CN109975287A - 一种用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用Au@NH2‑MIL‑125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱氨酸的方法，属于生物分析领域。通过浸渍、还原的方法将Au纳米粒子分散到NH2‑MIL‑125上，制备得到Au@NH2‑MIL‑125纳米酶催化剂通过TMB显色反应来检测双氧水和半胱氨酸。本发明使用的NH2‑MIL‑125材料具有多级孔结构和大比表面积，对Au纳米粒子具有很好的稳定和分散作用，用来作为TMB显色反应灵敏度高可以达到纳摩尔级别。所述Au@NH2‑MIL‑125纳米酶催化剂中，提供的Au@NH2‑MIL‑125纳米酶催化剂颗粒小，粒径为200‑500nm圆形片状或多面体结构，有利于增加催化剂的活性位点，Au纳米粒子和NH2‑MIL‑125具有协同催化作用，对多种底物表现出高效广谱的催化作用；本发明中所述用Au@NH2‑MIL‑125作为纳米酶催化剂来检测双氧水和半胱氨酸的方法简单，经济可行，精度高。

Description

一种用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱 氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱氨酸的方法。
背景技术
作为必需氨基酸，半胱氨酸(Cys)在一些生理过程中起着重要的生物学作用，包括蛋白质合成，解毒和代谢然而，它也是一种潜在的神经毒素，是各种医学病症的生物标志物。Cys缺乏可能导致许多综合征，如水肿，嗜睡，肝损伤，生长缓慢和皮肤病变。因此，对于Cys快速的检测，简便且经济有效的传感器是一个重要目标。
本领域目前已经开发了用于Cys分析的各种传感器系统。然而，这些系统中的大多数在灵敏度，选择性或复杂样品制备的需要以及昂贵的仪器方面具有局限性。为了克服这些缺点，我们尝试了基于Au@NH2-MIL-125的比色传感器，用法简单，快速检测Cys这些方法具有一些优点，例如用肉眼就很容易辨别。
过氧化氢(H2O2)被认为是人类生活中不可或缺的一部分。从工业的角度来看，它可以被认为是一种“环保型”氧化剂，因为氧和水是唯一的副产物。过氧化氢的世界年需求量预计将超过430万吨，据报道，中国目前是世界上工业过氧化氢最大的市场，估计到2026年仍将是最大的市场。除此之外，在Ca2+和ATP，H2O2的一行中在转录非依赖性信号分子中作为信使分子起着至关重要的作用。一些细胞特性如细胞形状改变，增殖的起始和免疫细胞的募集需要过氧化氢的扩散穿过细胞。此外，H2O2是在一个关键代谢物的氧化应激与生物分子的过程的一些有害影响，包括膜损伤，基因突变，致癌作用，老化和神经疾病。摄入3％H2O2后产生的氧气溶液可以透过胃进入门静脉系统。在这种情况下，报告的三个主要后果是门静脉栓塞，出血性胃炎和死亡。这些重要的复杂连接使H2O2成为临床和生物学研究的必要分子。虽然H2O2可以通过分光光度法或色谱方法似来测得，但是繁琐，而且需要复杂的分析和昂贵生物仪器。第二，相对于新的多功能分析技术，如电化学方法提供高灵敏度，准确度和选择性，具有相对低成本的设备，分光光度或色谱方法不能检测分析物在体内。H2O2可以在普通固体电极上直接氧化或还原。然而，慢电极动力学和高过电位是限制电化学方法的分析应用的两个重要因素。因此，目前的研究主要集中在应用修饰电极以降低过电位和增加电子转移动力学。
发明内容
本发明提供一种用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱氨酸的方法。
本发明的发明构思是：通过在具有独特性质的固体材料作为载体上负载高度分散的Au纳米粒子，载体不仅能用来稳定纳米金，同时还能与纳米金产生协同效应，提高复合材料的整体催化效果。本发明采用的载体NH2-MIL-125是一种金属有机骨架材料，具有多孔性、高的比表面积和生物相容性。同时NH2-MIL-125具有一定的孔道大小，从而可以实现金属纳米粒子Au的有限生长，从而产生单分散的金属Au纳米颗粒。
通过用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂来催化双氧水来氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)测定在652nm的吸光度值来做出标注曲线测定未知双氧水的含量。由于半胱氨酸能够抑制Au@NH2-MIL-125的活性，在上述的基础上加入半胱氨酸来做出标准曲线，来检测未知的半胱氨酸溶液。
本发明制备的Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂，Au纳米粒子高度分散到NH2-MIL-125上，Au纳米粒子大小为5-50nm，质量含量为0.1-20％。所采用的NH2-MIL-125形貌为圆形片状或者八面体，尺寸在200-500nm。
本发明具体采用如下技术方案，一种用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
S1.NH2-MIL-125的合成
将DMF和甲醇混合，然后在搅拌10-20分钟后加入2-氨基对苯二甲酸，然后加入钛酸四丁酯，2-氨基对苯二甲酸与钛酸四丁酯摩尔比为：4:1-5:1，再搅拌30分钟，将前体溶液转移到特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在电炉中在150-160℃下加热72小时；反应后，通过离心收集产物并用甲醇洗涤数次，然后将样品在105℃下干燥过夜，为了实现样品活化，将合成后的固体在空气中在200℃下加热12小时；
S2.Au@NH2-MIL-125的合成
首先，在超声波作用下，将5mgNH2-MIL-125溶解在5.76ml水中。其次，加入120μLHAuCl4(1wt％)，并在超声下保持5分钟；最后，将360μL硼氢化钠或柠檬酸三钠快速加入溶液中并超声处理20分钟，直到溶液的颜色变成稳定的深紫色，离心收集产物，用甲醇和水洗涤数次，干燥；
S3.检测双氧水或L-半胱氨酸
比色检测双氧水：
取20μLTMB(15mmol)和20μLAu@NH2-MIL-125(3mg/mL)加入到3mL乙酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)。将不同浓度双氧水加入上述缓冲溶液中，一段时间后检测在651nm处的吸光度变化来做出H2O2浓度依赖性标准曲线，通过标准曲线对待测物中双氧水进行定量检测。
比色检测L-半胱氨酸：
将TMB溶于15mM DMSO中配制TMB溶液，取20μLTMB溶液、20μL Au@NH2-MIL-125(3mg/mL)、20μLH2O2(30wt％)加入到3mL醋酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)。将不同浓度的L-半胱氨酸加入到上述缓冲液中，反应一段时间后，通过UV-可见吸收光谱检测651nm处的吸光度变化来做出L-半胱氨酸依赖性标准曲线。通过标准曲线对待测物中L-半胱氨酸进行定量检测。
所述步骤S1中DMF和甲醇混合超声混合，2-氨基对苯二甲酸，钛酸四丁酯超声溶解成澄清溶液。DMF和甲醇混合溶液中，DMF和甲醇混合体积的比例为9:1。
所述步骤S2中，硼氢化钠或柠檬酸三钠于三秒内全部加入至溶液中并超声处理20分钟。
作为本发明一个优选的实施例，上述检测方法中Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂的制备方法如下：
S1.将2-氨基对苯二甲酸(0.543克，3mmol)溶于含有DMF(9ml)和MeOH(1ml)中的溶液中。然后将钛酸四丁酯Ti(OC4H9)4(0.26ml，0.75mmol)加入该溶液中。将上述混合物在室温下超声处理10分钟，然后转移到50mlTeflon衬里中并在150℃下加热72小时。最后，通过离心收集所获得的黄色粉末，分别用DMF和MeOH洗涤，并在60℃下真空干燥；
S2.通过超声方法合成Au@NH2-MIL-125。首先，在超声波作用下，将5mg NH2-MIL-125溶解在5.76ml水中。其次，加入120μL HAuCl4(1wt％)，并在超声下保持5分钟。最后，将360μL柠檬酸三钠快速加入溶液中并超声处理20分钟，直到溶液的颜色变成稳定的深紫色。离心收集产物，用甲醇和水洗涤数次。
本发明将Au纳米粒子分散到NH2-MIL-125纳米粒子上，利用金属有机骨架材料NH2-MIL-125的多级孔结构和纳米孔道的限阈效应限制Au纳米粒子的长大和团聚，载体NH2-MIL-125的多孔性有利于Au+离子的扩散；而且NH2-MIL-125载体对Au纳米粒子具有更好的稳定作用，从而制备得到单分散的Au纳米粒子，进一步获得高效的Au@NH2-MIL-125的复合纳米酶催化剂。用来作为TMB显色反应灵敏度高可以达到纳摩尔级别。
与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂制备方法，合成条件温和，工艺方法简单，经济可行。
2、本发明提供的Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂中，Au纳米粒子高度分散与NH2-MIL-125具有协同催化效果，有利于制备高效广谱的纳米酶催化剂。
3、本发明提供的Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂颗粒小，粒径为200-500nm圆形片状或多面体结构，有利于增加催化剂的活性位点，Au纳米粒子和NH2-MIL-125具有协同催化作用，对多种底物表现出高效广谱的催化作用。
4.通过用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂来催化双氧水来氧化TMB测定在651-652nm的吸光度值来做出标注曲线测定未知双氧水或L-半胱氨酸的含量检测限低。
附图说明
图1纳米酶催化剂Au@NH2-MIL-125的SEM(A)、TEM图(B)；
图2纳米酶催化剂Au@NH2-MIL-125的催化效果，检测双氧水和检测限；
图3纳米酶催化剂Au@NH2-MIL-125的催化效果，检测L-半胱氨酸和检测限；
图4纳米酶催化剂Au@NH2-MIL-125的催化TMB氧化效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细介绍，但不限制本发明的保护范围。
实施例1采用浸渍-还原法制备Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂
S1.将2-氨基对苯二甲酸(0.543克，3mmol)溶于含有DMF(9ml)和MeOH(1ml)中的溶液中。然后将钛酸四丁酯Ti(OC4H9)4(0.26ml，0.75mmol)加入该溶液中。将上述混合物在室温下超声处理10分钟，然后转移到50mlTeflon衬里中并在150℃下加热72小时。最后，通过离心收集所获得的黄色粉末，分别用DMF和MeOH洗涤，并在60℃下真空干燥；
S2.通过超声方法合成Au@NH2-MIL-125。首先，在超声波作用下，将5mg NH2-MIL-125溶解在5.76ml水中。其次，浓度1wt％的120μLHAuCl4，并在超声下保持5分钟。最后，将360μL柠檬酸三钠快速加入溶液中并超声处理20分钟，直到溶液的颜色变成稳定的深紫色。离心收集产物，用甲醇和水洗涤数次。
实施例2Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂检测双氧水
采用比色法评价实施例1中制备的Au/NH2-MIL-125对检测双氧水的效果，测试结果如图2所示。
取20μLTMB(15mmol)和20μLAu@NH2-MIL-125(3mg/mL)加入到3mL乙酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)。将不同浓度双氧水加入上述缓冲溶液中，一段时间后溶液颜色为淡蓝色或者蓝色，检测在651nm处的吸光度变化来做出H2O2浓度依赖性标准曲线，通过标准曲线对待测物中双氧水进行定量检测。
实施例3Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂检测L-半胱氨酸
比色检测L-半胱氨酸：
将TMB溶于15mM DMSO中配制TMB溶液，取20μLTMB溶液、20μL Au@NH2-MIL-125(3mg/mL)、20μLH2O2(30wt％)加入到3mL醋酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)。将不同浓度的L-半胱氨酸加入到上述缓冲液中，反应一段时间后，不同浓度的半胱氨酸由高到低，由无色到浅蓝色再到深蓝色。通过UV-可见吸收光谱检测652nm处的吸光度变化来做出L-半胱氨酸依赖性标准曲线。通过标准曲线对待测物中L-半胱氨酸进行定量检测。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用Au@NH2-MIL-125作为纳米酶催化剂检测双氧水和半胱氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.NH2-MIL-125的合成
将DMF和甲醇混合，然后在搅拌10-20分钟后依次加入2-氨基对苯二甲酸、钛酸四丁酯，2-氨基对苯二甲酸与钛酸四丁酯摩尔比为：4:1-5:1，再搅拌30分钟，将前体溶液转移到特氟隆衬里的不锈钢高压釜中，并在电炉中在150℃-160℃下加热72小时；反应后，通过离心收集产物并用甲醇洗涤数次，然后将样品在105℃下干燥过夜；为了实现样品活化，将合成后的固体在空气中在200℃下加热12小时；
S2.Au@NH2-MIL-125的合成
首先，在超声波作用下，将5mgNH2-MIL-125溶解在5.76ml水中；其次，加入浓度1wt％的120μL HAuCl4，并在超声下保持5分钟；最后，将360μL硼氢化钠或柠檬酸三钠快速加入溶液中并超声处理20分钟，直到溶液的颜色变成稳定的深紫色，离心收集产物，用甲醇和水洗涤数次，干燥；
S3.检测双氧水或L-半胱氨酸
比色检测双氧水：
取20μLTMB(15mmol)和20μL Au@NH2-MIL-125(3mg/mL)加入到3mL乙酸盐缓冲溶液pH＝4.0；将不同浓度双氧水加入上述缓冲溶液中，一段时间后检测在651nm处的吸光度变化来做出H2O2浓度依赖性标准曲线，通过标准曲线对待测物中双氧水进行定量检测；
比色检测L-半胱氨酸：
将TMB溶于15mM DMSO中配制TMB溶液，取20μLTMB溶液、20μL Au@NH2-MIL-125(3mg/mL)、20μLH2O2(30wt％)加入到3mL醋酸盐缓冲溶液pH＝4.0；将不同浓度的L-半胱氨酸加入到上述缓冲液中，反应一段时间后，通过UV-可见吸收光谱检测651nm处的吸光度变化来做出L-半胱氨酸依赖性标准曲线，通过标准曲线对待测物中L-半胱氨酸进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中DMF和甲醇混合超声混合，2-氨基对苯二甲酸，钛酸四丁酯超声溶解成澄清溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，DMF和甲醇混合溶液中，DMF和甲醇混合体积的比例为9:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于检测双氧水和半胱氨酸的Au@NH2-MIL-125纳米酶催化剂的制备方法如下：
S1.将3mmol2-氨基对苯二甲酸溶于DMF和MeOH混合溶液中，该混合溶液DMF为9ml，MeOH为1ml；然后将0.75mmol钛酸四丁酯加入该溶液中；将上述混合物在室温下超声处理10分钟，然后转移到50ml Teflon衬里中并在150℃下加热72小时；最后，通过离心收集所获得的黄色粉末，分别用DMF和MeOH洗涤，并在60℃下真空干燥；
S2.通过超声方法合成Au@NH2-MIL-125
首先，在超声波作用下，将5mgNH2-MIL-125溶解在5.76ml水中，其次，加入浓度1wt％的120μL HAuCl4，并在超声下保持5分钟；最后，将360μL柠檬酸三钠快速加入溶液中并超声处理20分钟，直到溶液的颜色变成稳定的深紫色，离心收集产物，用甲醇和水洗涤数次。
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