CN109799347B

CN109799347B - 白血病生物标志物igfbp3及其应用

Info

Publication number: CN109799347B
Application number: CN201711148735.9A
Authority: CN
Inventors: 黄若磐; 张惠华; 朱思为; 匡治洲; 黄伟
Original assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2037-11-17
Also published as: CN109799347A

Abstract

本发明涉及一种白血病生物标志物IGFBP3及其在用于检测白血病试剂盒中的应用，以及一种用于检测白血病的试剂盒。本发明通过发明人的创造性劳动，选择IGFBP3作为白血病标志物，应用于制备检测白血病的试剂盒，该标志物的表达量与白血病预后具有高度相关性，可作为新的临床中分子生物学检测指标，以实时监控白血病患者病程，满足临床诊疗需求，提高白血病临床诊疗水平。

Description

白血病生物标志物IGFBP3及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种白血病生物标志物IGFBP3及其应用。

背景技术

白血病(Leukemia)，亦称作血癌，是一种造血系统的恶性肿瘤。病源是由于细胞内脱氧核糖核酸的变异形成的骨髓中造血组织的不正常工作。骨髓中的干细胞每天可以制造成千上万的红血球和白细胞。白血病病人过分生产不成熟的白细胞，妨害骨髓的其他工作，这使得骨髓生产其它血细胞的功能降低。白血病可以扩散到淋巴结、脾、肝、中枢神经系统和其它器官。

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是最常见的成人急性白血病，具有高度的异质性。近年来细胞遗传学、分子生物学及治疗靶点识别技术的发展，推动了靶向治疗及分层治疗水平的进步，但现阶段尚缺乏一种可很好地将其中不同预后患者鉴别开的方法。并且许多预后良好的患者与临床治疗反应不相符，出现治疗效果差，难缓解，缓解后易复发等情况。提示目前的以细胞遗传学和分子生物学检测指标为主的AML诊断、预后分层体系存在较大的局限性。除已有的细胞遗传学、分子生物学检测指标及可能的检测误差等因素外，尚有许多更复杂的白血病预后因素尚未阐明，目前的生物学检测指标仍然无法满足临床检测或预后评估的需求。

因此，有必要针对上述问题，发现和应用新的白血病生物标志物，实现其在白血病检测和/或预后评估中的应用，实时监控疾病进程，从而提高白血病临床诊疗与白血病预后评估水平。

发明内容

基于此，针对上述问题，本发明提供了一种白血病生物标志物IGFBP3及其应用。

为实现上述目的，具体技术方案如下：

生物标志物IGFBP3在制备用于白血病检测和/或预后评估的试剂盒中的应用。

本发明的目的还在于还提供一种用于白血病检测和/或预后评估的试剂盒。

为实现上述目的，具体技术方案如下：

一种用于白血病检测和/或预后评估的试剂盒，包括有检测IGFBP3的表达量的试剂。

在其中一些实施例中，上述检测IGFBP3的表达量的试剂包括：针对生物标志物IGFBP3的相应的特异性抗体。

在其中一些实施例中，针对生物标志物IGFBP3的相应的特异性抗体包括：IGFBP3捕获抗体和IGFBP3检测抗体。

在其中一些实施例中，上述IGFBP3捕获抗体固定于载体上，用于捕获样品中的IGFBP3。

在其中一些实施例中，上述载体为孔板、滤膜、玻片中的任一种。

在其中一些实施例中，该试剂盒还包括IGFBP3标准品。

在其中一些实施例中，上述IGFBP3检测抗体经过生物素、HRP或胶体金标记。

本发明还提供了上述用于白血病检测和/或预后评估的试剂盒的应用。

为实现上述目的，具体技术方案如下：

上述用于白血病检测和/或白血病预后评估的试剂盒在制备白血病诊断、白血病病程动态监控或白血病患者预后评估的试剂中的应用。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过发明人的创造性劳动，找到IGFBP3作为白血病标志物，该标志物在白血病中低危患者与中高危患者间的表达量具有显著差异，其表达量与白血病预后生存时间具有高度相关性，将该标志物应用于制备检测白血病和/或白血病预后评估的试剂盒，可通过该标志物的表达量实时监控白血病的疾病进程，进而提高临床诊疗与白血病预后评估水平。

本发明找到白血病标志物IGFBP3，制备检测其表达量的试剂盒，该试剂盒可快速定量检测样品中的IGFBP3的含量，可通过IGFBP3表达量的测定，评估白血病人预后生存能力。

同时，本发明所述试剂盒，对检测生物标志物IGFBP3所需的试剂进行了整合，使检测更直观、更方便快捷。

附图说明

图1为IGFBP3标准品测定得到浓度-荧光强度标准曲线；

图2为IGFBP3高表达组和低表达组白血病人的生存曲线；

图3为IGFBP3高表达组和中表达组白血病人的生存曲线；

图4为IGFBP3低、中、高表达组白血病人的生存曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1白血病中高危-中低危病人差异生物标记物筛选实验

选取59例中危病人，按PFS.M(无进展生存时间)进行分组：PFS.M＞12为中低危组，共30例；PFS.M＜12为中高危组，共29例。

采集上述两组病人血清样本，通过现有技术中的定量荧光法检测血清中IGFBP3含量。配制IGFBP3标准品(RD,cat#675-B3)溶液，并梯度稀释，得到标准曲线荧光信号值及对应浓度如表1所示。

标准品浓度pg/mL	荧光信号强度
		0	526.7727
274	1153.111
		823	2111.985
2469	6447.378
		7407	17400.32
22222	34769.59
		66667	61022.76
200000	79180.71
		阳性对照	200674

表1

由上表数据，将浓度与荧光信号强度分别作对数转换，绘制IGFBP3标准曲线，如图1所示，计算得线性回归方程:Y＝0.91x+0.56。R²为0.98。其中x为Log(标准品浓度)，Y为Log(荧光信号强度)。

对59例白血病人血清测定IGFBP3，得荧光信号值，并根据上述线性回归方程计算得到的浓度，如表2所示。

表2

计算中高危组和中低危组白血病人间IGFBP3表达量的p值及差异倍数，如表3所示。说明IGFBP3在中高危和中低危组的白血病人间的表达量有统计学和生物学差异。

表3

通过临床信息跟踪，对IGFBP3和病人生存期做cox风险分析，用R语言数据包cox/survival进行分析。发现IGFBP3风险指数为1.509，95％置信区间为0.97～2.3，p＝0.06，表示IGFBP3表达量的高低对白血病患者的生存显示明显的危险风险。表3结果显示，IGFBP3的表达量越高，其生存危险越高。

实施例2IGFBP3对病人生存状况的影响

按实施例1所述的59组样本的IGFBP3表达水平为基准，以表达量高低分为三组：低表达组，IGFBP3表达量小于16190pg/ml；中表达组，IGFBP3表达量为16190-26740pg/ml；高表达组，IGFBP3表达量大于26740pg/ml。

定期对三组病人进行随访，统计144个月内患者的生存率，，用R语言数据包survminer绘制生存曲线，如图2、图3、图4所示。横坐标表示病人生存时间，单位为月。纵坐标表示病人存活率。

结果表明：IGFBP3低、中表达组的病人存活率下降平缓，而IGFBP3高表达组，在144月时间长度内，病人存活率急剧下降，具有显著性差异。IGFBP3低、中表达组的病人的存活时间较长，而IGFBP3表达量高的病人的存活时间较短。此外，IGFBP3高表达组的白血病人分别与低、中表达组白血病人相比，高表达组病人存活率显著低于其他两组。因此，IGFBP3的高表达不利于白血病人生存获益，IGFBP3的表达量越高，其生存危险越高。

实施例3用于检测白血病的试剂盒——酶标法

1、原理

本实施例所述试剂盒采用双抗体夹心法，采用酶标抗体进行检测，即：向固定有特异性抗体的芯片或微孔板中加待测样品，如两者是特异的，则孵育后发生结合，然后把多余抗体洗除；加入与待测细胞因子样品呈特异反应的酶联抗体，使形成“夹心”；加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在样品中存在相应的抗原。

2、试剂

(1)ELISA微孔板：已包被捕获抗体IGFBP3，并用含有5％BSA、0.2％蔗糖的PBS溶液进行了封闭；

(2)样品稀释液：含有0.5％BSA、0.05％(v/v)的吐温20的PBS缓冲液；

(3)结合物稀释液：含有0.5％BSA、0.05％(v/v)的吐温20的PBS缓冲液；

(4)结合物：已标记HRP的IGFBP3检测抗体冻干粉；

(5)标准品：IGFBP3标准品冻干粉；

(6)10×洗涤液30ml：0.2M Tris-HCl，5M NaCl，0.5％吐温20；

(7)底物20ml：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液；

(8)终止液10ml：2M H₂SO₄；

3、定量检测白血病标志物IGFBP3

(1)向ELISA微孔板中加入梯度稀释的IGFBP3蛋白标准品溶液做两个重复，每孔加100μl，37℃反应40分钟。

(2)用含有0.5％BSA、0.05％(v/v)的吐温20的PBS缓冲液配置稀释20×洗涤液，使用1×洗涤液于洗板机上洗板5次共10分钟。

(3)将结合物稀释液加入结合物混匀，配制已标记HRP的IGFBP3检测抗体溶液，浓度为100ng/ml；取100μl加入微孔板中孵育40分钟。

(4)再次洗涤5次共10分钟后，加入底物反应10分钟，加入终止液显色，于酶标仪上读数。

(5)结果表明，IGFBP3的检测结果与配制的蛋白标准品的含量是一致的。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.生物标志物IGFBP3在制备用于白血病中危病人病程动态监控或预后评估的试剂盒中的应用，其特征在于，当所述白血病中危病人的IGFBP3表达量大于26740pg/ml时，所述白血病中危病人的存活率降低以及存活时间缩短。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括有检测IGFBP3的表达量的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测IGFBP3的表达量的试剂，包括有针对生物标志物IGFBP3的相应的特异性抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述针对生物标志物IGFBP3的相应的特异性抗体包括：IGFBP3捕获抗体和IGFBP3检测抗体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述IGFBP3捕获抗体固定于载体上，用于捕获样品中的IGFBP3。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述载体为孔板、滤膜、玻片中的任意一种。

7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，还包括IGFBP3标准品。

8.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，所述IGFBP3检测抗体经过生物素、HRP或胶体金标记。