CN110609032A - 基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于纳米氧化钼优异的催化性能，使用了氧化钼量子点(MoOxQDs)作为过氧化物模拟酶应用于葡萄糖的检测，结果表明，氧化钼量子点能有效催化过氧化氢(H2O2)氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应。本发明基于葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOx)的作用下产生H2O2的原理，建立了一种简单、经济可视化检测血清中葡萄糖含量的新方法。

Description

基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测 方法
技术领域
本发明涉及催化氧化技术领域，更具体的说是涉及一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法。
背景技术
葡萄糖是自然界中分布最广并且极其重要的一种单糖，作为人体的基本元素和最基本的医疗原料，葡萄糖的检测有着十分重要的作用，在临床化学中，测定葡萄糖是一种重要的检测项目。
过氧化物酶因为可以催化过氧化氢进行各种化学反应，被广泛应用于分析诊断学等领域，辣根过氧化物酶HRP是一种最常见的过氧化物酶，常被用于双氧水和葡萄糖的检测中，但是过氧化物酶作为一种天然酶，其催化活性容易受pH、温度等自然环境改变的影响，并且酶的提取、纯化和存储费用也都比较高。
因此，如何提供一种简单经济、可视化检测血清中葡萄糖含量的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于氧化钼量子点的葡萄糖可视化检测方法，本发明基于纳米氧化钼优异的催化性能，使用了氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用于葡萄糖的检测。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，包括以下步骤：
(1)葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢；
(2)依次加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、氧化钼量子点和HAc-NaAc缓冲溶液，将混合溶液在25-50℃下反应20min，测定溶液的吸光度；
(3)通过颜色的比对获得葡萄糖的浓度值。
葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)的作用下产生过氧化氢，过氧化氢在氧化钼量子点的催化下与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺发生显色反应，并出现明显的颜色变化，最后通过简单的颜色对比就可得知葡萄糖的浓度。
具体的，氧化钼量子点催化TMB-H2O2反应的催化机理参见图1，氧化钼量子点的催化特性从本质上与加入H2O2分解产生·OH有关，氧化钼量子点通过与H2O2反应使其O-O键断裂而产生·OH，生成的·OH在氧化钼量子点表面氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，使其显色。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(1)中产生的过氧化氢浓度为0.05-2.0mmol/L，优选为0.05-1.0mmol/L，进一步优选为1.0mmol/L。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(2)中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的浓度为0.05-0.25mmol/L。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(2)中反应环境的pH值为3.50-4.00，优选为3.75。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(2)中反应温度为25-50℃，优选为40℃。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(2)中反应时间为5-300min，优选为20min。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(2)中检测溶液吸光度的波长为500-800nm，优选656nm。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，步骤(1)中所述葡萄糖浓度为5-200μmol/L。
优选的，在上述一种基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法中，所述氧化钼量子点制备方法为：以氧化钼粉末为原料，30％的双氧水作为氧化剂，在室温环境下，通过一步反应合成氧化钼量子点。
上述技术方案的有益效果是：上述方法能够一步合成，速度快、耗时短，可在一小时或者更短时间内合成；并且上述反应可在室温条件下进行，不需要外部刺激，得到的氧化钼量子点具有强荧光性。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明基于纳米氧化钼优异的催化性能，使用氧化钼量子点(MoOxQDs)作为过氧化物模拟酶应用于葡萄糖的检测，实现氧化钼量子点有效催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应，建立了一种简单、经济可视化检测血清中葡萄糖含量的新方法，并且回收率及线性关系良好，提高了检测结果的准确度及精确度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明氧化钼量子点催化TMB显色的紫外吸收光谱图；
图2附图为本发明H2O2浓度对氧化钼量子点过氧化物模拟酶活性的影响；
图3附图为本发明TMB浓度对氧化钼量子点过氧化物模拟酶活性的影响；
图4附图为本发明反应时间对氧化钼量子点过氧化物模拟酶活性的影响；
图5附图为本发明不同浓度过氧化氢的标准曲线；
图6附图为本发明不同浓度葡萄糖的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种基于纳米氧化钼优异的催化性能，使用氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用于葡萄糖的检测
1、原料与试剂
本发明实施例主要用到的原料与试剂参见表1，实验水为二次蒸馏水，血清样品来自南昌大学校医院。
表1 实验原料与试剂
试剂名称 分子式/简称 生产厂商
过氧化氢 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 天津玉福泰化学试剂有限公司
醋酸钠 NaAc 西陇化工股份有限公司
冰醋酸 HAc 西陇科学股份有限公司
无水乙醇 C<sub>2</sub>H<sub>6</sub>O 国药集团化学试剂有限公司
3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 TMB 生工生物工程股份有限公司
葡萄糖氧化酶 GO<sub>x</sub> Sigma-AldrichCorporation
葡萄糖 C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub> 国药集团化学试剂有限公司
氧化钼粉末 Sigma-AldrichCorporation
Tris-HCl缓冲溶液 Tris-HCl --
2、仪器设备
本发明实施例主要使用到的仪器设备如表2。
表2 仪器设备
仪器名称 型号 生产厂家
pH计 PHS-3C 上海仪电科学仪器股份有限公司
台式高速离心机 TG16-WS 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
电子天平 FA224 上海舜宇恒平科学仪器有限公司
恒温水浴箱 HH-8 常州国华电器有限公司
紫外分光光度计 722 天津冠泽科技有限公司
电热鼓风干燥箱 WGLL-65BE 天津市泰斯特仪器有限公司
3、氧化钼量子点的过氧化物模拟酶特性
以0.25mmol/L TMB为显色底物，在1.0mmol/L H2O2存在下，140μL氧化钼量子点为催化剂研究氧化钼量子点的过氧化物模拟酶活性。
如图1所示，在0.20mol/L HAc-NaAc缓冲溶液中(pH 3.75)，单独的H2O2或氧化钼量子点均不能氧化TMB使其发生显著的颜色变化，溶液吸光度在500-800nm范围内保持很低的数值。但是，当过氧化氢和氧化钼量子点共同存在时，氧化钼量子点催化H2O2分解产生自由基，进而使TMB生成氧化产物ox-TMB，溶液颜色从无色变为蓝色(左侧照片)，并在650nm附近出现了ox-TMB的特征峰。此外，当氧化钼量子点、H2O2和TMB的显色溶液中加入10mol/LH2SO4并水浴10min后，溶液颜色由蓝色变为黄色(右侧照片)，显色反应停止，这与HRP催化TMB与H2O2显色反应的现象一致，说明氧化钼量子点确实具有与HRP类似的过氧化物酶催化活性。
4、单个变量对氧化钼量子点-过氧化物模拟酶活性的影响
4.1 H2O2对氧化钼量子点-过氧化物模拟酶活性的影响
设置两组等梯度浓度的H2O2溶液。其中组号1-7为TMB+H2O2+MnOxQDs实验组、组号8-14为TMB+H2O2对照组。具体配比参见表3。(注：表中的浓度皆为最终浓度)
表3 H2O2浓度优化实验中各试剂配比
25℃恒温水浴10min后，于656nm处测其吸光度，结果如图2所示，没有氧化钼量子点时，单独的过氧化氢在0-3.0mmol/L范围内，不能催化TMB氧化显色。当过氧化氢和氧化钼量子点共存时，可将TMB氧化显色，且在0-1.0mmol/L时吸收值随过氧化氢浓度的升高而逐渐升高并在过氧化氢浓度为1.0mmol/L达到最大值，而后随着过氧化氢浓度的进一步升高吸收值逐渐下降。因此，最适H2O2浓度为1.0mmol/L。
4.2 TMB对氧化钼量子点-过氧化物模拟酶活性的影响
其中1-6为TMB+H2O2+MnOxQDs实验组，7-12为TMB+H2O2对照组，具体配比参见表4。(注：表中的浓度皆为最终浓度)
表4 TMB浓度优化实验中各试剂配比
25℃恒温水浴10min后，于656nm处测其吸光度，结果如图3所示，没有氧化钼量子点时，单独的过氧化氢在TMB浓度为0-0.25mmol/L范围内，不能催化TMB氧化显色。当过氧化氢和氧化钼量子点共存时，可将TMB氧化显色，且吸收值随过TMB浓度的升高而逐渐升高并在TMB浓度为0.25mmol/L达到最大值，因此，最适TMB浓度为0.25mmol/L。
4.3 pH对氧化钼量子点-过氧化物模拟酶活性的影响
因TMB显色反应受pH影响较大，本发明考察了pH对TMB显色的影响。结果如表5所示。
表5 pH值优化实验
从表5中可以得出，没有氧化钼量子点时，单独的过氧化氢在pH 3.25-4.50范围内，不能催化TMB氧化显色。当过氧化氢和氧化钼量子点共存时，在pH 3.25-4.50范围内可将TMB氧化显色，且吸收值在pH 3.25-3.75范围内随pH增加逐渐升高，并在pH为3.75时吸光度达到最大值，而后随着pH的进一步升高，吸光度逐渐下降。因此，最适pH值为3.75。
4.4 温度对氧化钼量子点-过氧化物模拟酶活性的影响
因TMB显色反应受温度影响较大，本发明考察了温度对TMB显色的影响。结果参见表6。
表6 温度优化实验
从表6中可以得出，没有氧化钼量子点时，单独的过氧化氢在25-50℃范围内，不能催化TMB氧化显色。当过氧化氢和氧化钼量子点共存时，在25-50℃范围内可将TMB氧化显色，且吸光度值随着温度从25℃升高而逐渐增加，并在40℃时吸光度值达到最大，而后随着温度的进一步高升，吸光度值反而降低，因此最佳反应温度为40℃。
4.5 反应时间对氧化钼量子点-过氧化物模拟酶活性的影响
本发明考察了反应时间对TMB显色的影响，如图4所示，TMB与过氧化氢或氧化钼量子点单独存在时，在480秒内体系的吸收值略有增强。但是，当过氧化氢、氧化钼量子点与TMB三者共存时，体系的颜色迅速发生变化，吸光度值快速增加，并在240秒后增幅减缓并逐渐趋于稳定。因此，本发明选择最佳反应时间为300秒，即5min。
5、过氧化氢标准曲线的测定
在1.5mL离心管中分别加入160μL不同浓度的过氧化氢溶液，140μL氧化钼量子点，160μL 0.25mmol/L的TMB溶液和540μL缓冲溶液，40℃下水浴5min，而后于656nm处测定吸光度值，结果见图5。
体系吸光度值随着过氧化氢浓度的增加而逐渐增强，并在250-1000μM时，体系吸收强度与过氧化氢浓度呈现良好的线性关系，线性方程为：A＝0.433+0.58[H2O2]，相关系数R为0.992。图5中上排为TMB显色照片，下排为对应的硫酸终止反应后的照片。
6、葡萄糖标准曲线的测定
葡萄糖的测定分为两步：
1.设置两组溶液，其中1-11为实验组、12-22为对照组用于观察硫酸终止反应的颜色变化情况。取22只1.5mL的离心管编号1-22，分别加入30μL(10.0mg/mL)葡萄糖氧化酶(GOx)和20μL溶解于0.1mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.10)中的不同浓度的葡萄糖溶液，37℃水浴30min。
2.反应结束后，向上述22个离心管中分别加入160.0μL TMB(0.25mmol/L)、140.0μL氧化钼量子点和650μLHAc-NaAc缓冲溶液(pH 3.75，0.20mol/L)，混匀后于40℃下反应20min，最后于656nm处测定吸光度值。对照组溶液则在反应后加入10mol/L H2SO4终止反应，颜色变化如图6下排照片所示，葡萄糖氧化酶可催化葡萄糖氧化，产生葡糖糖酸和过氧化氢。实验中，通过测定葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖产生的过氧化氢间接测定葡萄糖的含量。
从图6可以得到，随着葡萄糖浓度的增加，溶液吸光度值逐渐增加，溶液颜色也从无色逐渐变为浅蓝色并最终变为深蓝色(上排照片)，当葡萄糖浓度为1-240μmol/L时，吸光度值与葡萄糖浓度存在良好的线性关系，线性方程为：A＝4.19+0.0007[Glucose]，线性相关系数R为0.995。
7、人血清中葡萄糖的测定
(1)血清样品的处理：健康人体的血清样品由南昌大学校医院提供。首先将30μL的血清样品与20μL蒸馏水混合后，加入500μL 0.11M Ba(OH)2和500μL 76.5mM ZnSO4以去除血清中过多的蛋白质。在30℃反应30min后，于4000rpm离心10min并去除下层沉淀。上层清液用Tris-HCl缓冲溶液(10mM,pH 7.0)稀释2倍备用。
(2)血清中葡萄糖的测定：将30μL(10.0mg/mL)葡萄糖氧化酶(GOx)加入至20μL处理好的血清样品中(Smaple 1-3)，37℃水浴30min后，依次加入160.0μL TMB(0.25mmol/L)、140.0μL氧化钼量子点和650μL HAc-NaAc缓冲溶液(pH 3.75，0.20mol/L)，40℃下反应20min，最后于656nm处测定吸光度值A，并根据方程[Glucose]＝((A-0.419)/0.0007)×血清稀释倍数(100)计算血清中的葡萄糖含量，结果参见表7。
表7 人血清中葡萄糖含量的测定结果
样品编号 吸光度值 葡萄糖含量(mmol/L)
1 0.4411 3.152
2 0.4485 4.216
3 0.4643 6.48
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢；
(2)依次加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、氧化钼量子点和HAc-NaAc缓冲溶液，将混合溶液在25-50℃下反应20min，测定溶液的吸光度；
(3)通过颜色的比对获得葡萄糖的浓度值。
2.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(1)中产生的过氧化氢浓度为0.05-2.0mmol/L。
3.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(2)中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的浓度为0.05-0.25mmol/L。
4.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(2)中反应环境的pH值为3.50-4.00。
5.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(2)中反应温度为25-50℃。
6.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(2)中反应时间为5-300min。
7.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(2)中检测溶液吸光度的波长为500-800nm。
8.根据权利要求1所述的基于氧化钼量子点作为过氧化物模拟酶应用的葡萄糖检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述葡萄糖浓度为5-200μmol/L。
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