CN117825349A - 一种双模式光学传感体系及其检测葡萄糖的方法 - Google Patents
一种双模式光学传感体系及其检测葡萄糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物传感技术领域，公开了一种双模式光学传感体系及其检测葡萄糖的方法，以具有类过氧化物酶性质的硫化钼纳米花、葡萄糖氧化酶、比色/荧光探针构成GOx‑MoS2‑OPD传感体系。本发明利用葡萄糖氧化酶和硫化钼纳米花对葡萄糖进行级联催化产生的羟基自由基将单一探针氧化，产生比色和荧光两种光学信号，实现葡萄糖的双模式光学传感。本发明集成了比色和荧光技术的优点，实现高灵敏度、高特异性的葡萄糖检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体的说是涉及一种双模式光学传感体系及其检测葡萄糖的方法。
背景技术
葡萄糖是生物体必备的能量来源，被认为是形成其他生物分子的代谢中间体。人体血液、尿液等生理环境中的葡萄糖水平异常会导致代谢相关疾病的产生，如心血管疾病、肥胖、糖尿病等等。因此，快速准确地测定葡萄糖水平对检测生理健康至关重要。
天然酶是生物环境中将底物转化为产物的催化剂，通常具有蛋白质或者RNA结构，因其在催化化学方面的高效率和选择性而广泛应用于生物分析。然而在极端pH环境或者高温环境下，天然酶往往会失去活性。纳米酶由于其催化活性与天然酶类似，且相较于天然酶具有较高的稳定性，且低成本易于制备。自从发现Fe3O4纳米颗粒被验证具有类过氧化物酶性质以来，各种纳米酶被开发出来，包括贵金属纳米颗粒、过渡金属氧化物和碳基材料等。具有不同催化活性的纳米酶已被发现，包括类过氧化物酶、过氧化氢酶、水解酶和超氧化物歧化酶等。目前，纳米酶已成为非常有潜力的天然酶替代品。
随着分析技术的发展，电化学、比色法、荧光法和表面增强拉曼散射法等技术手段已被应用于葡萄糖检测。目前，基于纳米酶的生物传感器大多基于以上单一检测手段构建，其性能存在各种不足，影响检测的灵敏度和可靠性。电化学传感器在葡萄糖传感应用中常被开发用于非侵入式和便携式检测，但易受到电极制备复杂、成本高昂的制约。比色法检测葡萄糖常被应用于便携式检测设备中，但是比色信号依赖于单一衬底的信号，检测过程中易受环境光的影响。荧光法检测葡萄糖具有灵敏度高，稳定性好的优点，但是单一检测模式的准确性易受到外部干扰的影响。目前，已有研究报道基于比色/荧光双模式的传感体系，例如基于比色产物（oxTMB）与Ru(bpy)3 2+之间的内滤波响应原理，构建了用于葡萄糖检测的比色-荧光双检测模式光化学传感器（Frontiers in Chemistry, 2022, 10, 871013）；再如基于CuPd@H-C3N4良好的氧化酶/过氧化物酶样活性，采用比色探针（TMB）和荧光探针（BA）建立了比色和荧光生物传感平台，对生理液体中葡萄糖进行检测（Talanta, 2022, 241,123221）。
然而，以上的比色/荧光双模式传感体系需要使用两种探针分别产生比色和荧光信号，传感体系复杂，影响检测可靠性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双模式光学传感体系及其检测葡萄糖的方法，该方法利用葡萄糖氧化酶和具有类过氧化物酶性质的纳米酶对葡萄糖进行级联催化产生的活性氧将探针氧化，产生比色和荧光两种光学信号，实现葡萄糖的双模式光学传感，不仅操作简单，准确度高，还具有较高的稳定性。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明是一种双模式光学传感体系，其特征在于：所述双模式光学传感体系为比色荧光双模式葡萄糖传感体系，以葡萄糖氧化酶、具有类过氧化物酶性质的纳米酶、比色/荧光探针构成，其中所述纳米酶是采用水热法制备得到的硫化钼纳米花，所述硫化钼纳米花的尺寸为125-155 nm，所述比色/荧光探针是邻苯二胺，所述硫化钼纳米花的浓度为1-10μg/mL，所述葡萄糖氧化酶的浓度为10-100μg/mL，所述邻苯二胺的浓度为0.1-1.6mg/mL。
本发明的进一步改进在于：采用水热法制备得到的硫化钼纳米花是以钼酸钠二水合物（Na2MoO4·2H2O）和硫代乙酰胺（CH3CSNH2）为前驱体，以十六烷基三甲基氯化铵（CH3(CH2)15N(Cl)(CH3)3）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为保护剂得到硫化钼纳米花，具体的采用水热法制备得到的硫化钼纳米花包括以下步骤：
步骤a、取钼酸钠二水合物水溶液与硫代乙酰胺水溶液在室温下搅拌混合；
步骤b、依次加入十六烷基三甲基氯化铵水溶液和聚乙烯吡咯烷酮水溶液并搅拌混合得到混合液；
步骤c、将步骤b得到的混合溶液加入到高压反应釜中加热；
步骤d、反应完成后冷却至室温，离心即可得到具有类过氧化物酶性质的MoS2纳米花。
本发明的进一步改进在于：所述步骤c的加热方式在电热恒温鼓风干燥箱中加热至200°C，反应时间为12 h。
本发明的进一步改进在于：所述比色/荧光探针的制备方法为：将邻苯二胺粉末溶于缓冲液中备用。
本发明的进一步改进在于：缓冲液为醋酸缓冲液或醋酸钠缓冲液，缓冲液的pH=4.0。
本发明提供了一种双模式光学传感体系检测葡萄糖的方法，该方法具体包括以下步骤：
步骤1、将葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖样品溶液混合，孵育得到孵育液，随后向孵育液中加入邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液，继续孵育，采用紫外可见分光光度计测定邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液的吸收光谱，以双模式光学传感体系的比色探针吸光度增加值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制出浓度-吸光度增加值工作曲线，实现葡萄糖的比色检测；
步骤2、将葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖样品溶液混合，孵育得到孵育液，随后向孵育液中加入邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液，继续孵育，采用荧光分光光度计测定邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液的荧光光谱，荧光光谱的激发光为420 nm，以发射光谱560nm处传感体系的荧光强度增加值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制出浓度-荧光强度增加值工作曲线，实现葡萄糖的荧光检测。
本发明的进一步改进在于：在所述步骤1和所述步骤2中的孵育时间为30 min，孵育温度为37°C。
本发明的进一步改进在于：所述步骤1中所得的浓度-吸光度增加值工作曲线回归方程为Y=0.0161+0.0034X，R2=0.987；其中，Y为传感体系在450 nm处的吸光度增加值，X为葡萄糖浓度；所述步骤2中所得的浓度-荧光强度增加值工作曲线回归方程为Y=27554.7708+816.2475X，R2=0.9936；其中，Y为传感体系在发射光谱560 nm处的荧光强度增加值，X为葡萄糖浓度。
本发明的有益效果是：
（1）为提高葡萄糖的检测高选择性和准确度，并降低检测时间与成本，本发明构建了双模式光学传感体系，将天然酶和纳米酶以及比色/荧光探针集成在一个体系中，不仅设计简单，操作方便，而且具备对葡萄糖的高选择性和检测稳定性。
（2）本发明合成了具有过氧化物酶性质的硫化钼纳米花，与天然酶相比，纳米酶具有更高的稳定性，更稳定的催化活性。
（3）相比于当前用于葡萄糖检测的双探针双信号检测模式，本发明双模式光学传感体系避免了不同探针带来的误差，采用单一探针被氧化产生的比色/荧光双信号，具有更高的可靠性。
（4）本发明提供的双模式光学传感体系制备简单，无需复杂的仪器和苛刻的实验条件，本发明制备的硫化钼纳米花具有较好的类过氧化物酶性质和稳定性，使用葡萄糖氧化酶和硫化钼纳米花参与级联催化反应，具有较高的选择性和灵敏度。本发明构建比色/荧光双信号模式，具有检测时间短，准确度高等优点，为发展其他类型的生物传感器提供了新的思路。本发明利用葡萄糖氧化酶和硫化钼纳米花对目标物进行级联催化，产生的羟基自由基介导比色/荧光信号变化，可得葡萄糖浓度与比色/荧光信号的定量关系。
附图说明
图1是本发明硫化钼纳米花的透射电子显微镜照片。
图2是本发明硫化钼纳米花的类过氧化物酶活性的紫外-可见近红外吸收光谱图。
图3是本发明双模式光学传感体系对葡萄糖检测的光谱图。其中，（a）为比色模式的光谱图，（b）为荧光模式的光谱图。
图4是本发明双模式光学传感体系检测葡萄糖的性能。其中，（a）为比色模式工作曲线，（b）为荧光模式工作曲线。
图5是本发明双模式光学传感体系检测葡萄糖的选择性。其中，（a）为比色模式选择性，（b）为荧光模式选择性
具体实施方式
以下将以图式揭露本发明的实施方式，为明确说明起见，许多实务上的细节将在以下叙述中一并说明。然而，应了解到，这些实务上的细节不应用以限制本发明。也就是说，在本发明的部分实施方式中，这些实务上的细节是非必要的。
本发明提供了一种双模式光学传感体系，所述双模式光学传感体系为比色荧光双模式葡萄糖传感体系，以葡萄糖氧化酶、具有类过氧化物酶性质的纳米酶、比色/荧光探针构成，其中所述纳米酶是采用水热法制备得到的硫化钼纳米花，所述比色/荧光探针是邻苯二胺。本发明中，提供的双模式光学传感体系包含两个部分，酶级联催化以及比色/荧光探针。葡萄糖氧化酶和具有类过氧化物酶性质的硫化钼纳米花形成酶级联催化反应体系，可以产生羟基自由基氧化邻苯二胺为2,3-二氨基苯那嗪（DAP）以产生比色/荧光信号变化。
本发明还提供了一种将双模式光学传感体系用于检测葡萄糖的方法，采用上述葡萄糖氧化酶（GOx）和硫化钼（MoS2）纳米花催化葡萄糖产生羟基自由基，羟基自由基氧化邻苯二胺（OPD）为DAP产生比色信号和荧光信号，进行葡萄糖的定量检测。集成了天然酶和MoS2纳米花的级联催化体系，兼具高选择性和稳定性，确保对葡萄糖检测唯一性和对传感信号的高效扩增。采用比色/荧光双模式检测，避免了单一模式可能会存在的误差，具有灵敏度高、可靠性高的优点。
本发明的双模式检测葡萄糖的方法，是利用上述双模式光学传感体系，加入葡萄糖溶液，孵育一段时间后，用紫外可见分光光度计测定溶液的吸收光谱，建立吸光度增加值与葡萄糖浓度的线性关系。再用荧光分光光度计测定溶液的荧光光谱，建立荧光强度增加值与葡萄糖浓度的线性关系，具体包括以下步骤：
步骤1、将葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖样品溶液混合，在37°C下孵育30 min得到孵育液，随后向孵育液中加入邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液，继续孵育，采用紫外可见分光光度计测定邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液的吸收光谱，以双模式光学传感体系的比色探针吸光度增加值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制出浓度-吸光度增加值工作曲线，实现葡萄糖的比色检测；
步骤2、将葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖样品溶液混合，在37°C下孵育30 min得到孵育液，随后向孵育液中加入邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液，继续孵育，采用荧光分光光度计测定指邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液的荧光光谱，荧光光谱的激发光为420 nm，以发射光谱560 nm处传感体系的荧光强度增加值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制出浓度-荧光强度增加值工作曲线，实现葡萄糖的荧光检测。
葡萄糖氧化酶（GOx）、邻苯二胺（OPD）、钼酸钠二水合物（Na2MoO4·2H2O）、硫代乙酰胺（CH3CSNH2）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）、葡萄糖（Glu）、谷胱甘肽（GSH）、半乳糖（Gal）、果糖（Fru）、D-蔗糖（Suc）、甘露糖（Man）、盐酸多巴胺盐酸盐（DA）、抗坏血酸（AA）、尿素（UA）、十六烷基三甲基氯化铵（CH3(CH2)15N(Cl)(CH3)3），以上原材料均可在化学试剂公司或者生物制药公司购买。
MoS2纳米花的制备
称取240 mg纳米酶以钼酸钠二水合物Na2MoO4·2H2O于50 mL烧杯中，加入12 mL超纯水，搅拌溶解配置成20 mg/mL的溶液备用。称取380 mg硫代乙酰胺CH3CSNH2于50 mL烧杯中，加入20 mL超纯水，搅拌溶解配置成19 mg/mL的溶液备用，称取40 mg 十六烷基三甲基氯化铵CH3(CH2)15N(Cl)(CH3)3于50 mL烧杯中，加入4 mL超纯水，搅拌溶解配置成10 mg/mL的溶液备用。称取40 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP于50 mL烧杯中，加入4 mL超纯水，搅拌溶解配置成10 mg/mL的溶液备用。首先，取已配置好的Na2MoO4·2H2O水溶液12 mL与CH3CSNH2水溶液20 mL于50 mL烧杯中，在室温下磁力搅拌混合10 min，随后依次加入CH3(CH2)15N(Cl)(CH3)3水溶液4 mL和PVP水溶液4 mL超声10 min并磁力搅拌混合10 min。将混合溶液共40mL加入到50 mL水热合成反应釜中在电热恒温鼓风干燥箱中加热，温度为200°C，时间为12h。反应完成后冷却至室温，取出反应釜内液体与离心管中，在5000 rpm转速下离心15 min，弃去上清，保留沉淀加入超纯水重新分散离心，重复三次即可得到MoS2纳米花。
由图1中的透射电子显微镜可知，制备得到的MoS2纳米材料呈花状，尺寸为125-155 nm。
对制备的MoS2纳米花进行类过氧化物酶性质测定，结果如图2 所示，TMB+MoS2+H2O2组和对比组相比在652 nm处存在显著的吸收峰，表明MoS2纳米花可以催化H2O2产生羟基自由基，羟基自由基氧化TMB产生蓝色复合物，即MoS2纳米花具有类过氧化物酶活性。
利用制备的MoS2纳米花与葡萄糖氧化酶（GOx）以及邻苯二胺（OPD）构建双模式光学传感体系检测葡萄糖的检测限和线性范围
将100 μL不同浓度的葡萄糖水溶液加入到50 μL含有GOx的Tris-HCl缓冲液中，GOx的浓度为1.5 mg/mL，缓冲液的浓度为0.01 M，缓冲液的pH为7.5，37°C孵育30 min后，加入800 μL OPD溶液和50 μL MoS2纳米花水溶液。OPD溶液的浓度为1 mg/mL，溶质为OPD，溶剂为pH值为4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液，MoS2纳米花水溶液的浓度为100 μg/mL。在37°C下进一步孵育30 min，随后采用紫外可见分光光度计测定溶液的吸收光谱，采用荧光分光光度计测定溶液的荧光光谱，激发光为420 nm。每组实验重复三次，建立起比色和荧光信号与葡萄糖浓度的关系。按照LOD = 3S/N计算其检测限，其中，S为空白标样的标准偏差，N为斜率。
如图3所示，对双模式传感体系葡萄糖检测活性进行测试，OPD+MoS2+Glu+ GOx组和对比组相比在450 nm处存在显著的属于DAP的吸收峰，如图3a，在560 nm处存在显著的属于DAP的荧光发射峰，如图3b，表明双模式光学传感体系纳米花可以催化葡萄糖产生羟基自由基，羟基自由基氧化OPD为DAP产生比色信号和荧光信号，进行葡萄糖的定量检测。
如图4中的a所示，比色模式下，所得的工作曲线回归方程为Y=0.0161+0.0034X,R2=0.987；其中，Y为传感体系在450 nm处的吸光度增加值，X为葡萄糖浓度，检测限为0.95μM。
如图4中的b所示，在荧光模式下，所得的工作曲线回归方程为Y=27554.7708+816.2475X, R2=0.9936；其中，Y为传感体系在发射光谱560 nm处的荧光强度增加值，X为葡萄糖浓度，检测限为0.60 μM。由此可知，双模式光学传感体系与其它类似的葡萄糖传感体系相比，具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，为葡萄糖检测提供了一种荧光/比色双模式的检测平台。
双模式光学传感体系检测葡萄糖选择性
制备浓度为1 mM的葡萄糖水溶液以及10倍浓度的抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、谷胱甘肽（GSH）、半乳糖（Gal）、果糖（Fru）、蔗糖（Suc）溶液作为待测物。然后取100 μL待测物溶液加入到50 μL含有GOx的Tris-HCl缓冲液中，GOx的浓度为1.5 mg/mL，缓冲液的浓度0.01M，缓冲液的pH为7.5，37°C孵育30 min后，加入800 μL OPD溶液和50 μL MoS2纳米花水溶液。OPD溶液的浓度为1 mg/mL，溶质为OPD，溶剂为pH值为4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液，MoS2纳米花水溶液的浓度为100 μg/mL。在37°C下进一步孵育30 min，随后采用紫外可见分光光度计测定溶液的吸收光谱，采用荧光分光光度计测定溶液的荧光光谱。
本发明研究了潜在干扰物质如AA、UA、GSH、Gal、Fru、Suc等对双模式光学传感体系的影响。具体结果的图5中的a所示，在比色模式下，拟合曲线显示双模式光学传感体系对葡萄糖检测在1-100 μM的浓度范围内具有良好的线性，双模式光学传感体系对葡萄糖检测的LOD约为0.95 µM。如图5中b所示，在荧光模式下，拟合曲线显示双模式光学传感体系对葡萄糖检测在1-100 μM的浓度范围内具有良好的线性，双模式光学传感体系对葡萄糖检测的LOD为0.6 µM。如图5所示，当干扰物浓度为葡萄糖浓度10倍且其它条件相同时，葡萄糖样品的比色/荧光信号强度增加值与干扰物有显著差异，表明双模式光学传感体系对于葡萄糖具有良好的选择性。
本发明提供了一种双模式检测葡萄糖的光学传感体系，将葡萄糖浓度检测转变为比色/荧光双信号，结果可靠，采用葡萄糖氧化酶作为级联反应的第一步是为了利用天然酶对目标检测物的高选择性，可以保证将葡萄糖快速氧化为过氧化氢，再利用MoS2纳米花将过氧化氢转化成羟基自由基，羟基自由基氧化OPD为DAP，产生比色信号和荧光信号，实现对检测物中葡萄糖浓度的检测。
本发明利用天然酶的高选择性和纳米酶的稳定性，实现检测物的唯一性以及对传感信号的高效扩增；无色无荧光的邻苯二胺（OPD）被氧化为具有比色/荧光双信号的2,3-二氨基苯那嗪（DAP），实现了单一探针被氧化后产生比色和荧光双信号，不仅操作简单，准确度高，还具有较高的稳定性。
以上所述仅为本发明的实施方式而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理的内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种双模式光学传感体系，其特征在于：所述双模式光学传感体系为比色荧光双模式葡萄糖传感体系，以葡萄糖氧化酶、具有类过氧化物酶性质的纳米酶、探针构成，其中所述纳米酶是采用水热法制备得到的硫化钼纳米花，所述探针为比色/荧光双模式的探针，是邻苯二胺。
2.根据权利要求1所述的一种双模式光学传感体系，其特征在于：所述硫化钼纳米花的浓度为1-10μg/mL，所述葡萄糖氧化酶的浓度为10-100μg/mL，所述邻苯二胺的浓度为0.1-1.6mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种双模式光学传感体系，其特征在于：所述硫化钼纳米花的尺寸为125-155 nm。
4.根据权利要求1所述的一种双模式光学传感体系，其特征在于：采用水热法制备得到的硫化钼纳米花是以钼酸钠二水合物（Na2MoO4·2H2O）和硫代乙酰胺（CH3CSNH2）为前驱体，以十六烷基三甲基氯化铵（CH3(CH2)15N(Cl)(CH3)3）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为保护剂得到硫化钼纳米花，具体的采用水热法制备得到的硫化钼纳米花包括以下步骤：
步骤a、取钼酸钠二水合物水溶液与硫代乙酰胺水溶液在室温下搅拌混合；
步骤b、依次加入十六烷基三甲基氯化铵水溶液和聚乙烯吡咯烷酮水溶液并搅拌混合得到混合液；
步骤c、将步骤b得到的混合溶液加入到高压反应釜中加热；
步骤d、反应完成后冷却至室温，离心即可得到具有类过氧化物酶性质的MoS2纳米花。
5.根据权利要求4所述的一种双模式光学传感体系，其特征在于：所述步骤c的加热方式在电热恒温鼓风干燥箱中加热至200°C，反应时间为12 h。
6.根据权利要求1所述的一种双模式光学传感体系，其特征在于：所述比色/荧光探针的制备方法为将邻苯二胺粉末溶于缓冲液中备用。
7.根据权利要求6所述的一种双模式光学传感体系，其特征在于：缓冲液为醋酸缓冲液或醋酸钠缓冲液，缓冲液的pH=4.0。
8.一种应用权利要求1-7任一项所述的双模式光学传感体系检测葡萄糖的方法，其特征在于：检测葡萄糖的方法具体包括以下步骤：
步骤1、将葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖样品溶液混合，孵育得到孵育液，随后向孵育液中加入邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液，继续孵育，采用紫外可见分光光度计测定邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液的吸收光谱，以双模式光学传感体系的比色探针吸光度增加值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制出浓度-吸光度增加值工作曲线，实现葡萄糖的比色检测；
步骤2、将葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖样品溶液混合，孵育得到孵育液，随后向孵育液中加入邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液，继续孵育，采用荧光分光光度计测定邻苯二胺溶液和硫化钼纳米花溶液的荧光光谱，荧光光谱的激发光为420 nm，以发射光谱560 nm处传感体系的荧光强度增加值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制出浓度-荧光强度增加值工作曲线，实现葡萄糖的荧光检测。
9.根据权利要求8所述的一种双模式光学传感体系检测葡萄糖的方法，其特征在于：在所述步骤1和所述步骤2中的孵育时间为30 min，孵育温度为37°C。
10.根据权利要求8所述的一种双模式光学传感体系检测葡萄糖的方法，其特征在于：
所述步骤1中所得的浓度-吸光度增加值工作曲线回归方程为Y=0.0161+0.0034X，R2=0.987；其中，Y为传感体系在发射光谱450 nm处的吸光度增加值，X为葡萄糖浓度；
所述步骤2中所得的浓度-荧光强度增加值工作曲线回归方程为Y=27554.7708+816.2475X，R2=0.9936；其中，Y为传感体系在发射光谱560 nm处的荧光强度增加值，X为葡萄糖浓度。
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