CN104990966A - 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents
一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104990966A CN104990966A CN201510383185.3A CN201510383185A CN104990966A CN 104990966 A CN104990966 A CN 104990966A CN 201510383185 A CN201510383185 A CN 201510383185A CN 104990966 A CN104990966 A CN 104990966A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lysozyme
- detecting
- electrode
- biological sensor
- electrochemica biological
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims abstract description 77
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 77
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 26
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical compound Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- 229940075397 calomel Drugs 0.000 claims abstract description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 14
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 claims description 7
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241001481789 Rupicapra Species 0.000 claims description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000010985 leather Substances 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCP QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 abstract description 4
- GBDZMMXUOBAJMN-UHFFFAOYSA-K azane;ruthenium(3+);trichloride Chemical compound N.N.N.N.N.N.[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Ru+3] GBDZMMXUOBAJMN-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- XEIPQVVAVOUIOP-UHFFFAOYSA-N [Au]=S Chemical compound [Au]=S XEIPQVVAVOUIOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical group OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 240000004859 Gamochaeta purpurea Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Abstract
本发明公开了一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)设计一条报告探针DNA链S1；(2)将金电极预处理；(3)S1在缓冲液中打开二硫键，后将溶菌酶适体S2加入与S1形成双链DNA；(4)将处理好的金电极浸在双链DNA溶液中，将双链DNA修饰到金电极表面。本发明还公开了一种利用上述方法制备的电化学生物传感器以及该传感器在检测溶菌酶中的应用。将本发明得到的电极在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与甘汞参比电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测。本发明首次将双电化学信号放大的策略结合免标记策略应用到溶菌酶的检测中来，实现高灵敏度地对溶菌酶进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及电化学检测技领域术，具体涉及一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
溶菌酶是一种由多形核白细胞分泌的抗菌蛋白质，通常在人体中，溶菌酶具有生理和药物上的功能，例如抗炎、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等。溶菌酶在人体液中的浓度在临床上可以做为许多疾病诊断的标志，例如口咽部念珠菌感染的病人唾液中的溶菌酶的浓度会升高；肾病患者的尿液中会出现溶菌酶；血液、脑脊髓液中溶菌酶的浓度是白血病和中枢神经肿瘤疾病的重要辅助诊断依据，因此对于溶菌酶的检测在临床诊断学上具有重要意义。
通常对于溶菌酶的检测必须先对溶菌酶进行分离，常见的方法有凝胶电泳法、高效液相色谱法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法等，这些方法虽然有高的灵敏度，但是具有操作复杂，成本高等诸多缺点。人体液中溶菌酶的浓度较低通常只有10-7mol·L-1，因此采用信号放大策略提高检测限对于溶菌酶的测定是非常必要的。
基于核酸适体制备的和具有信号放大功能的电化学生物传感器，在对实际样品检测时不仅无需对溶菌酶进行测定前的分离，而且还具有较低的检测限，较高的灵敏度和较好的选择性，同时电化学的检测方法使其具有成本低，操作简便、省时等优点，因此，制备一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器为溶菌酶的检测提供了一个新的理想选择。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器，利用该电化学生物传感器对溶菌酶进行检测，具有选择性好、灵敏度高等优点。
本发明的第二目的是提供该电化学生物传感器的制备方法。
本发明的第三目的是提供该电化学生物传感器在检测溶菌酶中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计一条报告探针DNA链S1，该DNA链可以与溶菌酶适体链S2互补配对并且自身有16个碱基长度的互补配对序列，能够在适体链脱离后形成颈环结构；S1链的3’端修饰有二茂铁标记物，该标记物可以产生电化学信号；S1链的5’端硫醇化，使得S1通过金-硫键修饰到金电极表面；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-Fc-3’，如序列表中SEQ ID NO.1所示；适体S2的DNA链序列为：5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，如序列表中SEQ ID NO.2所示；
(2)将金电极打磨抛光成镜面，再经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金电极；
(3)报告探针S1在含有三(2-羧乙基)膦的缓冲液中打开二硫键，后将溶菌酶适体S2加入与S1形成双链DNA；
(4)将步骤(2)处理好的金电极浸在步骤(3)得到双链DNA溶液中，将双链DNA修饰到金电极表面，得电化学生物传感器。
步骤(2)中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s。
步骤(2)中，干燥为氮气吹干。
步骤(3)中，所述缓冲液为含有90～110mM Tris-HCl，90～110mM NaCl，9～11mM三(2-羧乙基)膦的混合液，其pH为7.2～7.6。
步骤(3)中S1的浓度为1～2uM，S2的浓度为1～2uM。
步骤(3)中，双链DNA形成条件为：混合液90℃加热4～6分钟，37℃反应2～3小时。
步骤(4)中，电极浸入双链DNA溶液的时间为20～24小时。
本发明还提供了一种上述传感器在检测溶菌酶中的应用，检测步骤为：
(1)将上述传感器在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与甘汞参比电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)，二茂铁的峰电流为I0(Fc)；
(2)将该电化学生物传感器与不同浓度的溶菌酶进行识别后用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的三氯化六氨合钌的峰电流与步骤(1)得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|△IRuHex|＝|IRuHex-I0(RuHex)|，同样方法处理将得到|△IFc|；以|△IRuHex|+|△IFc|对溶菌酶浓度做线性回归方程，得工作曲线；
(3)在对实际样品进行检测时，采用同样方法对待测样品中的溶菌酶进行SWV检测，将得到两个峰电流分别与对应I0做差、取绝对值、加和后代入线性回归方程即得样品中溶菌酶的浓度。
步骤(1)中，三氯化六氨合钌检测液为100mM Tris-HCl、140mM NaCl、5mM MgCl2、10μM RuHex三氯化六氨合钌的混合液，其pH为7.4。
步骤(1)中，浸泡时间为5～6分钟。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
(1)本发明制备的方法简单，易操控，反应条件温和，与凝胶电泳法、高效液相色谱法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法等方法相比较，电化学生物传感器的方式具有样品无需前处理，易操控，反应条件简单、温和等优点。
(2)本发明首次将双电化学信号放大的策略结合免标记策略应用到溶菌酶的检测中来，在实现高灵敏度地对溶菌酶进行检测(检测限达到2.3×10-12M)的同时还具有操作简便，成本低，检测快速高效等优点。
(3)本发明利用溶菌酶适体与溶菌酶的特异性结合，经多次筛选获得的核酸适体与靶标分子的亲和力强，解离常数(Kd)经常在nM和pM之间，具有好的选择性和灵敏度，核酸适体与靶标分子有较大的接触面积，从而能分辨出靶标分子结构上官能团细微的变化，因此适体具有高度识别的能力，能够直接对实际样品中的溶菌酶进行准确测定。
(4)本申请中，溶菌酶在不同的缓冲液中清洗，当缓冲液为10mM Tris-HCl，其作用是，用其冲洗电极可以将未与金电极结合的报告探针链和脱离下来的溶菌酶、溶菌酶适体冲净；在含有100mM Tris-HCl，140mM NaCl，5mM MgCl2的缓冲液中浸泡是有助于DNA颈环结构的形成；而包含100mM Tris-HCl，140mM NaCl，5mM MgCl2，10μM RuHex的缓冲液的作用是使得DNA吸附RuHex，产生RuHex信号的变化。
附图说明
图1是本申请的原理图；
图2是本申请检测溶菌酶的线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实验中所使用的仪器及试剂为：(1)仪器：CHI650电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；采用饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极；(2)试剂：溶菌酶适体与报告探针(上海生工生物工程股份有限公司)，其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
1、溶液配制
(1)100mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2，pH为7.4：
称取1.21144g tris、0.5844g NaCl、0.02033g MgCl2于150ml烧杯中溶解，在25℃下，用0.2M的盐酸溶液调节pH为7.4，定容100ml。
(2)100mM Tris-HCl，140mM NaCl，5mM MgCl2，pH为7.4：
称取1.21144g tris、0.8182g NaCl、0.1015g MgCl2于150ml烧杯中溶解，在25℃下，用0.2M的盐酸溶液调节pH为7.4，定容100ml。
(3)100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH为7.4：
称取1.21144g tris、0.5844g NaCl于150ml烧杯中溶解，在25℃下，用0.2M的盐酸溶液调节pH为7.4，定容100ml。
(4)10mM Tris-HCl，pH为7.4：
称取0.1211g tris，于150ml烧杯中溶解，在25℃下，用0.2M的盐酸溶液调节pH＝7.4，定容100ml。
(5)溶菌酶：超纯水配置100uM母液，用100mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2的缓冲溶液稀释母液配制成0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM浓度梯度的溶菌酶溶液。
实施例1：
一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)设计一条报告探针DNA链S1，该DNA链可以与溶菌酶适体链S2互补配对并且自身有16个碱基长度的互补配对序列，能够在适体链脱离后形成颈环结构；S1链的3’端修饰有二茂铁标记物，该标记物可以产生电化学信号；S1链的5’端硫醇化，使得S1通过金-硫键修饰到金电极表面；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-Fc-3’，如序列表中SEQ ID NO.1所示；适体S2的DNA链序列为：5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，如序列表中SEQ ID NO.2所示；
(2)金电极在麂皮上用0.05um Al2O3打磨成镜面，依次用乙醇、二次水超声清洗20-30秒；之后在0.5M硫酸溶液中循环伏安，扫速为0.1V/s至稳定后二次水冲洗干净，氮气吹干；
(3)浓度为1uM的报告探针S1在pH为7.4的含有100mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM三(2-羧乙基)膦的缓冲液中处理1小时打开二硫键，加入浓度为1uM溶菌酶适体S2，得混合液；上述混合液于90℃、加热4分钟后，然后于37℃反应2小时，形成双链dsDNA；
(4)处理好的金电极浸在2.0mL离心管中双链dsDNA中室温过夜20小时，用pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液清洗；再在50μL pH为7.4的1mM 6-巯基己-1-醇中浸泡1h，后用pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液清洗得电化学生物传感器。
实施例2：
一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)设计一条报告探针DNA链S1，该DNA链可以与溶菌酶适体链S2互补配对并且自身有16个碱基长度的互补配对序列，能够在适体链脱离后形成颈环结构；S1链的3’端修饰有二茂铁标记物，该标记物可以产生电化学信号；S1链的5’端硫醇化，使得S1通过金-硫键修饰到金电极表面；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-Fc-3’，如序列表中SEQ ID NO.1所示；适体S2的DNA链序列为：5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，如序列表中SEQ ID NO.2所示；
(2)金电极在麂皮上用0.05um Al2O3打磨成镜面，依次用乙醇、二次水超声清洗40-60秒；之后在0.5M硫酸溶液中循环伏安，扫速为0.1V/s至稳定后二次水冲洗干净，氮气吹干；
(3)浓度为2uM的报告探针S1在pH为7.4的含有100mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM三(2-羧乙基)膦的缓冲液中处理1小时打开二硫键，加入浓度为2uM溶菌酶适体S2，得混合液；上述混合液于90℃、加热6分钟后，然后于37℃反应2小时，形成双链dsDNA；
(4)处理好的金电极浸在2.0mL离心管中双链dsDNA中室温过夜24小时，用pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液清洗；再在50μL pH为7.4的1mM 6-巯基己-1-醇中浸泡1h，后用pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液清洗，得电化学生物传感器。
实施例3
实施例1-2制备的电化学生物传感器在检测溶菌酶中的应用，步骤如下：
(1)将实施例1-2制备的电化学传感器浸在2.0mL离心管含有浓度梯度的溶菌酶pH为7.4的含有100mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2的缓冲溶液中，37℃，1小时后用pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液清洗；再浸在pH为7.4的含有100mM Tris-HCl，140mMNaCl，5mM MgCl2的缓冲溶液中30分钟；之后电极浸在pH为7.4的含有100mM Tris-HCl,140mM NaCl，5mM MgCl2，10μM RuHex三氯化六氨合钌检测液中5min后进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)，二茂铁的峰电流为I0(Fc)；
(2)将该电化学生物传感器与不同浓度梯度的溶菌酶进行识别后用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的三氯化六氨合钌的峰电流与步骤(1)得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|△IRuHex|＝|IRuHex-I0(RuHex)|，同样方法处理将得到|△IFc|；以|△IRuHex|+|△IFc|对溶菌酶浓度做线性回归方程，得线性回归方程(|△IRuHex|+|△IFc|)(uA)＝0.53976+0.29014lgCLy(pM)，R2＝0.99836，如图2所示；
(2)对待测样品中的溶菌酶进行SWV检测，将得到两个峰电流分别与对应I0做差、取绝对值、加和后代入线性回归方程即得样品中溶菌酶的浓度。
对溶菌酶检测结果显示，对不同浓度溶菌酶峰电流曲线均变化明显，溶菌酶在浓度为0.01～100nM内成良好的线性关系，本申请的电化学生物传感器对溶菌酶的检测限度可低至2.3×10-12M，性能灵敏、有效、快速。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计一条报告探针DNA链S1，所述DNA链S1与溶菌酶适体S2互补配对；S1链的3’端修饰有二茂铁标记物，S1链的5’端硫醇化；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-Fc-3’；适体S2的DNA链序列为：5’-ATCAGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’；
(2)将金电极打磨抛光成镜面，再经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金电极；
(3)报告探针S1在含有三(2-羧乙基)膦的缓冲液中打开二硫键，后将溶菌酶适体S2加入与S1形成双链DNA；
(4)将步骤(2)处理好的金电极浸在步骤(3)得到双链DNA溶液中，将双链DNA修饰到金电极表面，得电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA链S1自身有16个碱基长度的互补配对序列，在溶菌酶适体链S2脱离后形成颈环结构。
3.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s；干燥为氮气吹干。
4.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液为含有90～110mM Tris-HCl，90～110mM NaCl，9～11mM三(2-羧乙基)膦的混合液，其pH为7.2～7.6。
5.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中S1的浓度为1～2uM，S2的浓度为1～2uM。
6.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，双链DNA形成条件为：混合液于90℃加热4～6分钟，37℃反应2～3小时。
7.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，电极浸入双链DNA溶液的时间为20～24小时。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法制备的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器。
9.如权利要求8所述的电化学生物传感器在检测溶菌酶中的应用，其特征在于，检测步骤如下：
(1)将上述传感器在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与甘汞参比电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)，二茂铁的峰电流为I0(Fc)；
(2)将该电化学生物传感器与不同浓度的溶菌酶进行识别后用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的三氯化六氨合钌的峰电流与步骤(1)得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|△IRuHex|＝|IRuHex-I0(RuHex)|，同样方法处理将得到|△IFc|；以|△IRuHex|+|△IFc|对溶菌酶浓度做线性回归方程，得工作曲线；
(3)在对实际样品进行检测时，采用同样方法对待测样品中的溶菌酶进行SWV检测，将得到两个峰电流分别与对应I0做差、取绝对值、加和后代入线性回归方程即得样品中溶菌酶的浓度。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，三氯化六氨合钌检测液为pH为7.4的含有100mM Tris-HCl、140mM NaCl、5mM MgCl2、10μM RuHex的混合液；所述浸泡时间为5～6分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510383185.3A CN104990966B (zh) | 2015-07-02 | 2015-07-02 | 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510383185.3A CN104990966B (zh) | 2015-07-02 | 2015-07-02 | 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104990966A true CN104990966A (zh) | 2015-10-21 |
| CN104990966B CN104990966B (zh) | 2016-03-30 |
Family
ID=54302805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510383185.3A Active CN104990966B (zh) | 2015-07-02 | 2015-07-02 | 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104990966B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105784796A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-07-20 | 青岛大学 | 一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法 |
| CN106198673A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-12-07 | 青岛大学 | 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 |
| CN106872447A (zh) * | 2017-01-14 | 2017-06-20 | 北京工业大学 | 增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法 |
| CN106959323A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-07-18 | 临沂大学 | 一种检测溶菌酶的方法 |
| CN107419005A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-12-01 | 青岛大学 | 一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的qcm检测方法及应用 |
| CN110530948A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-03 | 成都理工大学 | 一种基于光催化的无标记电化学生物传感器检测溶菌酶的新方法 |
| CN111398395A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-07-10 | 河南工业大学 | 一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040137521A1 (en) * | 2001-06-05 | 2004-07-15 | Jamila Najib-Fruchart | Method for apo clll measurement in apo b and non apo b containing particles |
| GB2498580A (en) * | 2012-01-23 | 2013-07-24 | Peter Stuart Arnold | Immunogenic agents |
| CN103940872A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-07-23 | 青岛大学 | 同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用 |
-
2015
- 2015-07-02 CN CN201510383185.3A patent/CN104990966B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040137521A1 (en) * | 2001-06-05 | 2004-07-15 | Jamila Najib-Fruchart | Method for apo clll measurement in apo b and non apo b containing particles |
| GB2498580A (en) * | 2012-01-23 | 2013-07-24 | Peter Stuart Arnold | Immunogenic agents |
| CN103940872A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-07-23 | 青岛大学 | 同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TONGQIAN HAN ET AL.: "Gold nanoparticles enhanced electrochemiluminescence of graphite-like carbon nitride for the detection of Nuclear Matrix Protein 22", 《SENSORS AND ACTUATORS B》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105784796A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-07-20 | 青岛大学 | 一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法 |
| CN105784796B (zh) * | 2016-03-03 | 2018-07-24 | 青岛大学 | 一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法 |
| CN106198673B (zh) * | 2016-07-14 | 2019-10-01 | 青岛大学 | 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 |
| CN106198673A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-12-07 | 青岛大学 | 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 |
| US10605761B2 (en) | 2016-07-14 | 2020-03-31 | Qingdao University | Electrochemical biosensor based on aptamer/nano silver probe and EXO I enzyme |
| WO2018010681A1 (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-18 | 青岛大学 | 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 |
| CN106872447A (zh) * | 2017-01-14 | 2017-06-20 | 北京工业大学 | 增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法 |
| CN106959323A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-07-18 | 临沂大学 | 一种检测溶菌酶的方法 |
| CN106959323B (zh) * | 2017-03-20 | 2019-10-01 | 临沂大学 | 一种检测溶菌酶的方法 |
| CN107419005A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-12-01 | 青岛大学 | 一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的qcm检测方法及应用 |
| CN110530948A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-03 | 成都理工大学 | 一种基于光催化的无标记电化学生物传感器检测溶菌酶的新方法 |
| CN111398395A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-07-10 | 河南工业大学 | 一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法 |
| CN111398395B (zh) * | 2020-05-22 | 2022-06-24 | 河南工业大学 | 一种用于呕吐毒素检测的双信号电化学适体传感器制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104990966B (zh) | 2016-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104990966B (zh) | 一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法 | |
| US10605761B2 (en) | Electrochemical biosensor based on aptamer/nano silver probe and EXO I enzyme | |
| WO2016062101A1 (zh) | 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用 | |
| CN105784796B (zh) | 一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法 | |
| CN104651491B (zh) | 一种dna四面体纳米结构信号探针及其应用 | |
| CN105651999B (zh) | 一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用 | |
| CN104267088B (zh) | 检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法 | |
| WO2021003973A1 (zh) | 一种基于多肽复合膜修饰电极的l-精氨酸检测方法及传感器 | |
| CN102288656B (zh) | 一种检测卵巢skov-3癌细胞的三明治型电化学传感器 | |
| CN103698375A (zh) | 一种检测miRNA的方法 | |
| WO2021004039A1 (zh) | 一种l-精氨酸的检测方法及传感器 | |
| CN102262118A (zh) | 检测肿瘤标志物的生物电化学传感器及其制备方法 | |
| CN105445349A (zh) | 特异性多肽探针修饰的金电极、其制备方法及应用 | |
| US20080156646A1 (en) | Nanostructured electrochemical biosensor with aptamer as molecular recognition probe | |
| CN102866185A (zh) | 基于g-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法 | |
| CN107064258B (zh) | 基于dna产生电信号及其自组装放大信号的电化学适配体传感器测定her2的方法 | |
| CN108982605A (zh) | 一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器及其检测内毒素的方法 | |
| CN103439319B (zh) | 碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 | |
| CN107044978A (zh) | 基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法 | |
| US11946098B2 (en) | Calibration-free measurement with electrochemical biosensors | |
| CN108195913B (zh) | 一种用于电化学检测her2的生物传感器及其构建方法 | |
| CN106434903B (zh) | 检测基因p53的比率电化学dna传感器修饰电极及其制备方法 | |
| CN104792999A (zh) | 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片 | |
| CN105445350A (zh) | 一种基于肽核酸的电化学dna生物传感器及其制备方法 | |
| Yin et al. | Sensitive and low-background electrochemical assay of corin activity via supramolecular recognition and rolling circle amplification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 266071 Hongkong East Road, Laoshan District, Shandong, China, No. 7, No. Applicant after: QINGDAO University Address before: 266071 Shandong city of Qingdao province Ningxia City Road No. 308 Applicant before: Qingdao University |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231207 Address after: No. 1 and 2, Lane 999, Xinmiao 3rd Road, Xinqiao Town, Songjiang District, Shanghai, 200000 Patentee after: SHANGHAI E.K.M BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: No. 3510, floor 35, building 1, No. 500, middle section of Tianfu Avenue, Chengdu hi tech Zone, China (Sichuan) pilot Free Trade Zone, Chengdu, Sichuan 610000 Patentee before: Sichuan qianyiding Technology Co.,Ltd. Effective date of registration: 20231207 Address after: No. 3510, floor 35, building 1, No. 500, middle section of Tianfu Avenue, Chengdu hi tech Zone, China (Sichuan) pilot Free Trade Zone, Chengdu, Sichuan 610000 Patentee after: Sichuan qianyiding Technology Co.,Ltd. Address before: 266071 No. 7 East Hongkong Road, Laoshan District, Shandong, Qingdao Patentee before: QINGDAO University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |