CN115043428B - 一种具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学传感检测技术领域，公开了一种具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，包括以下步骤：取一烧杯，先往烧杯中加入DMF，再加入五水合硝酸铋，在常温下搅拌2小时，配制成A液；另取一个烧杯，先往烧杯中加入DMF，再加入偏钒酸铵，在常温下搅拌2小时，配制成B液；然后把A液和B液混合，在室温下继续搅拌反应10小时。本发明提供的具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，通过简单的溶液共沉淀法合成其表面具有高浓度氧空位的非晶态无定形钒酸铋(a‑BiVO4)，首次证明了钒酸铋纳米材料具有类氧化酶活性，通过其表面高浓度的氧空位可有效活化吸附氧为活性氧，从而引发特定的酶促反应。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学传感检测技术领域，具体为一种具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法。
背景技术
纳米酶是一种具有与天然酶机理相似的生物催化反应的纳米材料。由于纳米酶结合了典型的化学催化剂和生物催化剂的功能，并具有成本低、运行稳定性高、使用寿命长的优点，纳米酶在分析传感领域逐渐显示出巨大的应用潜力。各种具有类酶活性的纳米材料被陆续发现，如碳纳米材料、各种金属及合金、金属有机框架化合物以及金属氧化物等。其中，金属氧化物由于其尺寸可控制的合成、灵活多变的表面构建及修饰、丰富的物种类别等特点，成为科研人员优先考虑的对象。金属氧化物中的缺陷，特别是氧空位，在模拟酶活性和相关的表面催化过程中起着决定性的作用。显然，开发一种具有高浓度独特氧空位以提供稳定的催化活性，同时具有成本低、合成简单、可大规模生产等优点以有利于实际应用的纳米酶具有重要意义。
L-半胱氨酸(L-Cysteine,L-Cys)是一种重要的含巯基(-SH)的α-氨基酸。L-Cys在生物系统调节多种生理和病理过程中起着至关重要的作用，它的抗氧化特性维持了细胞环境中的氧化还原平衡，提高了生物体内的解毒水平，维持了生物体正常的消化系统。生命体内L-Cys含量的高低可以为一些疾病的诊断提供科学依据。异常含量的L-Cys可能会导致很多疾病，例如生长缓慢、心血管疾病、脱发等。因此，L-Cys定量检测具有重要意义。目前，L-Cys的检测方法主要有高效液相色谱法、荧光光谱法、电化学法等。然而这些方法存在一些不足，比如仪器昂贵、检测成本较高、操作繁琐、耗时等，限制了实际检测的进一步应用。因此，开发一种成本低、操作简便、准确性高、速度快、选择性好的L-Cys检测方法具有重大意义。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供一种具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，通过合理的组分、配比及工艺的结合改进，使该材料具备其表面高浓度的氧空位可有效活化吸附氧为活性氧，从而引发特定的酶促反应。并基于a-BiVO4的类氧化酶催化机制，开发一种成本低、操作简便、准确性高、选择性好的L-Cys检测方法，以解决现有技术如仪器昂贵、检测成本较高、操作繁琐、耗时等，限制实际检测的规模化应用的问题。
(二)技术方案
为实现上述其表面高浓度的氧空位可有效活化吸附氧为活性氧，从而引发特定的酶促反应，并基于a-BiVO4的类氧化酶催化机制，开发一种成本低、操作简便、准确性高、选择性好的L-Cys检测方法，本发明提供如下技术方案：
一种具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，包括以下步骤：
S1、非晶态无定形钒酸铋(a-BiVO4)的溶液制备
取一个30mL烧杯，先往烧杯中加入10mL DMF，再加入0.2426g(0.5mmol/lol)五水合硝酸铋，在常温下搅拌2小时，配制成A液；另取一个30mL烧杯，先往烧杯中加入10mL DMF，再加入0.0585g(0.5mmol/lol)偏钒酸铵，在常温下搅拌2小时，配制成B液；然后把A液和B液混合，在室温下继续搅拌反应10小时。
S2、洗涤固体
将步骤S1中，所得溶液以8000r离心3min，收集固体，然后洗涤固体，即加水洗涤3次，再加乙醇洗涤1次。
S3、固体非晶态无定形钒酸铋(a-BiVO4)制备
最后，把步骤S2中，洗涤干净的固体放置于60℃的烘箱中烘干，得到淡黄色固体—a-BiVO4；
S4、类氧化酶活性的无定形钒酸铋检测
在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入c-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)；
S5、得出结果
将步骤S3中的淡黄色固体—a-BiVO4放入步骤S4中的溶液中，当溶液变成蓝色，即可得出淡黄色固体—a-BiVO4为类氧化酶活性的无定形钒酸铋。
优选的，所述步骤S1中，DMF为N，N-二甲基甲酰胺。
优选的，所述步骤S4中，另一种检测方式为基于a-BiVO4的类氧化酶活性建立L-Cys比色传感器。
优选的，所述L-Cys的检测为在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入a-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)；
然后测试体系在652nm处的吸光度(A0)；
再加入不同浓度的L-Cys，反应3min后，测试体系在652nm处的吸光度(A1)。
优选的，所述L-Cys的检测中具有选择性和干扰性的检测两种方式。
优选的，所述选择性和干扰性的检测为在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入a-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)，然后测试体系在652nm处的吸光度(A0)。
优选的，所述在a-BiVO4、TMB混合溶液中分别加入不同的氨基酸(80μM)，反应3min后，测试体系在652nm处的吸光度(A1)。
优选的，所述在a-BiVO4、TMB和氨基酸混合溶液中再加入80μM的L-Cys，反应3min后，测试体系在652nm处的吸光度(A2)。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供的具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，具备以下有益效果：
1、该具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，通过简单的溶液共沉淀法合成其表面具有高浓度氧空位的非晶态无定形钒酸铋(a-BiVO4)，首次证明了钒酸铋纳米材料具有类氧化酶活性。
2、该具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，通过其表面高浓度的氧空位可有效活化吸附氧为活性氧，从而引发特定的酶促反应。并基于a-BiVO4的类氧化酶催化机制，开发一种成本低、操作简便、准确性高、选择性好的L-Cys检测方法。
3、该具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，通过传感器对L-Cys具有良好的检测性能，检出限为0.569μM，同时具有操作简便、准确性高、选择性高的优点，可以从有多中竞争性氨基酸存在的复杂体系中定量分析检测L-Cys，同时建立了一种针对L-Cys定量检测的比色检测传感方法，丰富和发展了分析科学方法与技术。
附图说明
图1为本发明实施例制备的a-BiVO4的SEM；
图2为本发明实施例制备的a-BiVO4的TEM；
图3为本发明实施例制备的a-BiVO4的HRTEM；
图4为本发明实施例制备的a-BiVO4的XRD粉末衍射图；
图5为本发明实施例制备的a-BiVO4的拉曼光谱图；
图6为本发明实施例制备的a-BiVO4的类氧化酶活性；
图7为本发明实施例制备的a-BiVO4和a-BiVO4+TMB的Bi 4f高分辨光谱图；
图8为本发明实施例制备的a-BiVO4和a-BiVO4+TMB的V 2p高分辨光谱图；
图9为本发明实施例制备的a-BiVO4和a-BiVO4+TMB的O1s高分辨光谱图；
图10为本发明实施例制备的a-BiVO4的氧空位EPR波谱；
图11为本发明实施例制备的a-BiVO4+TMB体系的超氧自由基EPR波谱；
图12为本发明实施例制备的a-BiVO4+TMB体系随L-Cys-浓度变化的紫外吸收变化曲线；
图13为本发明实施例制备的L-Cys的浓度校准曲线；
图14为本发明实施例制备的19种氨基酸对a-BiVO4+TMB体系的影响；
图15为本发明实施例制备的18种氨基酸对a-BiVO4+TMB+L-Cys体系的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
本发明实施例提供的具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，包括以下步骤：
S1、非晶态无定形钒酸铋(a-BiVO4)的溶液制备
取一个30mL烧杯，先往烧杯中加入10mL DMF，再加入0.2426g(0.5mmol/lol)五水合硝酸铋，在常温下搅拌2小时，配制成A液；另取一个30mL烧杯，先往烧杯中加入10mL DMF，再加入0.0585g(0.5mmol/lol)偏钒酸铵，在常温下搅拌2小时，配制成B液；然后把A液和B液混合，在室温下继续搅拌反应10小时。
S2、洗涤固体
将步骤S1中，所得溶液以8000r离心3min，收集固体，然后洗涤固体，即加水洗涤3次，再加乙醇洗涤1次。
S3、固体非晶态无定形钒酸铋(a-BiVO4)制备
最后，把步骤S2中，洗涤干净的固体放置于60℃的烘箱中烘干，得到淡黄色固体—a-BiVO4；
从图1示的扫描电子显微镜(SEM)照片可以看出，钒酸铋样品呈表面光滑的不规则的颗粒状形貌，颗粒的尺寸大小约为10-50nm。TEM图像2证实a-BiVO4是表面光滑的不规则的纳米颗粒，与SEM结果相符合。HRTEM图像3示，除了在特定位置观察到(-121)平面的少量晶格条纹外，a-BiVO4的HRTEM信号相当弱。综上所述，我们所制备的a-BiVO4是结晶性低的无定形的钒酸铋纳米颗粒。
a-BiVO4的X射线粉末衍射(XRD)结果如图4所示，a-BiVO4的XRD谱图与JCPDS卡编号为14-0688的标准衍射谱图相一致，表明a-BiVO4是以单斜相存在的。从图中可以看出，a-BiVO4只在衍射角2θ为28.8°处有一个明显的宽峰，与(-121)晶面相匹配，而其他峰很弱，说明a-BiVO4具有较低的结晶度或无定形特征。
a-BiVO4的拉曼光谱图如图5所示，在123.1cm-1、209.6cm-1、334.4cm-1和819.2cm-1处出现的四个峰，分别是在a-BiVO4中的VO4 3-和V-O典型的非对称弯曲振动和对称拉伸振动。a-BiVO4的信号明显较弱且较宽，说明a-BiVO4具有较低的结晶度或无定形特征。
S4、类氧化酶活性的无定形钒酸铋检测
在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入c-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)；
①溶液的配制
TMB溶液(15mmol/l)：称取7.2mg TMB粉末溶于2mL无水乙醇中，在常温下完全溶解后，将溶液放置于4℃的冰箱中避光保存备用。
a-BiVO4溶液(3mg/mL)：称取6mg钒酸铋粉末分散于2mL H2O中，在常温下超声30min，分散均匀后备用。(在每次实验中，需要摇晃均匀再取用。)
②a-BiVO4类氧化酶活性的研究
在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入c-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)。再通过紫外可见分光光度计进行紫外吸收光谱检测。
为了对a-BiVO4的类氧化酶活性进行研究，我们以TMB为显色剂，在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中进行了相关测试。如图6所示，底物TMB和催化剂a-BiVO4在可见光范围没有任何吸收。当a-BiVO4和TMB混合后，无色TMB溶液变成蓝色，a-BiVO4+TMB体系在紫外可见光吸收光谱中出现两个在370nm和652nm处明显的吸收峰，对应TMB单电子氧化过程；在450nm处出现一个弱峰，对应TMB双电子氧化过程。结果表明，TMB可在a-BiVO4的催化下转化为氧化态TMB(oxTMB)。证明所制备的a-BiVO4具有类氧化酶活性。
从图7、8和9中可以看出，在与TMB反应后，a-BiVO4的Bi 4f和V 2p的结合能没有明显变化。反应前在516.59eV和524.14eV处可观察到的V5+的V 2p3/2和V 2p1/2特征峰，反应后，这两个峰仍然处于相似的位置。XPS结果表明，V5+不是TMB氧化的来源。但是，a-BiVO4中531.85eV处的氧空位(即化学吸附氧)信号在反应后消失了。这一重要信息表明，高浓度的氧空位可能是a-BiVO4类氧化酶活性良好的原因之一。
S5、得出结果
将步骤S3中的淡黄色固体—a-BiVO4放入步骤S4中的溶液中，当溶液变成蓝色，即可得出淡黄色固体—a-BiVO4为类氧化酶活性的无定形钒酸铋。
利用电子顺磁共振(EPR)技术研究a-BiVO4中未配对电子。如图10所示，在g值为2.004时，a-BiVO4表现出强烈的EPR信号，这可以归因于氧空位中捕获的电子，表明a-BiVO4的结构中存在氧空位。在优化的实验条件下，对DMPO作为自由基捕获剂的反应体系进行了EPR测量。如图11所示，只检测到超氧自由基(O2 ·—)的特征信号，表明这个体系中存在O2 ·—。证明在钒酸铋表面高浓度的氧空位可有效活化吸附氧为活性氧(O2 ·—)。由于催化实验是在没有光照的情况下进行的，因此在催化体系中起作用的ROS不太可能是样品中光产生的空穴。综上所述，说明是O2 ·—在钒酸铋催化TMB氧化反应中起主要作用。
步骤S1中，DMF为N，N-二甲基甲酰胺。
所述步骤S4中，另一种检测方式为基于a-BiVO4的类氧化酶活性建立L-Cys比色传感器。
所述L-Cys的检测为在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入a-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)；
然后测试体系在652nm处的吸光度(A0)；
再加入不同浓度的L-Cys，反应3min后，测试体系在652nm处的吸光度(A1)。
L-Cys的检测中具有选择性和干扰性的检测两种方式。
选择性和干扰性的检测为在NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)中，先加入a-BiVO4溶液(40μg/mL)，摇匀后，再加入TMB溶液(0.15mmol/l)，混合均匀后置于室温下反应25min(反应体系总体积为3mL)，然后测试体系在652nm处的吸光度(A0)。
在a-BiVO4、TMB混合溶液中分别加入不同的氨基酸(80μM)，反应3min后，测试体系在652nm处的吸光度(A1)。
在a-BiVO4、TMB和氨基酸混合溶液中再加入80μM的L-Cys，反应3min后，测试体系在652nm处的吸光度(A2)。
基于L-Cy的抑制模式，利用a-BiVO4+TMB体系开发了L-Cys检测传感器平台。从图13和13中可以看出，随着L-Cys浓度的增加(2-80μM)，a-BiVO4+TMB溶液的蓝色逐渐褪色，在紫外可见光吸收光谱中，在652nm处的吸光度降低。当L-Cys的浓度为2-10μM时，ΔA(A0-A1)与C呈线性关系，其中A0和A1表示添加L-Cys前后a-BiVO4+TMB溶液的吸光度，C是加入溶液的L-Cys的浓度。在S/N＝3的条件下，其检出限(LOD)为0.569μM。(LOD＝3σ/k，其中σ是空白值的标准偏差，k为标准曲线的斜率)。
为了进一步评价该传感器的选择性，研究了该检测系统对其他18种竞争性氨基酸的比色响应。如图14所示，与L-Cys相比，这些干扰对传感系统的响应非常有限。考虑到真实样品中几种氨基酸存在共生的可能性，还测试了每种氨基酸与L-Cys的混合溶液。如图15所示，实验结果表明，这18种氨基酸的存在并不影响L-Cys的检测，表明该传感器具有良好的选择性。
本发明上述实施例提供的具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，通过简单的溶液共沉淀法合成其表面具有高浓度氧空位的非晶态无定形钒酸铋(a-BiVO4)，首次证明了钒酸铋纳米材料具有类氧化酶活性，通过其表面高浓度的氧空位可有效活化吸附氧为活性氧，从而引发特定的酶促反应。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、非晶态无定形钒酸铋a-BiVO4的溶液制备
取一个30 mL烧杯，先往烧杯中加入10 mL DMF，再加入0.2426 g、0.5 mmol/L五水合硝酸铋，在常温下搅拌2小时，配制成A液；另取一个30 mL烧杯，先往烧杯中加入10 mL DMF，再加入0.0585 g、0.5 mmol/l偏钒酸铵，在常温下搅拌2小时，配制成B液；然后把A液和B液混合，在室温下继续搅拌反应10小时；
S2、洗涤固体
将步骤S1中，所得溶液以8000 r离心3 min，收集固体，然后洗涤固体，即加水洗涤3次，再加乙醇洗涤1次；
S3、固体非晶态无定形钒酸铋a-BiVO4制备
最后，把步骤S2中，洗涤干净的固体放置于60 ℃的烘箱中烘干，得到淡黄色固体—a-BiVO4；
S4、类氧化酶活性的无定形钒酸铋检测
在pH=4的NaAc-HAc缓冲液中，先加入40 μg/mL的 c-BiVO4溶液，摇匀后，再加入0.15mmol/l 的TMB溶液，混合均匀后置于室温下反应25 min，反应体系总体积为3 mL；
L-Cys的检测为在pH=4的NaAc-HAc缓冲液中，先加入a-BiVO4溶液40 μg/mL，摇匀后，再加入TMB溶液0.15 mmol/l，混合均匀后置于室温下反应25 min，此时反应体系总体积为3mL；
然后测试体系在652 nm处的吸光度A0；
再加入不同浓度的L-Cys，反应3 min后，测试体系在652 nm处的吸光度A1；
L-Cys的检测中具有选择性和干扰性的检测两种方式；
选择性和干扰性的检测为在pH=4的NaAc-HAc缓冲液中，先加入a-BiVO4溶液40 μg/mL，摇匀后，再加入TMB溶液0.15 mmol/l，混合均匀后置于室温下反应25 min，反应体系总体积为3 mL，然后测试体系在652 nm处的吸光度A0’；
在a-BiVO4、TMB混合溶液中分别加入80 μM的不同的氨基酸，反应3 min后，测试体系在652 nm处的吸光度A1’；
在a-BiVO4、TMB和氨基酸混合溶液中再加入80 μM的L-Cys，反应3 min后，测试体系在652 nm处的吸光度A2’；
S5、得出结果
将步骤S3中的淡黄色固体—a-BiVO4放入步骤S4中的溶液中，当溶液变成蓝色，即可得出淡黄色固体—a-BiVO4为类氧化酶活性的无定形钒酸铋。
2.根据权利要求1所述的具有类氧化酶活性的无定形钒酸铋的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，另一种类氧化酶活性的无定形钒酸铋检测方式为基于a-BiVO4的类氧化酶活性建立L-Cys比色传感器。
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