CN114761360A - 无尿素水的制造方法、尿素的定量方法及尿素的分析装置 - Google Patents

Abstract

一种无尿素水，其例如在进行样品水中的尿素的定量时作为浓度标准液的制备或分析装置的载体水使用；通过向至少固定有尿素酶的载体通水，制造尿素浓度1μg/L以下的水作为所述无尿素水。作为载体，例如可以使用合成吸附剂、离子交换树脂、包埋固定化载体，且尿素酶的担载量例如为300U/g‑R～7500U/g‑R。

Description

无尿素水的制造方法、尿素的定量方法及尿素的分析装置

技术领域

本发明涉及水中的尿素的定量，特别是涉及进行尿素定量时使用的无尿素水的制造方法、使用这种无尿素水的尿素的定量方法及尿素的分析装置。

背景技术

本领域中，需要对水中的微量尿素高精度地分析、定量。例如，在通过纯水制造系统从原水制造纯水时，构成纯水制造系统的离子交换装置或紫外线氧化装置难以去除原水中的尿素，因此，需要向纯水制造系统供给已预先去除了尿素的原水。作为尿素的去除方法，已知有将生成次溴酸的药剂加入原水中，通过次溴酸选择性地氧化尿素的方法，但生成次溴酸的药剂也会成为对设置于后级的纯水制造系统的负担，因此该药剂的投入量越少越好。因此，希望能够对原水中的尿素浓度进行定量，判断尿素去除处理的必要性，并在需要尿素去除处理时投入适当的药剂。而且，也需要测定由纯水制造系统获得的纯水中的尿素浓度。

作为尿素的定量法，已知有例如“卫生试验法”(非专利文献1)等中记载的方法、即基于使用二乙酰一肟的比色法的定量法。在使用二乙酰一肟的比色法中，出于促进反应等目的，可以并用其它试剂。在此可并用的试剂可以为例如：安替比林的硫酸溶液、盐酸氨基脲的水溶液、氯化锰和硝酸钾的水溶液、磷酸二氢钠的硫酸溶液等。在并用安替比林进行尿素定量时，将二乙酰一肟溶解在乙酸溶液中来制备二乙酰一肟乙酸溶液，将安替比林(即1,5-二甲基-2-苯基-3-吡唑啉酮)溶解在例如硫酸中来制备含有安替比林的试剂溶液。然后，对样品水依次混合二乙酰一肟乙酸溶液和含有安替比林的试剂溶液，测定波长460nm附近的吸光度，通过与标准液对照来进行样品水中的尿素的定量。

基于使用二乙酰一肟的比色法的尿素定量方法是用于进行例如游泳池的水或公共浴池的水中的尿素的定量的方法，因此，对于向纯水制造工艺供给的原水等中的尿素的定量来说其灵敏度差。因此，专利文献1中公开了一种方法，通过基于使用二乙酰一肟的比色法并应用流动注射分析来测定吸光度，在ppb以下至数ppm的浓度范围内连续地在线定量样品水中的尿素。专利文献2中公开了在基于使用二乙酰一肟的比色法并应用流动注射分析来定量尿素时，通过冷藏用于反应的试剂，能够长期稳定地执行在线的连续自动测定。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-338099号公报

专利文献2：日本特开2018-179545号公报

非专利文献

非专利文献1：日本药学会编，卫生试验法，注解1990.4.1.2.3(13)1 (1990年版第4次补印(1995)，p1028)，1995年

发明内容

发明所要解决的技术问题

专利文献1及专利文献2中记载的方法是通过使用流动注射分析能够以高灵敏度进行尿素定量的方法，但当在实施该定量方法时使用的水(例如，制备浓度标准液时使用的水或流动注射分析中的载体水)中包含尿素时，这些水中包含的尿素成为分析误差的主要因素。在除了通过流动注射分析以外的分析方法定量尿素时，如果用于定量操作的任一种水中包含尿素，则这也会成为分析误差的主要因素。例如，即使在进行液相色谱分析时，如果在使用水作为移动相时在该水、即载体水中包含尿素，则会产生分析误差。特别是，在对样品水中包含的μg/L级的微量尿素进行分析时，如果在用于制备标准液的水或载体水中也以μg/L级的浓度含有尿素，则其影响是巨大的。

如上所述，通过离子交换处理或紫外线氧化处理难以去除尿素，即使在通过超纯水制造系统制造超纯水的情况下，也会因原水水质的变动或装置的问题等造成处理不完全，制造的超纯水中会包含微量的尿素，而且其浓度也会发生变动。因此，即使在使用超纯水制备浓度标准液或作为载体水的情况下，尿素的微量分析结果有时也会不准确。

本发明的目的在于，提供一种在分析水中的尿素时使用的水、即将尿素浓度降低到至少不影响分析的程度的无尿素水的制造方法、通过使用无尿素水而能够高精度地定量样品水中的微量尿素的定量方法及分析装置。

用于解决技术问题的技术方案

作为水解尿素的酶，有尿素酶(脲酶，urease；EC 3.5.1.5)。即使是在水的存在下极低浓度的尿素，尿素酶也能够如下述式所示将尿素分解成二氧化碳及氨。

(NH₂)₂CO+H₂O→CO₂+NH₃

根据本发明人等的研究，如后述实施例所表明的那样，通过用尿素酶处理水，能够将水中的尿素浓度降低至1μg/L以下。

本发明提供一种无尿素水的制造方法，其中，通过至少向固定有尿素酶的载体通水，制造尿素浓度1μg/L以下的无尿素水。

本发明提供一种尿素的定量方法，其中，对样品水中的尿素进行定量，使用无尿素水作为制备尿素标准溶液的水、以及载体水中的至少一者。无尿素水例如是其尿素浓度为1μg/L以下的水。无尿素水例如也可以是通过本发明的制造方法制造的无尿素水。

本发明提供一种尿素的分析装置，其相对于载体水的水流导入一定量的样品水来进行样品水的尿素定量，其中，将向无尿素水制造部通水而获得的尿素浓度1μg/L以下的处理水作为载体水。

在本发明的分析装置中，无尿素水制造部可以至少具备固定有尿素酶的载体，通过向固定有尿素酶的载体通水而获得处理水。

发明效果

根据本发明，能够容易地获得使尿素浓度降低到至少不影响分析的程度的无尿素水，由此，能够高精度地定量样品水中的微量尿素。

附图说明

图1是表示本发明一个实施方式的分析装置的结构的图。

图2是表示实施例3的结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。基于本发明的无尿素水的制造方法中，通过向至少固定有尿素酶的载体通水，制造尿素浓度1μg/L以下的无尿素水。以下，将固定有尿素酶的载体称为“固定化酶”。通过向固定化酶通水，水中的尿素被选择性地快速水解、去除。此时的通水条件也可以预先在试验中确定，以使通过了固定化酶的水中的尿素浓度达到 1μg/L以下。

作为尿素酶，例如源自刀豆(Canavalia gladiata)的尿素酶等在市场上有售，在本发明中能够良好地使用市售的尿素酶。作为固定尿素酶的载体，可以使用一般用于酶的固定化的载体，例如可以使用离子交换树脂、合成吸附剂、包埋固定化载体等。固定化酶中的尿素酶的固定化量用每1g载体的酶单位(Unit)表示，即用U/g-R表示，优选为300U/g-R以上7500U/g-R 以下，更优选为750U/g-R以上3000U/g-R以下。当尿素酶的固定化量低于300U/g-R时，为了充分降低尿素浓度，需要降低通水时的空间速度(SV)。另一方面，当尿素酶的固定化量超过7500U/g-R时，制造成本变高。

作为为了制造无尿素水而向固定化酶通水的水，优选为尿素浓度低的水。为防止水中所含的悬浮物质等造成的通水压差上升等的不良情况，向固定化酶通水的水优选为纯水、超纯水或蒸馏水等。对固定化酶的通水速度越小，固定化酶中的尿素分解性能越高。从生成的无尿素水的水质的观点来看，对固定化酶的通水速度以空间速度表示，优选为500h^-1以下，更优选为300h^-1以下，进一步优选为100h^-1以下。

对固定化酶的通水温度、即向固定化酶通水的水的温度例如设为0℃以上60℃以下。通水温度越高，固定化酶中的尿素的水解反应速度越快，但尿素酶的失活速度也增加。另一方面，如果通水温度低，则尿素的水解反应速度慢，但尿素酶的失活速度减缓，能够延长固定化酶的寿命。从固定化酶的寿命的观点来看，通水温度优选为2℃以上常温以下，更优选为4℃以上20℃以下。在此，常温是指例如30℃。为了降低通水温度，可以采取在固定化酶的入口侧设置用于冷却的热交换器、或者将填充了固定化酶的柱配置在冷藏库内等方法。

以上，说明了基于本发明的无尿素水的制造方法。通过这种制造方法制造的、尿素浓度1μg/L以下的无尿素水能够用于例如进行尿素定量时使用的尿素标准溶液的制备，或能够用作在使用流动注射法或液相色谱法定量尿素时的载体水。作为定量微量尿素的方法，有组合了液相色谱(LC)和质谱分析(MS)的LC/MS法、进一步以2阶段进行质谱分析的LC/MS/MS 法，实施这些分析方法时的液相色谱阶段中的移动相(即载体水)也可以使用基于本发明制造的无尿素水。流动注射法和液相色谱法在通过对载体水的水流导入一定量的样品水来进行定量这一点上是一致的。而且，通过使用基于本发明制造的无尿素水，能够对包含μg/L级的微量尿素的样品水高精度地进行尿素的定量。根据基于本发明的制造方法，能够连续地制造无尿素水，因此，相较于通过批量分析进行尿素定量的情况，本发明对于进行尿素的连续定量分析或尿素监测的情况是更有用的。

图1表示本发明一实施方式的尿素分析装置。在此举例说明以用于制造纯水的原水或纯水作为样品水，在线连续地定量该样品水中所含的微量尿素的情况。当然，成为尿素的分析对象的样品水不限于用于制造纯水的原水或纯水。

如图1所示，设置用于制造纯水的原水的管线20，在该管线20中，通过泵P0输送原水。设置有从原水的管线20分支的样品水配管21。样品水配管21是从原水分支的样品水的配管，具备开关阀22、流量计FI。在样品水配管21的前端设置有也被称作注射器或注射阀的取样阀10。包含取样阀10在内的取样阀10的下游部分具有作为流动注射分析(FIA；flowinjection analysis)装置的结构，是实际上与尿素的定量相关的部分。

取样阀10为在FIA装置中通常使用的结构，具备六通阀11及样品环管12。六通阀11具备在图中用带圆圈的数字表示的6个端口。样品配管 21连接于端口2。另外，经由泵P1供给载体水的配管23连接于端口6，且用于经由泵P4排出样品水的配管25连接于端口3。用于采取规定容量的样品水的样品环管12连接在端口1和端口4之间。作为取样阀11的出口的配管24的一端连接于端口5。载体水经由配管19供给至泵P1，从泵 P1经由配管23向端口6输送。

载体水通常使用纯水等，而载体水会对尿素的定量精度产生大幅影响，需要尿素浓度极低。也如后述的实施例所表明的那样，在进行样品水中的μg/L级的尿素定量时，载体水中的尿素浓度必须为1μg/L以下。因此，在本实施方式中，作为载体水，使用实质地去除了尿素的水、即无尿素水，更具体而言使用尿素浓度控制到1μg/L以下的水、即无尿素水。无尿素水例如通过上述本发明的制造方法制造。

为了使用无尿素水，在本实施方式的分析装置中设置有制造无尿素水的无尿素水制造部50。作为无尿素水制造部50，只要能够制造尿素浓度 1μg/L以下的无尿素水，就可以使用任意的结构。在此所示的例子中，设置有具有如上所述那样固定有尿素酶的载体、即固定化酶51的无尿素水制造部50。无尿素水制造部50为柱状的形状，且在其内部收容有固定化酶51。在无尿素水制造部50的底部连接载体水的配管23。纯水经由配管 52供给到无尿素水制造部50的上部，在配管52上设置有被供给冷却水的热交换器53，流经配管52的纯水通过热交换器53冷却至规定温度、例如 20℃。热交换器53为了使对固定化酶51的通水温度达到常温以下、例如 20℃而设置，但也可以将无尿素水制造部50设置在冷藏库内部来代替设置热交换器53。

在无尿素水制造部50中，经由配管52供给的纯水通过固定化酶51，此时水解纯水中的尿素。由此，从无尿素水制造部50将尿素浓度1μg/L 以下的固定化酶处理水作为载体水供给至配管23，用于基于FIA法的尿素定量。

在六通阀11中，若将端口X和端口Y连通的情况表示为(X-Y)，则六通阀11为可以在(1-2)、(3-4)、(5-6)的第一状态和(2-3)、(4-5)、(6-1)的第二状态之间切换的结构。在图1中，第一状态下的端口间的连接关系用实线表示，第二状态下的端口间的连接用虚线表示。在第一状态下，载体水流经配管23→端口6→端口5→配管24，从取样阀10向下游侧流出。样品水流经样品水配管21→端口2→端口1→样品环管12→端口4→端口3，从配管25排出。当从该第一状态切换至第二状态时，样品水流经样品水配管21→端口2→端口3，从配管25排出，另外，载体水流经配管23→端口6→端口1→样品环管12→端口4→端口5→配管24，向下游侧流出。此时，在第一状态时已流入并充满样品环管12内的样品水在载体水之前从端口5流入配管24，并流向取样阀10的下游侧。流入配管24的样品水的体积由样品环管12规定。因此，通过反复切换第一状态和第二状态、例如使六通阀11沿图示的箭头方向旋转，能够将规定容量的样品水重复送入配管24。第一状态和第二状态的切换可以考虑反应所需的滞留时间、到由检测器32检测尿素为止的时间，在每个规定的时间进行。另外，也可以在检测到导入到检测器32中的样品水从检测器32排出后进行切换。这样，通过自动地进行第一状态和第二状态的切换，能够连续地定量尿素。

在该分析装置中，对基于使用二乙酰一肟的比色法的尿素定量应用 FIA法。因此，作为用于尿素定量的反应试剂，使用二乙酰一肟乙酸溶液和含有安替比林的试剂溶液。在以下的说明中，往往将二乙酰一肟乙酸溶液和含有安替比林的试剂溶液分别称为试剂A及试剂B。在此说明使用含有安替比林的试剂溶液作为与二乙酰一肟并用的试剂的情况，但与二乙酰一肟并用的试剂并不限于含有安替比林的试剂溶液。试剂A及试剂B分别贮存在贮槽41、42中。

本发明人等发现：如专利文献2中已公开的那样，在制备了这些试剂后，为了连续定量尿素而长时间、例如数天以上保持室温的情况下，吸光度测定时的峰强度降低；并且，通过冷藏试剂、特别是冷藏试剂B，能够防止该峰强度的降低。为了进行稳定的定量，优选吸光度测定时的峰强度不降低，因此，在本实施方式的分析装置中，将贮槽41、42设置在冷藏部40内。试剂A通过使二乙酰一肟溶解于乙酸溶液中而制备，但在设置冷藏部40的情况下，制备过程本身在贮槽41中进行、或在试剂A制备后将其贮存在贮槽41中。同样，试剂B通过使安替比林溶解于例如硫酸中而制备，制备过程本身在贮槽42中进行、或在试剂B制备后将其贮存在贮槽42中。冷藏部40将贮槽41、42遮光并同时冷却，由此，将贮槽41、 42内的试剂A、试剂B的温度维持在20℃以下，优选为3℃以上20℃以下，更优选为5℃以上15℃以下。此外，贮存试剂A的贮槽41只要能够进行遮光保管即可，未必要配置于冷藏部40内。即使试剂的冷藏温度低于5℃，只要在试剂中不析出结晶就没有关系。“卫生试验法”(专利文献1)中记载：对于使安替比林溶解于硫酸中得到的安替比林硫酸溶液，如果保管在褐色瓶中，则可使用2～3个月；而冷藏保管由于会使结晶析出、且即使回到室温也不会再溶解，因此是不适合的。但是，本发明人等通过实验确认到，按照“卫生试验法”制备的安替比林硫酸溶液即使在3℃下也不会结晶。此外，如果在制备试剂A及试剂B时进行稀释操作，则用于稀释的水优选使用尿素浓度1μg/L以下的无尿素水，例如基于本发明制造的无尿素水。

配管26的一端连接到贮槽41，配管26的另一端通过混合部43连接到配管24。在配管26中设置有用于将试剂A以规定的流量送入配管24 的泵P2。同样，配管27的一端连接到贮槽42，配管27的另一端通过混合部44连接到配管24。在配管27中设置有用于将试剂B以规定的流量送入配管24的泵P3。混合部43、44具有分别对配管24内的液体流均匀地混合试剂A、试剂B的功能。配管24的另一端与设置于反应恒温槽30 内的反应盘管31的入口连接。在反应盘管31的内部，在安替比林的存在下尿素和二乙酰一肟发生显色反应，且其长度和反应盘管31内部的流速可根据反应所需的滞留时间适当选择。反应恒温槽30使反应盘管31升温至适于反应的温度，例如，将反应盘管31加热到50℃以上150℃以下，优选为90℃以上130℃以下的温度。

在反应盘管31的末端、即出口，设置有检测器32，该检测器32以从反应盘管31流出的液体为对象，测定因显色反应而在液体中产生的显色的吸光度。通过检测器32求得例如波长460nm附近的吸光度的峰强度或峰面积。将载体水流动时的吸光度作为基线，由对尿素浓度已知的标准液的吸光度求得校准曲线，由此能够从对样品水的吸光度求得样品水中的尿素的浓度。在检测器32的出口设置有背压盘管33，该背压盘管33对从泵 P1经过取样阀10、配管24及反应盘管31到达检测器32的管路施加背压。压力计PI连接在检测器32的出口与背压盘管33的入口之间的位置。该分析装置的排液从背压盘管33的出口流出。

在本实施方式的分析装置中进行尿素定量时，必须在定量前使用尿素标准溶液制作校准曲线。在制备用于制作校准曲线的尿素标准溶液时，也使用无尿素水、例如通过固定化酶进行处理而使尿素浓度达到1μg/L以下的无尿素水。

根据本实施方式的分析装置，因为使用尿素浓度1μg/L以下的载体水进行流动注射分析，因此能够准确地定量样品水中所含的μg/L级的尿素。

实施例

接着，通过实施例更详细地说明本发明。

[实施例1]

将340mg的酶活性为150U/mg的尿素酶(富士胶片和光纯药公司制) 溶解于80mL的纯水中制成尿素酶水溶液。使用奥加诺公司制的丙烯酸树脂制合成吸附剂Amberlite(注册商标)XAD-7HP作为载体。使该尿素酶水溶液和20g的载体在25℃下接触4小时，将尿素酶以830U/g-R的固定化量固定在载体上，制成固定化酶。

使纯水以SV(空间速度)为2h^-1的方式通过由上述方法制作的固定化酶，通过LC/MS/MS法分析通过了固定化酶的水、即固定化酶处理水，结果确认到尿素浓度为作为定量下限的1μg/L以下。作为LC/MS/MS装置，使用GL Science制的LC装置(LC800)、AB SCIEX制的MS/MS装置(3200 Q TRAP)。

因为能够确认到固定化酶处理水中的尿素浓度为1μg/L以下，所以接着使用固定化酶处理水作为稀释溶剂来制备尿素标准溶液。作为用于制备尿素标准溶液的尿素，使用富士胶片和光纯药公司制的特级尿素。在此制备尿素浓度分别为0、1、2、5、10、20、50μg/L的7种尿素标准溶液。

接着，使另行确认了尿素浓度为5μg/L的样品水在4℃、SV 2h^-1的条件下通过上述固定化酶，使用通过了固定化酶后的样品水作为图1所示的 FIA装置的载体水，分析预先制备的7种尿素标准溶液。分析结果示于表 1。由表1可知，分析的尿素浓度与各尿素标准溶液的公称浓度大致相同。由此，可知通过使用固定化酶处理水作为载体水，能够测定准确的尿素浓度。

[表1]

[比较例1]

除了在实施例1的载体水的处理中未使用固定化酶之外，以与实施例 1相同的条件进行分析。结果示于表2。如表2所示，未能测定尿素浓度分别为0、1、2μg/L的标准溶液，尿素浓度分别为5、10、20、50μg/L的标准溶液的分析结果为0、5、15、46μg/L，为大致比本来的值小5μg/L的值。另外，另行测定所使用的载体水的尿素浓度，结果含有尿素5μg/L。可知若在载体水中包含一定水平以上的尿素，则不能准确地测定尿素。

[表2]

[实施例2]

使尿素浓度为约10μg/L的样品水以20℃、SV 500h^-1通过填充有通过与实施例1同样的方法制作的固定化酶的柱，制成固定化酶处理水，与实施例1同样地测定该固定化酶处理水中的尿素浓度，结果是尿素浓度为 1μg/L以下(即定量下限以下)。

[比较例2]

使尿素浓度为约10μg/L的样品水以20℃、SV 1000h^-1通过填充有通过与实施例1同样的方法制作的固定化酶的柱，与实施例1同样地测定通过了固定化酶的样品水的尿素浓度，结果是尿素浓度为约3μg/L。

[实施例3]

研究了固定化酶的耐久性。使尿素浓度为约5μg/L的原水以4℃、SV 2h^-1的条件连续通过填充有通过与实施例1同样的方法制作的固定化酶的柱，得到处理水。与实施例1同样地测定处理水中的尿素浓度，研究尿素浓度的经时变化。另外，也同样测定原水中的尿素浓度。结果示于图2。在图2中，通过固定化酶处理后的样品水被标记为“处理水”。如图2所示，在通过固定化酶处理后的样品水中，即使从通水开始后经过100天，尿素浓度仍低于1μg/L。此外，测定中的尿素检出下限为1μg/L，认为在图 2中处理水的尿素浓度在低于1μg/L的浓度范围内变动的部分，实际上相当于未检测到尿素。根据图2所示的结果可知，通过基于本发明的制造方法，能够长期地制造尿素浓度1μg/L以下的无尿素水。这意味用于尿素定量的水、特别是载体水可以通过使纯水通过固定化酶而连续地生成必要的量，能够在长时间连续地进行尿素定量时连续供给需要的载体水。

附图标记说明

10 取样阀

11 样品环管

31 反应盘管

32 检测器

33 背压盘管

50 无尿素水制造部

51 固定化酶。

Claims (13)

1.一种无尿素水的制造方法，其中，通过至少向固定有尿素酶的载体通水，制造尿素浓度为1μg/L以下的无尿素水。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，

所述载体为选自合成吸附剂、离子交换树脂及包埋固定化载体中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，

将所述载体中的所述尿素酶的固定化量设为300U/g-R以上7500U/g-R以下。

4.一种尿素的定量方法，其中，对样品水中的尿素进行定量，

所述定量方法中，使用无尿素水作为制备尿素标准溶液的水和载体水中的至少一者。

5.根据权利要求4所述的定量方法，其中，

所述无尿素水中的尿素浓度为1μg/L以下。

6.一种尿素的定量方法，其中，对样品水中的尿素进行定量，

所述定量方法中，使用通过权利要求1～3中任一项所述的制造方法制造的无尿素水作为选自制备尿素标准溶液的水和载体水中的至少一者。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的定量方法，其中，

基于选自流动注射法、液相色谱法和质谱分析法中的至少一种方法对所述样品水中的尿素进行定量。

8.一种尿素的分析装置，其对载体水的水流导入一定量的样品水来进行所述样品水的尿素定量，

所述分析装置具有无尿素水制造部，

其中，将向所述无尿素水制造部通水而获得的尿素浓度1μg/L以下的处理水作为所述载体水。

9.根据权利要求8所述的分析装置，其中，

所述无尿素水制造部至少具备固定有尿素酶的载体，

向所述固定有尿素酶的载体通水而获得所述处理水。

10.根据权利要求9所述的分析方法，其中，

所述载体为选自合成吸附剂、离子交换树脂及包埋固定化载体中的至少一种。

11.根据权利要求9或10所述的分析方法，其中，

所述载体中的所述尿素酶的固定化量为300U/g-R以上、7500U/g-R以下。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的分析装置，其中，

对所述无尿素水制造部的通水温度为0℃以上、60℃以下。

13.根据权利要求8～12中任一项所述的分析方法，其中，还具备冷却单元，

所述冷却单元对选自向所述无尿素水制造部供给的水和所述无尿素水制造部中的至少一者进行冷却，以使所述通水温度为30℃以下。

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