗原系列校准品是将重组GFAP抗原溶于校准品缓冲液中并进行冻干处理，重组GFAP抗原系列校准品依次为20pg/ml、800pg/ml。

在一些实施例中，清洗液的组分包括Tris，Tween-20、防腐剂，清洗液的pH值为8.7。

在一些实施例中，GFAP检测抗体与GFAP捕获抗体为不同的鼠源单克隆抗体。

以下通过具体实施例对本方案进行进一步说明。

实施例1

一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液，生物素标记的碱性磷酸酶溶液，重组GFAP抗原系列校准品，化学发光液及清洗液，以上组分的制备方法如下：

偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒(GFAP磁微粒)悬浮液：

将商品化(厂家：Hytest；货号：4G25-GFAP83cc)的GFAP捕获抗体通过商品化的纯化柱(厂家：Thermo Fisher；货号：89882)进行纯化，收集纯化后的抗体，将GFAP捕获抗体与商品化的甲苯黄酰基磁珠(厂家：JSR；货号：MS160/Tosyl)按照质量比20ug:1mg进行混合，再加入浓度为3M的硫酸铵溶液，并于37℃混匀孵育18h，混匀孵育结束后加入10％的BSA溶液于37℃混匀孵育6h进行封闭，封闭结束后用TBS-T(25Mm Tris-HCl pH7.2，0.15M NaCl，0.05％ Tween20)进行清洗，清洗结束后将偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒母液加入至磁微粒包被物缓冲液，形成浓度为0.2mg/ml的GFAP磁微粒悬浮液；其中，磁微粒包被物缓冲液按照表1的配方配制，利用NaOH或HCl调整pH值至7.4±0.1。

表1磁微粒包被物缓冲液的配方

物料名称	浓度
		Na₂HPO₄·12H₂O	0.01M
NaH₂PO₄·2H₂O	0.01M
		NaCl	0.15M
Tween-20	0.05％
		BSA	1％
BND	1％

链霉亲和素标记的GFAP检测抗体(GFAP-SA)溶液：

将商品化的磺基-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐(Sulfo-SMCC，厂家：Thermo Fisher；货号：22322)活化的商品化的GFAP检测抗体(厂家：Hytest；货号：4G25-GFAP81cc)与Traunt’s试剂(厂家：Thermo Fisher；货号：26101)活化的链霉亲和素(厂家：ThermoFisher；货号：434301)以1:1.5的比例混合偶联，并用纯化柱(厂家：ThermoFisher；货号：89882)进行分离纯化得到GFAP-SA母液。

偶联步骤如下：

将GFAP检测抗体通过纯化柱进行脱盐纯化，并通过磷酸盐缓冲液(PBS＝0.1M磷酸钠，0.15M氯化钠，pH 7.2)进行洗脱，使GFAP检测抗体的浓度为2.0mg/mL；按照Sulfo-SMCC与GFAP检测抗体的摩尔比为20：1向GFAP检测抗体中加入Sulfo-SMCC，混匀后于25℃孵育30min；反应结束后通过纯化柱进行纯化，得到活化后的带有酰胺键的GFAP检测抗体；

将链霉亲和素溶解在pH 8.0的无胺磷酸盐缓冲液中，缓冲液中EDTA的浓度为2.5mM，使链霉亲和素的浓度为2.0mg/mL；按照Traunt’s与链霉亲和素的摩尔比为20：1向链霉亲和素中加入Traunt’s,混匀后于25℃孵育30min；反应结束后通过纯化柱进行纯化，得到活化后的带有巯基的链霉亲和素；

将活化后的带有酰胺键的GFAP检测抗体与活化后带有巯基的链霉亲和素按照摩尔比1：1.5进行混合，混匀后于25℃孵育1h；反应结束后通过纯化柱进行纯化,得到偶联的目标产物GFAP-SA。

将偶联好的GFAP-SA母液用链霉亲和素标记物缓冲液稀释成浓度为2.0ug/mL的工作液待用，其中，链霉亲和素标记物缓冲液按照表2的配方配制，利用NaOH或HCl调整pH值至7.4±0.1。

表2链霉亲和素标记物缓冲液的配方

原料名称	浓度
		Na₂HPO₄·12H₂O	0.01M
NaH₂PO₄·2H₂O	0.01M
		NaCl	0.15M
TritonX-100	0.1％
		甘油	1％
BSA	1％
		PC-300	0.1％

生物素标记的碱性磷酸酶(ALP-Biotion)溶液：

将商品化的碱性磷酸酶(厂家：BBI；货号：ALPI12G)通过商品化的纯化柱(厂家：Thermo Fisher；货号：89882)进行纯化，收集纯化后的碱性磷酸酶，将碱性磷酸酶与商品化的生物素-NHS(厂家：Thermo Fisher；货号：20217)按照摩尔比1:10进行混合，并于25℃孵育45min，孵育结束后将生物素-碱性磷酸酶的偶联物通过纯化柱进行纯化得到ALP-Biotion母液，将偶联好的ALP-Biotion母液用碱性磷酸酶标记物缓冲液稀释成浓度为1.0ug/mL的工作液，其中，碱性磷酸酶标记物缓冲液按照表3的配方配制，利用NaOH或HCl调整pH值至6.0±0.1。

表3酶标记物缓冲液的配方

原料名称	浓度
		MES	50mM
NaCl	0.9％
		MgCl2	5mM
ZnCl2	0.1mM
		BSA	1％
Tween-20	0.1％
		PC-300	0.05％

重组GFAP抗原系列校准品：

重组GFAP抗原(厂家：Hytest；货号：8G45)系列校准品用校准品缓冲液分别配制成浓度约为20pg/mL和800pg/mL的工作液，其中，校准品缓冲液按照表4的配方配制，利用NaOH或HCl调整pH值至7.4±0.1并进行冻干；LP-APP(4-氨基安替比林)。

表4校准品缓冲液的配方

原料名称	浓度
		Na₂HPO₄·12H₂O	0.01M
NaH₂PO₄·2H₂O	0.01M
		NaCl	0.15M
甘露醇	5％
		LP-APP	0.002％
TritonX-100	0.1％
		BSA	3％
PC-300	0.1％

化学发光液：

化学发光液按照表5进行配制，而后利用NaOH或HCl调整pH值至10.0±0.1。

表5化学发光液的配方

原料名称	浓度
		2-氨基-2-甲基-1-丙醇	0.5M
AMPPD	0.1％
		罗丹明6G	0.01％
MgSO4	0.01M
		ZnCl2	0.01M
PC-300	0.1％

清洗液：

清洗液按照表6进行配制，而后利用NaOH或HCl调整pH值至8.7±0.1。

表6清洗液的配方

将上述GFAP磁微粒悬浮液，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液，生物素标记的碱性磷酸酶溶液，重组GFAP抗原系列校准品，化学发光液及清洗剂组装成盒，于2-8℃保存。

测试与评价

使用实施例1中的试剂盒进行胶质纤维酸性蛋白标准曲线的建立以及方法评价。

标准曲线的建立

加样和孵育过程：吸取重组GFAP抗原校准品(工作校准品S0至S10，浓度分别为：0.00pg/mL，32.86pg/mL，100.45pg/mL，346.71pg/mL，678.64pg/mL，1042.53pg/mL，1375.49pg/mL，1812.67pg/mL，2357.46pg/mL，2912.79pg/mL，3766.78pg/mL，或产品校准品C1和C2，浓度分别为16.12pg/mL和689.46pg/mL)50μL加入反应杯中，然后加入GFAP磁微粒悬浮液50μL，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液50μL，生物素标记的碱性磷酸酶溶液50μL，然后37℃孵育反应10min。

磁分离清洗过程：磁分离清洗3次。

发光过程：加入化学发光液，37℃孵育后测定起光子数，绘制标准工作曲线，如图1所示，本方案的试剂盒检测GFAP的标准曲线方程为：y＝488.37x+52212，R²＝0.994。

检出限

对5份已知浓度近似检出限(LOD)的低值样本(浓度分别为：0.98pg/mL,1.12pg/mL,1.21pg/mL,1.31pg/mL,1.41pg/mL)按照加样及测试程序进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，以低于空白限0.5ng/mL的检测结果的数量小于或等于3个为有效结果，测试数据详见表7所示；检出限确定标准：检出限的检测方法是在空白限与检出限之间设定5个具有浓度梯度的样本，且需要这5个样本的多次重复测试结果低于空白限的数量应小于等于10％。在这个实施案例里，即这5个样本的梯度应介于空白限0.5pg/mL与检出限1.5pg/mL之间，且小于0.5pg/mL的样本数小于等于3个；5个梯度样本的浓度只要满足介于空白限和检出限之间即可。

表7检出限样本测试结果

测试次数	LOD1	LOD2	LOD3	LOD4	LOD5
						1	1.37	1.36	1.30	1.49	1.30
2	1.25	1.34	1.31	1.32	1.32
						3	1.79	1.34	1.36	1.36	1.35
4	1.26	1.36	1.30	1.33	1.29
						5	1.34	1.36	1.33	1.36	1.29

特异性

取浓度为20pg/mL(低值)和800pg/mL(高值)的两份样本，将浓度为300mg/dL的胆红素母液分别添加0.1mL至0.9mL的上述两份样本中作为胆红素终浓度为30mg/dL的干扰样本；

将浓度为91g/dL的甘油三酯母液分别添加0.011mL至0.989mL于上述两份样本中作为甘油三酯终浓度为1000mg/dL的干扰样本；

将浓度为5g/dL的血红蛋白母液分别添加0.1mL至0.9mL于上述两份样本中作为血红蛋白终浓度为500mg/dL的干扰样本；

将浓度为142ng/mL的HAMA母液分别添加0.10mL至0.9mL于上述两份样本中作为HAMA终浓度为14.2ng/mL的干扰样本；

将浓度为2000IU/mL的RF母液分别添加0.10mL至0.9mL于上述两份样本中作为RF终浓度为200IU/mL的干扰样本；

将浓度为120ng/mL的生物素母液分别添加0.10mL至0.9mL于上述两份样本中作为生物素终浓度为12ng/mL的干扰样本；

另分别添加0.10mL生理盐水至另外一份0.9mL于上述两份样本中作为对照样本；分别添加0.011mL生理盐水至另外一份0.989mL于上述两份样本中作为甘油三酯对照样本；分别添加0.10mL二甲基亚砜(DMSO)至另外一份0.9mL于上述两份样本中作为对照样本。

分别对干扰样本(测试结果记为X)和对照样本(测试结果记为X₀)两份样本按照固定的加样及测试程序进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测，每个样本重复三次取均值，根据公式(1)计算两份样本浓度的相对偏差B。测试结果的干扰偏差在±10％以内，满足设计要求。

其中，B＝(X-X₀)/X₀×100％(1)

结果如表8所示，其中，接受标准为：测试含有黄疸(胆红素≤30mg/dL)、血脂(甘油三酯≤1000mg/dL)、溶血(血红蛋白≤500mg/dL)的样本，测试结果的干扰偏差在±10.0％以内，测试含有类风湿因子(RF≤200IU/mL)、HAMA(≤14.2ng/mL)、生物素(≤12ng/mL)的样本，测试结果的干扰偏差在±10％以内；

另外，测试浓度分别为354000pg/mL的波形蛋白与127000pg/mL的结蛋白，其交叉反应率分别≤0.008％和≤0.023％，说明本方案的特异性强。

表8特异性(内源性干扰)样本测试结果

表8续特异性(内源性干扰)样本测试结果

精密度

分别用已知浓度为20pg/mL和800pg/mL的两个样本分别作为低值样本和高值样本按照固定的加样及测试程序各重复检测10次，计算10次测试结果的平均值M(低值样本的实测浓度为20.23pg/mL,高值样本的实测浓度为786.37pg/mL)和标准差SD(低值样本的SD为0.14pg/mL，高值样本的SD为14.43pg/mL)，根据公式(2)计算变异系数(CV)。

其中，CV＝SD/M×100％(2)

按照公式(2)计算，低值样本和高值样本的实测CV分别为0.68％与1.84％，满足批内精密性变异系数不大于8.0％的设计要求，说明本方案的精密度高。

线性范围

将接近线性范围上限的高值样本(4000pg/mL)和线性低值样本按表9的比例进行混合，配制成6个浓度的样本。对每一浓度的样本按照固定的加样及测试程序均重复检测3次，计算其平均值，将理论浓度(0.00pg/mL，37.67pg/mL，753.36pg/mL，1506.71pg/mL，3013.42pg/mL，3766.78pg/mL)作为X轴、检测结果平均值(0.00pg/mL，32.83pg/mL，678.64pg/mL，1375.49pg/mL，2912.79pg/mL，3766.78pg/mL)作为Y轴，用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r为0.999。满足试剂盒在1.5－4000pg/mL范围内，线性相关系数(r)≥0.990的设计要求，线性范围广，具体测试结果见表10。

表9线性样本配制比例

样本	线性低值样本(μL)	线性高值样本
			线性样本1	1000	0
线性样本2	990	10
			线性样本3	800	200
线性样本4	600	400
			线性样本5	200	800
线性样本6	0	1000

表10线性样本测试结果

准确度

将高浓度的GFAP(A)加入到低浓度的血清(或其他体液成分)B中，所加GFAP(A)与低浓度血清(或其他体液成分)B之间的比例为1：9，按照固定的加样及测试程序各重复检测3次，取平均值，A的浓度Cs为1632.38pg/mL，B的浓度c0为20.37pg/mL，混合后的样本浓度c为170.24pg/mL，根据下列公式(3)计算回收率。实测回收率为93.06％，满足回收率介于85％－115％范围内的设计要求，说明本方案的准确度高。

其中，

HOOK效应

配制浓度约为40000pg/mL的高浓度样本，将高浓度样本使用抗原储存液按0.8倍，0.4倍，0.2倍，0.1倍依次梯度进行稀释。按照固定的加样及测试程序分别对高浓度样本和稀释样本进行测试，每个样本重复测试三次，计算三次测试发光值的平均值，其他样本的光值均不低于0.1倍稀释样本的光值。即GFAP浓度达到40000pg/mL，不出现钩状效应。满足产品的设计要求。具体测试结果见表11。

表11HOOK样本测试数据

校准品的均一性

瓶内均一性

取一盒同批次试剂盒中的产品校准品C1和C2，按照固定的加样及测试程序各重复检测10次,10个测量结果按照公式(4)-(6)计算测试结果的平均值

(C1的实测浓度为16.51pg/mL,C2的实测浓度为704.40ng/mL)，标准偏差(SD)(C1的SD为0.28pg/mL，C2的SD为9.57pg/mL)和变异系数(CV)。

其中，

按照公式(6)计算，C1和C2的实测CV分别为1.73％与1.36％，满足校准品瓶内均一性：变异系数CV≤8.0％的设计要求。

校准品瓶间均一性

取同批号试剂盒10盒，取试剂盒内的校准品，按照固定的加样及测试程序每盒每管校准品测量1次，每个浓度水平共10个测定结果，按照公式(4)和(5)计算测试结果的平均值

和标准偏差(SD₁)；

取一盒同批次试剂盒中的校准品参考瓶内均一性的方法进行测试，按照公式(4)和(5)计算测试结果的平均值

和标准偏差(SD₂)；

按照公式(7)和(8)计算瓶间均一性的标准偏差(SD)和变异系数(CV)。

当SD₁＜SD₂时，CV＝0

由表12可知，校准品C1的瓶间均一性CV为0.62％，校准品C2的瓶间均一性CV为0.41％，满足设计要求。

表12校准品均一性测试数据

校准品的准确度

取GFAP抗原用经校准的明德标准测量程序配制高、低两个浓度水平的定标样本，对全自动化学发光免疫分析仪进行校准后，检测产品校准品C1和C2，两个浓度各重复测量3次，其平均值记为M(C1与C2的测试浓度M分别为16.83pg/mL和700.87ng/mL)，根据公式(9)计算测量浓度的相对偏差。

B＝(M-T)/T×100％(9)

其中，T为标定浓度，C1与C2的标定浓度T分别为16.12pg/mL和689.46pg/mL,因此，C1与C2的相对偏差分别为4.40％和1.65％，满足校准品测试结果与标定浓度的相对偏差在±15.0％范围内。

临床应用

在明德的平台上，来自于华中科技大学同济医学院附属同济医院(武汉同济医院)的被诊断为脑损伤的临床样本按照固定的加样及测试程序进行测试即可。如图2，比较医院的脑CT诊断结果与明德GFAP试剂盒测试结果可知，在脑损伤程度为中度和重度，且脑CT诊断结果为阳性的病人中，GFAP的临床灵敏度可达到90％，但对于CT结果为阴性的轻度脑损伤病人，GFAP的临床特异性可达到100％。针对目前存在的“轻微脑损伤(TBI)例数可占所有TBI例数的90％及以上。超90％的病人因轻微TBI被送至急救科，但CT结果为阴性，而这些病人中最多只有1％需要神经外科干预”的临床现状，明德发明的GFAP试剂盒可以实现从检测结果上将轻微TBI病人从中重症TBI病人里区分开,从而减少这部分病人不必要的脑CT检测。

由以上结果可以看出，本发明涉及的试剂盒可实现自动化、操作简单方便、准确度高且各种性能指标均达标，本发明的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光试剂盒具有很好的适用性和先进性。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，包括偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液，链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液，生物素标记的碱性磷酸酶溶液，重组GFAP抗原系列校准品，化学发光液及清洗液。

2.根据权利要求1所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液的制备方法如下：将纯化后的GFAP捕获抗体与甲苯磺酰基磁珠混合后，加入硫酸铵溶液孵育，而后加入封闭剂封闭，封闭结束后清洗定容，即得所述偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液。

3.根据权利要求2所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述甲苯磺酰基磁珠的粒径为1.0-4.0μm。

4.根据权利要求2所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，每1mg甲苯磺酰基磁珠上GFAP捕获抗体的用量为10-40μg。

5.根据权利要求1所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素标记的GFAP检测抗体的制备方法如下：将N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐活化的GFAP捕获抗体与Traunt’s试剂活化的链霉亲和素混合搅拌，而后进行柱纯化。

6.根据权利要求5所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环乙烷-1-羧酸盐活化的GFAP捕获抗体与Traunt’s试剂活化的链霉亲和素的投料比为1:1.5-2。

7.根据权利要求1所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇的AMPPD底物液。

8.根据权利要求1所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述GFAP检测抗体与GFAP捕获抗体为不同的鼠源单克隆抗体。

9.根据权利要求1所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述偶联有GFAP捕获抗体的甲苯磺酰基磁微粒悬浮液的浓度为0.2-0.4mg/ml。

10.根据权利要求1所述的胶质纤维酸性蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素标记的GFAP检测抗体溶液的浓度为0.1-4.0μg/mL。