CN106940315B - 有机磷农药检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有机磷农药检测方法，包括：将可能含有有机磷农药(例如甲拌磷、氧乐果或乐果)的测试样品与金核铂壳纳米粒子、聚丙烯酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系；其后加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中有机磷农药的检测。本发明还公开了一种有机磷农药检测试剂盒，包括过氧化物酶的特征底物、金核铂壳纳米粒子、聚丙烯酸以及辅助试剂等。本发明提供的有机磷农药检测试方法简便快速、成本低且稳定性高，可应用于环境、食品等样品中残留有机磷农药的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种有机磷农药检测试剂盒及其应用，尤其涉及一种基于纳米模拟酶活性调控的有机磷农药检测方法及有机磷农药检测试剂盒，属于分析化学领域。
背景技术
酶是一类生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质。可以在适宜的环境中催化化学反应，但是由于酶固有的特性，其应用也受到了一些限制，比如蛋白酶容易变性和水解，而且高成本和严格的使用条件也限制了它们的应用。因此，开发一种具有类似催化活性的模拟酶尤为重要。
纳米模拟酶是一类非蛋白、人工合成的纳米结构，具有与天然酶有相似的催化性能。自2007年阎锡蕴等首次发现磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)具有内在的过氧化物酶特性以来，纳米粒子作为模拟酶的研究备受人们关注。与天然酶相比，纳米模拟酶的制备、纯化和储存都比较容易，且价格低廉，能够在比较苛刻的化学环境中使用。因此，纳米模拟酶的开发应用具有很高的市场前景。其中，基于纳米模拟酶如何实现有机磷农药的检测，也是业界研发人员关注的重点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有机磷农药检测试剂盒及其应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种有机磷农药检测方法，其包括：
(1)将可能含有有机磷农药的测试样品与金核铂壳纳米粒子、聚丙烯酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上；
(2)向步骤(1)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，并在室温下反应10min以上，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中有机磷农药的检测。
本发明实施例还提供了一种有机磷农药检测试剂盒，其包括：
过氧化物酶的特征底物，
金核铂壳纳米粒子，用以催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物，
聚丙烯酸，用以提高纳米粒子的稳定性，以及屏蔽可能干扰反应的金属离子和其它有机小分子，
以及，辅助试剂，包含适于使金核铂壳纳米粒子与有机磷农药结合的第一缓冲溶液和适于使所述金核铂壳纳米粒子催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物的第二缓冲溶液。
本发明实施例还提供了有机磷农药检测方法或有机磷农药检测试剂盒于检测有机磷农药中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
(1)提供的有机磷农药检测试剂盒采用有机磷农药与金核铂壳纳米粒子(Au@PtNPs)结合，从而抑制了金核铂壳纳米模拟过氧化物酶的催化活性，并基于此原理开发了高灵敏的有机磷农药检测方法，其对甲拌磷检测的线性范围为0.05-1ug/ml，灵敏度可达到30ng/ml以上；对氧乐果检测的线性范围为0.2-10ug/ml，灵敏度可达到100ng/ml以上；对乐果检测的线性范围为0.3-500ug/ml，灵敏度可达到150ng/ml以上。
(2)提供的有机磷农药检测试方法简便快速、成本低且稳定性高，可应用于环境、食品等样品中残留有机磷农药的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1合成的金核铂壳纳米粒子的TEM图；
图2是本发明实施例1中所获甲拌磷浓度-吸光值标准曲线图；
图3是本发明实施例2中所获氧乐果浓度-吸光值标准曲线图；
图4是本发明实施例3中所获乐果浓度-吸光值标准曲线图；
图5-图6是本发明对比例1中对于不同重金属的选择性的测试图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
本发明提供的一种金核铂壳纳米粒子(Au@Pt NPs)具有很高的类过氧化物酶的催化活性。与过氧化物酶相比，Au@Pt NPs模拟酶对于TMB-H2O2等显色体系具有更高的催化效率，对环境的耐受性更高。有机磷农药含有硫代磷酸酯基、硫基和氨基等基团，能够和Au@PtNPs产生较强的结合，并导致其类过氧化物酶催化活性的下降；不同浓度的有机磷农药与Au@Pt NPs作用，通过底物TMB-H2O2显色，在一定范围内有机磷农药浓度和反应体系的吸光值呈负相关。基于以上发现，本案发明人建立了检测有机磷农药的比色检测方法，该方法具有高灵敏，高选择、低成本等优点。
本发明实施例的一个方面提供了一种有机磷农药检测方法，其包括：
(1)将可能含有有机磷农药的测试样品与金核铂壳纳米粒子、聚丙烯酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上；
(2)向步骤(1)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，并在室温下反应10min以上，通过测定最终所获混合物在可见光波段的吸光值，从而实现对测试样品中有机磷农药的检测。
进一步的，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为19-26nm，其中金核的尺寸为15-22nm，铂壳的厚度为1.5-2.5nm。
较为优选的，所述过氧化物酶的特征底物包括3,4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步的，所述第一混合体系中聚丙烯酸的浓度为0.001-0.005wt％。
进一步的，所述第一混合体系中金核铂壳纳米粒子的浓度为0.2-0.6nM。
进一步的，所述第二混合体系中特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM。
进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5.0-10.0，浓度为5-15mM。
进一步的，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。
在一较为优选的实施方案中，所述有机磷农药检测方法，其包括：
Ⅰ、
ⅰ)将一系列不同浓度的标准有机磷农药的溶液与金核铂壳纳米粒子、聚丙烯酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上；
ⅱ)向步骤ⅰ)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，并在室温下反应10min以上，再分别测定各混合反应物在可见光波段的吸光值，据此建立有机磷农药浓度-吸光值标准曲线；
Ⅱ、
a)将测试样品与金核铂壳纳米粒子、聚丙烯酸在磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，并在室温下孵育30min以上；
b)向步骤a)最终所获混合体系中加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，并在室温下反应10min以上，再测定混合反应物在可见光波段的吸光值，并依据前述机磷农药浓度-吸光值标准曲线，测得测试样品中的机磷农药的浓度。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种有机磷农药检测试剂盒，其包括：
过氧化物酶的特征底物，
金核铂壳纳米粒子，用以催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物，
聚丙烯酸，用以提高纳米粒子的稳定性，以及屏蔽可能干扰反应的金属离子和其它有机小分子，
以及，辅助试剂，包含适于使金核铂壳纳米粒子与有机磷农药结合的第一缓冲溶液和适于使所述金核铂壳纳米粒子催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物的第二缓冲溶液。
进一步的，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为19-26nm，其中金核的尺寸为15-22nm，铂壳的厚度为1.5-2.5nm。
进一步的，所述过氧化物酶模拟物的特征底物包括3,4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
优选的，所述第一缓冲溶液采用浓度为5-15mM、pH值为5.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液。
优选的，所述第二缓冲溶液采用pH值为4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液。
本发明实施例还提供了有机磷农药检测方法或有机磷农药检测试剂盒于检测有机磷农药中的应用。
以下结合附图和若干个实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
实施例1
(1)金核铂壳纳米粒子的制备：利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为15nm的金纳米粒子溶液，之后取15ml合成的金纳米溶液(3nM)、0.112ml、10mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)9.328ml于超纯水混合并置于洁净的锥形瓶里，采用磁力搅拌器上搅拌并加热至80℃，再向混合溶液中缓慢加入0.56ml 10mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80℃并继续搅拌30min以保证溶液中的K2PtCl6完全被还原，即得到粒径约为20nm的金核铂壳纳米粒子，参见图1为制得的金核铂壳纳米粒子的TEM图。
(2)将步骤(1)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释20倍后与0.001wt％聚丙烯酸溶液混合加入200mM的磷酸盐缓冲液中(其中，聚丙烯酸的浓度为0.0001wt％，金核铂壳纳米粒子的浓度为0.2nM)，之后向20μL混合液中加入酶标板中，再加入80μL不同浓度(0-1ug)的甲拌磷溶液在室温条件下震荡孵育10～40min。
(3)向步骤(2)中孵育好的混合溶液中依次加入40μL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH4.0)40μL、1.0mM的TMB溶液20μL和2.2M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应10min时650nm处的吸光值。由此方法获得甲拌磷的检测标准曲线如图2所示，检测线性范围为0.05-1ug/ml，检测灵敏度可达到30ng/ml。
(4)自来水中甲拌磷农药的检测：将自来水用0.22μm微孔过滤膜过滤，之后参照上述步骤(1)和(2)方法测试样品，参照步骤(3)的标准曲线，可计算出自来水中甲拌磷的含量。
另外，参照步骤(1)-(3)的操作及基本相同的反应条件，还分析了各种金属离子的比对性的检测，其最终检测结果可参阅图5(其中甲拌磷的浓度为800ng/ml,K+,Ca2+,Na+,Mg2 +的浓度为40ug/ml，其他重金属离子浓度为1ug/ml)。
实施例2
(1)金核铂壳纳米粒子的制备：利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为20nm的金纳米粒子溶液，之后取15ml合成的金纳米溶液(3nM)、0.112ml,10mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)9.328ml于超纯水混合并置于洁净的锥形瓶里，采用磁力搅拌器上搅拌并加热至80℃，再向混合溶液中缓慢加入0.56ml 10mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80℃并继续搅拌30min以保证溶液中的K2PtCl6完全被还原，即得到粒径约为24nm的金核铂壳纳米粒子。
(2)将步骤(1)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释20倍后与0.002wt％聚丙烯酸溶液混合加入200mM的磷酸盐缓冲液中(其中，聚丙烯酸的浓度为0.0002wt％，金核铂壳纳米粒子的浓度为0.2nM)，之后向20μL混合液中加入酶标板中，再加入80μL不同浓度(0-1ug)的氧乐果溶液在室温条件下震荡孵育10～40min。
(3)向步骤(2)中孵育好的混合溶液中依次加入40μL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH4.0)40μL、1.0mM的TMB溶液20μL和2.2M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应10min时650nm处的吸光值。由此方法获得氧乐果农药的检测标准曲线如图3所示，检测灵敏度可达到100ng/ml，检测线性范围为0.2-10ug/ml。
(4)自来水中的氧乐果的检测：将自来水用0.22μm微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)和(2)方法测试样品，参照步骤(3)的标准曲线，可计算出自来水中氧乐果的含量。
实施例3
(1)金核铂壳纳米粒子的制备：利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为22nm的金纳米粒子溶液，之后取15ml合成的金纳米溶液(3nM)、0.112ml,10mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)9.328ml于超纯水混合并置于洁净的锥形瓶里，采用磁力搅拌器上搅拌并加热至80℃，再向混合溶液中缓慢加入0.56ml 10mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80℃并继续搅拌30min以保证溶液中的K2PtCl6完全被还原，即得到粒径约为26nm的金核铂壳纳米粒子。
(2)将步骤(1)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释20倍后与0.005wt％聚丙烯酸溶液混合加入200mM的磷酸盐缓冲液中(其中，聚丙烯酸的浓度为0.0005wt％，金核铂壳纳米粒子的浓度为0.4mM)，之后向20μL混合液中加入酶标板中，再加入80μL不同浓度(0-1ug)的乐果溶液在室温条件下震荡孵育10～40min。
(3)向步骤(2)中孵育好的混合溶液中依次加入40μL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH4.0)40μL、1.0mM的TMB溶液20μL和2.2M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应10min时650nm处的吸光值。由此方法获得乐果的检测标准曲线如图4所示，检测灵敏度可达到150ng/ml，检测线性范围为0.3-500ug/ml。
(4)自来水中的乐果的检测：将自来水用0.22μm微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)和(2)方法测试样品，参照步骤(3)的标准曲线，可计算出自来水中乐果的含量。
对比例1
(1)金核铂壳纳米粒子的制备：与实施例相同。
(2)将步骤(1)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释20倍后加入200mM的磷酸盐缓冲液中(其中金核铂壳纳米粒子的浓度为0.2nM)，之后向20μL混合液中加入酶标板中，再加入80μL的各种常见金属离子，包括，Hg2+，Cu2+，Bi3+，Pb2+，Ba2+，Co2+，Fe3+，Cd2+，Cr3+，Ni2+，K+，Ca2+，Mg2+，Mn2+，Sr2+，Al3+和Zn2+等。然后将上述溶液在室温条件下震荡孵育10～40min。
(3)向步骤(2)中孵育好的混合溶液中依次加入40μL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH4.0)40μL、1.0mM的TMB溶液20μL和2.2M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应10min时650nm处的吸光值。结果发现：Hg2+、K+、Ca2+、Na+、Mg2+对金核铂壳纳米催化TMB-H2O2溶液反应产生明显抑制作用(见图5和图6对比结果)。注：农药为浓度为0.8ug/mL，K+、Ca2+、Na+、Mg2+浓度为40ug/mL，其他离子浓度为1ug/mL。
以上实施例1-3及对比例1中所涉及的原料，如金核铂壳纳米粒子的前驱体及其它试剂均可通过市售途径获取。同时，本发明的各实施例中的纳米粒子制备方法可参考下列文献：《Analytical Chemistry》，2015,87(19):10153-60。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种有机磷农药检测方法，其特征在于包括：
Ⅰ、
ⅰ）将一系列不同浓度的标准有机磷农药溶液与金核铂壳纳米粒子、浓度为0.001-0.005wt%的聚丙烯酸在浓度为5-15mM ，pH值为5.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，所述第一混合体系中金核铂壳纳米粒子的浓度为0.2-0.6nM，并在室温下孵育30min以上，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为19-26nm，其中金核的尺寸为15-22nm，铂壳的厚度为1.5-2.5nm；
ⅱ）向步骤ⅰ）最终所获混合体系中加入pH值为4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，所述第二混合体系中过氧化物酶的特征底物的浓度为0.1-10.0mM，并在室温下反应10min以上，再分别测定各混合反应物在可见光波段的吸光值，据此建立有机磷农药浓度-吸光值标准曲线；
Ⅱ、
a）将测试样品与金核铂壳纳米粒子、浓度为0.001-0.005wt%的聚丙烯酸在浓度为5-15mM ，pH值为5.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液中充分混合形成第一混合体系，所述第一混合体系中金核铂壳纳米粒子的浓度为0.2-0.6nM，并在室温下孵育30min以上；
b）向步骤a）最终所获混合体系中加入pH值为4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶的特征底物，均匀混合形成第二混合体系，所述第二混合体系中过氧化物酶的特征底物的浓度为0.1-10.0mM，并在室温下反应10min以上，再测定混合反应物在可见光波段的吸光值，并依据前述机磷农药浓度-吸光值标准曲线，测得测试样品中的机磷农药的浓度。
2.根据权利要求1所述的有机磷农药检测方法，其特征在于：所述过氧化物酶模拟物的特征底物选自3,4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐中的任意一种或两种以上的组合。
3.如权利要求1-2中任一项所述的有机磷农药检测方法中所用的有机磷农药检测试剂盒，其特征在于包括：
过氧化物酶的特征底物，
金核铂壳纳米粒子，用以催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为19-26nm，其中金核的尺寸为15-22nm，铂壳的厚度为1.5-2.5nm；
聚丙烯酸，用以提高纳米粒子的稳定性，以及屏蔽可能干扰反应的金属离子和其它有机小分子，
以及，辅助试剂，包含适于使金核铂壳纳米粒子与有机磷农药结合的第一缓冲溶液和适于使所述金核铂壳纳米粒子催化氧化所述过氧化物酶的特征底物而形成显色底物的第二缓冲溶液，所述第一缓冲溶液采用浓度为5-15mM、pH值为5.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液，所述第二缓冲溶液采用pH值为4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的有机磷农药检测试剂盒，其特征在于：所述过氧化物酶模拟物的特征底物选自3,4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐中的任意一种或两种以上的组合。
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