CN111398395B - 一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法 - Google Patents

一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器的制备方法，包括以下步骤：采用一锅溶剂热法制备贵金属‑过渡金属硫族化合物纳米材料，体外合成dsDNA制得信号分子b/dsDNA/贵金属‑过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极，以信号分子b/dsDNA/贵金属‑过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极为工作电极，银|氯化银电极为参比电极，铂丝电极为对电极，通过信号分子a和信号分子b的响应信号变化指示样品中呕吐毒素的含量，得到了用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器。同其它用于呕吐毒素含量检测的电化学传感器相比，所制备的新型双信号适体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。

Description

一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法，尤其涉及一种基于贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料的金电极制备方法。
背景技术
民以食为天，食以安为先，每年世界上约有四分之一的农作物在储存和流通过程中，因不适当的卫生习惯、对谷物保护的不足等因素，导致谷物收获后易被真菌毒素污染。呕吐毒素，又称呕吐毒素，广泛存在于黑麦、小麦、大麦、玉米等谷物中，是谷物粮食中最常见的真菌毒素之一。呕吐毒素耐热，可以在储存和加工过程中生存，甚至可以保留在煮熟的食物中，因此人们可以通过摄入受污染的食物直接接触呕吐毒素，也可能通过呼吸道，皮肤和粘膜接触而暴露于呕吐毒素。呕吐毒素具有很强的细胞毒性和免疫毒性，可与核糖体结合抑制蛋白质的合成，破坏正常的细胞功能，引起细胞免疫功能的损伤，导致中毒者出现厌食、呕吐等症状，因具有潜在致癌性而被欧盟划分为三类致癌物。考虑到呕吐毒素的这些危害，全世界都规定了呕吐毒素的限量，例如，欧盟将加工谷物和婴儿食品中呕吐毒素的最大残留限量定为200 µg/kg，未加工谷物为1750 µg/kg，面包，饼干和谷物零食为500 µg/kg。因此，谷物中呕吐毒素的检测对食品安全、人体健康具有重要意义。目前检测谷物和食品中呕吐毒素的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-串联质谱、气相色谱等，这些方法虽然具有很高的灵敏度和准确度、且可以一次测定多种成分，但需要大型昂贵的仪器设备及复杂的样品纯化制备程序，分析程序复杂，检测周期长，需要专业的技术人员，不适合基层单位的推广和使用，因此，发展检测速度快、仪器设备简单易操作、成本低、适合现场检测的方法是检测谷物中呕吐毒素含量的有效途径之一。电化学传感器操作简单、响应速度快、成本低、仪器设备简单便携、对操作人员技术要求不高，因而被广泛用于环境监测，食品检测，医学监控等方面，制备灵敏度高、性能优异的电化学传感器是当前研究的热点。为提高检测性能，避免假“阳性”等问题，常引入核酸适体技术，将核酸适体用于识别元件并与各种电化学转换器相结合构建核酸适体传感器，但在实际应用中，基于单一识别元件核酸适体的电化学传感器仍然存在灵敏度、稳定性和线性响应等指标不够理想的问题，因此利用纳米材料作为信号放大策略以进一步提高传感器的响应灵敏度，因此设计合成贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料成为制备高效电化学生物传感器的关键，目前设计合成贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料作为电极修饰材料，同时构建适体和互补链连接的纳米材料及信号分子的双信号标签用于呕吐毒素的检测尚未见报道。
发明内容
发明本发明涉及一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法。
一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法，其步骤如下：
所述贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料的制备：采用一锅溶剂热法制备过渡金属硫族化合物纳米材料，将0.5~0.7 g过渡金属粉末和0.2~0.4 g硼氢化钠溶于60~70 mL分散剂中搅拌0.5~1.5 h，加入0.9~1.0 g六水合过渡金属二氯化物继续搅拌0.5~1.5h，得到均匀分散的黑色溶液；将制备好的前体溶液放入聚四氟乙烯内衬高压釜中，在150~170℃的烘箱中保温20~24 h，在50~60℃下处理10~12 h即得过渡金属硫族化合物纳米材料；采用氧化还原法在过渡金属硫族化合物纳米材料上原位生成贵金属纳米粒子，将10~15mg制备好的过渡金属硫族化合物超声分散在15~20 mL还原剂中，将3~5 mL 1~3 mg/mL 贵金属溶液加入混合物中，在70~90℃下孵育12~24 h，洗涤后在70~90℃下干燥至恒重；
所述dsDNA的制备：将10~20 μL 1~5 μM适体链DNA1与10~20 μL 1~5 μM 3'端修饰有信号分子a 5'端修饰有巯基的互补链a-DNA2-SH在30~40℃下混合12~24 h，即得到dsDNA；
所述信号分子b/dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5~10min，然后将金电极浸入强氧化溶液中20~60 min，用蒸馏水冲洗干燥，取1~10 mg上述制备的贵金属-过渡金属硫族化合物分散至1~5 mL蒸馏水中，取1~7 μL上述溶液滴加至金电极表面，于红外灯下干燥6~10 min，移取1~7 μL上述dsDNA滴加至电极表面，在30~40℃孵育1~2 h后，用pH为7.2~7.6的缓冲液洗涤，移取3~7 μL信号分子b滴加至dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极表面，在30~40℃孵育1~2 h，移取5~10 μL不同浓度呕吐毒素和1~5 U核酸外切酶的混合物滴加至电极表面于30~40℃孵育1~2 h，得到信号分子b/dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极；
所述电化学传感器是以信号分子b/dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极为工作电极，以银|氯化银电极为参比电极，铂丝电极为对电极，通过信号分子a和信号分子b的响应信号变化指示样品中呕吐毒素的含量，得到用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器。
所述的贵金属为金、铑、钯、铂中的一种或多种。
所述的过渡金属硫族化合物为二硫化钼、二硫化钨、二硒化钼、二硒化镍、二硒化钨中的一种或多种。
所述的分散剂为乙二胺、N，N-二甲基甲酰胺、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或多种。
所述的过渡金属为钼、钨、镍中的一种或多种。
所述的还原剂为含0.5 wt%壳聚糖乙酸溶液（1%V/V乙酸）溶液、抗坏血酸、柠檬酸盐、水合肼中的一种或多种。
所述的贵金属溶液为氯铂酸、氯金酸、醋酸钯、硝酸铑中的一种或多种。
所述的信号分子a为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种。
所述的信号分子b为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种。
所述的强氧化溶液为过氧化氢、浓硫酸和浓盐酸溶液中的两种混合物，体积比为1:1~3:1。
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液中的一种或多种。
所述的核酸外切酶为Recjf外切酶、EXO Ⅲ外切酶、T7 EXO外切酶中的一种或多种。
本发明涉及的传感器中，以信号分子b/dsDNA/金-二硒化镍纳米材料/金电极为双信号适体传感器的工作电极，同其它用于呕吐毒素含量检测的电化学传感器相比，所制备的新型双信号适体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述：
实施例1
具体步骤如下：
（1）首先采用一锅溶剂热法制备二硒化镍纳米材料，将0.5 g硒粉和0.2 g硼氢化钠溶于60 mL的N，N-二甲基甲酰胺溶剂中搅拌0.5 h，加入0.9 g 六水合二氯化镍搅拌0.5h，得到均匀分散的黑色溶液；将制备好的前体溶液放入聚四氟乙烯内衬高压釜中，在150℃的烘箱中保温20 h，在60℃下处理10 h即得二硒化镍纳米材料；采用氧化还原法在二硒化镍纳米材料上原位生成金纳米粒子，首先，将10 mg制备好的二硒化镍纳米材料超声分散在15 mL含0.5 wt%壳聚糖乙酸溶液（1%V/V乙酸）中，将3 mL 1 mg/mL 四氯金酸溶液加入混合物中，在70℃下孵育12 h，洗涤后在70℃下干燥至恒重；
（2）将10 μL 1 μM适体链DNA1与10 μL 1 μM 3'端修饰有二茂铁5'端修饰有巯基的互补链Fc-DNA2-SH在37℃下混合12 h即得dsDNA；
（3）亚甲基蓝/dsDNA/金-二硒化镍纳米材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5 min，然后将金电极浸入体积比7:3的浓硫酸与过氧化氢溶液中20 min，用蒸馏水冲洗干燥，取5 mg上述制备的金-二硒化镍纳米材料分散至5 mL蒸馏水中，取7 μL上述制备的金-二硒化镍纳米材料滴加至金电极表面，于红外灯下干燥10 min，移取7 μL上述dsDNA滴加至电极表面，在30℃孵育1h后，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液洗涤，移取3 μL亚甲基蓝滴加至dsDNA/金-二硒化镍纳米材料/金电极表面，在30℃孵育1 h，移取5 μL不同浓度呕吐毒素和1 U Recjf外切酶的混合物滴加至电极表面于37℃孵育1 h，得到亚甲基蓝/dsDNA/金-二硒化镍纳米材料/金电极；
（4）电化学传感器是以亚甲基蓝/dsDNA/金-二硒化镍纳米材料/金电极为工作电极，以银|氯化银电极为参比电极，铂丝电极为对电极，通过二茂铁和亚甲基蓝的响应信号变化指示样品中呕吐毒素的含量，得到了用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器。
所制备的电化学传感器对呕吐毒素的检测具有准确度高，线性范围宽（1×10-7~4×10-4 mol/L），检测下限低（1×10-8 mol/L）的特点。同时，对实际样品(如玉米、小麦)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。
以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整孵育时间等方法均在本发明专利要求范围之内。

Claims (1)

1.一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料的制备：采用一锅溶剂热法制备过渡金属硫族化合物纳米材料，将0.5~0.7 g过渡金属粉末和0.2~0.4 g硼氢化钠溶于60~70 mL分散剂中搅拌0.5~1.5 h，加入0.9~1.0 g六水合过渡金属二氯化物继续搅拌0.5~1.5 h，得到均匀分散的黑色溶液；将制备好的前体溶液放入聚四氟乙烯内衬高压釜中，在150~170℃的烘箱中保温20~24 h，在50~60℃下处理10~12 h即得过渡金属硫族化合物纳米材料；采用氧化还原法在过渡金属硫族化合物纳米材料上原位生成贵金属纳米粒子，将10~15 mg制备好的过渡金属硫族化合物纳米材料超声分散在15~20 mL还原剂中，将3~5 mL 1~3 mg/mL贵金属溶液加入混合物中，在70~90℃下孵育12~24 h，洗涤后在70~90℃下干燥至恒重；其中，所述的贵金属为金、铑、钯、铂中的一种或多种；所述的过渡金属硫族化合物为二硫化钼、二硫化钨、二硒化钼、二硒化镍、二硒化钨中的一种或多种；所述的分散剂为乙二胺、N，N-二甲基甲酰胺、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或多种；所述的过渡金属为钼、钨、镍中的一种或多种；所述还原剂为含0.5 wt%壳聚糖乙酸溶液、抗坏血酸、柠檬酸盐、水合肼中的一种或多种；所述的贵金属溶液为氯铂酸、氯金酸、醋酸钯、硝酸铑中的一种或多种；
（2）dsDNA的制备：将10~20 μL 1~5 μM适体链DNA1与10~20 μL 1~5 μM 3'端修饰有信号分子a 5'端修饰有巯基的互补链a-DNA2-SH在30~40℃下混合12~24 h，即得到dsDNA；其中，所述的信号分子a为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种；
（3）信号分子b/dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和蒸馏水中分别超声处理5~10min，然后将金电极浸入强氧化溶液中20~60 min，用蒸馏水冲洗干燥，取1~10 mg上述制备的贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料分散至1~5 mL蒸馏水中，取1~7 μL上述溶液滴加至金电极表面，于红外灯下干燥6~10 min，移取1~7 μL上述dsDNA滴加至电极表面，在30~40℃孵育1~2 h后，用pH为7.2~7.6的缓冲液洗涤，移取3~7 μL信号分子b滴加至dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极表面，在30~40℃孵育1~2 h，移取5~10 μL不同浓度呕吐毒素和1~5 U核酸外切酶的混合物滴加至电极表面于30~40℃孵育1~2 h，得到信号分子b/dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极；其中，所述的信号分子b为硫堇、亚甲基蓝、二茂铁、中性红中的一种或多种；所述的强氧化溶液为过氧化氢、浓硫酸混合物，体积比为1:1~3:1；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或多种；所述的核酸外切酶为Recjf外切酶、EXO Ⅲ外切酶、T7 EXO外切酶中的一种或多种；
（4）电化学适体传感器是以信号分子b/dsDNA/贵金属-过渡金属硫族化合物纳米材料/金电极为工作电极，以银|氯化银电极为参比电极，铂丝电极为对电极，通过信号分子a和信号分子b的响应信号变化指示样品中呕吐毒素的含量，得到了用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器。
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