CN106959323A - 一种检测溶菌酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测溶菌酶的方法，包括以下步骤：将金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面、孵育、洗涤、氮气吹干；再将溶菌酶适体溶液滴涂到金电极表面、孵育、洗涤、氮气吹干，进行第一电化学阻抗谱检测；洗涤第一次电化学阻抗谱检测后的金电极，氮气吹干，滴涂待测样品、孵育、洗涤、氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测；待测样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去第一次电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，与预定的标准曲线，得到溶菌酶的浓度。根据本发明的实施例可知，采用本发明的检测方法操作简单，不需要标记，且灵敏度较高，检测限可达2.0×10‑11mol/L，线性范围：1.0×10‑7～1.0×10‑11mol/L。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分析技术领域，尤其涉及一种检测溶菌酶的方法。
背景技术
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
目前溶菌酶的检测方法有电致化学发光法，虽然电致化学发光灵敏度高，但是得到的可定量测定的线性范围较窄。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种检测溶菌酶的方法，能够使得检测结果灵敏度高、线性范围宽。
本发明提供了一种检测溶菌酶的方法，包括以下步骤：
1)将金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面，25～42℃孵育2～4h，水洗涤金电极表面，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
2)用水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极，氮气吹干，滴涂待测样品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到待测样品电阻抗图谱；
3)根据所述待测样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，与预定的标准曲线，得到待测样品中溶菌酶的浓度，所述标准曲线为标准品溶液中溶菌酶的浓度与电阻抗差值之间的线性曲线；
所述金属有机骨架的结构如图3所示。
优选的，所述金属有机骨架溶液中金属有机骨架的质量体积浓度为0.5～2.5mg/ml。
优选的，所述金属有机骨架的粒度为1～3μm
优选的，所述溶菌酶适体溶液中溶菌酶适体的摩尔浓度为0.8～1.2mol/L。
优选的，所述溶菌酶适体的序列为：
5’-ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG-3’。
优选的，所述标准曲线的制作中用的标准品溶液至少包括9个梯度浓度，分别为0.8～1.2×10-7mol/L、4.5～5.5×10-8mol/L、0.8～1.2×10-8mol/L、4.5～5.5×10-9mol/L、0.8～1.2×10-9mol/L、4.5～5.5×10-10mol/L、0.8～1.2×10-10mol/L、4.5～5.5×10-11mol/L和0.8～1.2×10-11mol/L。
优选的，所述电化学阻抗谱检测使用三电极系统，包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含有铁离子的电解质溶液；
检测条件：频率为0.1～1.0×106Hz，初始电压为0.2～0.3V，振幅为4.0～6.0V。
本发明提供了一种检测溶菌酶的方法，包括以下步骤：
1)将金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面，25～42℃孵育2～4h，水洗涤金电极表面，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；2)用水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极，氮气吹干，滴涂待测样品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到待测样品电阻抗图谱；3)根据所述待测样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，与预定的标准曲线，得到待测样品中溶菌酶的浓度，所述标准曲线为标准品溶液中溶菌酶的浓度与电阻抗差值之间的线性曲线；在本申请中，由于溶菌酶适体和溶菌酶的作用非常灵敏，很少量的溶菌酶即可引起溶菌酶适体的构型发生比较明显的变化，反映在电化学检测上就是电子转移阻抗明显增加。当溶菌酶浓度持续增加时，电子转移阻抗随之增加。由于金属有机框架吸附的溶菌酶适体量大，导致电子转移阻抗差与浓度的lg值在较大范围内都成线性相关。根据本发明的实施例可知，采用本发明的检测方法操作简单，不需要标记，且灵敏度较高，检测限可达2.0×10-11M，线性范围：1.0×10-7～1.0×10-11mol/L。
本发明以金属有机骨架作为溶菌酶的载体，稳定性高，可长期储存；而且由于溶菌酶适体的专一性，凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)干扰物响应较低，不会干扰溶菌酶的检测，得到的检测结果具有较高的准确度。
附图说明
图1为溶菌酶标准曲线；
图2为选择性实验结果，从左至右依次为去离子水、牛血清白蛋白、免疫球蛋白G、凝血酶和溶菌酶；
图3为金属有机骨架的结构。
具体实施方式
本发明提供了一种检测溶菌酶的方法，包括以下步骤：
1)将金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面，25～42℃孵育2～4h，水洗涤金电极表面，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
2)用水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极，氮气吹干，滴涂待测样品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到待测样品电阻抗图谱；
3)根据所述待测样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，与预定的标准曲线，得到待测样品中溶菌酶的浓度，所述标准曲线为标准品溶液中溶菌酶的浓度与电阻抗差值之间的线性曲线；
所述金属有机骨架的结构如图3所示。
在本发明中，所述金属有机骨架的结构为如图3所示。
本发明提供的方法以金属有机骨架材料作为修饰金电极的修饰剂，本发明采用的金属有机框架有较大的比表面积，通过氢键、ππ相互作用可以有效吸附溶菌酶适体，增加溶菌酶适体的负载量。在加入溶菌酶以后，产生的电子转移阻抗增加明显。如果不加入金属有机框架，电极无法有效吸附溶菌酶适体，加入溶菌酶后，电子转移阻抗几乎无变化。在本发明中，所述金属有机骨架的制备方法包括以下步骤：将2-氨基对苯二甲酸溶于挥发性有机溶剂中，得到2-氨基对苯二甲酸溶液；向所述2-氨基对苯二甲酸溶液中逐滴加入强碱溶液，调节混合溶液的pH值为5～6；再将所述调节pH值后的混合溶液与三氯化铈混合，发生配位反应后，产生沉淀，沉淀即为金属有机骨架。
在本发明中，所述挥发性有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、苯、甲苯、丙酮或异丙醇；所述挥发性有机溶剂的体积与2-氨基对苯二甲酸的质量比优选为(5～15)ml:(0.01～0.08)g，更优选为(8～12)ml:(0.03～0.06)g，最优选为10ml:0.05g。
在本发明中，所述强碱溶液优选包括氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述强碱溶液的摩尔浓度优选为0.05～0.15mol/L，更优选为0.08～0.12mol/L，最优选为0.1mol/L。所述强碱溶液的加入方式为逐滴加入，每滴的体积为0.5ml；在本发明中，所述强碱溶液调节混合溶液的pH值为5～6。
加入强碱溶液后，本发明将所述混合溶液再与三氯化铈混合，进行配位反应，产生沉淀，即为金属有机骨架。在本发明中，所述三氯化铈与2-氨基对苯二甲酸的质量比优选为(0.040～0.050):(0.01～0.08)，更优选为(0.042～0.048):(0.03～0.06)，最优选为0.044:0.05。在本发明中，所述沉淀的颜色优选为浅黄色。
本发明优选将反应后的体系过滤后，得到沉淀，优选对得到的沉淀进行洗涤和干燥，得到金属有机骨架。本发明对过滤的参数没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的即可。本发明对洗涤的溶剂优选为乙醇，所述乙醇的体积与2-氨基对苯二甲酸的质量比优选为(10～20)ml:(0.01～0.08)g，更优选为(12～18)ml:(0.03～0.06)g，最优选为15ml:0.05g。在本发明中，所述干燥的时间优选为2～4h，更优选为2.5～3.5h，最优选为3h；所述干燥的温度优选为40～80℃，更优选为50～70℃，最优选为60℃。
在本发明中，所述金属有机骨架的粒度优选为1～3μm，更优选为2μm。
在本发明中，所述金属有机骨架溶液中金属有机骨架的质量体积浓度优选为0.5～2.5mg/ml，更优选为0.8～2.0mg/ml，最优选为1.2～1.8mg/ml。在本发明中，优选采用去离子水溶解金属有机骨架。
在本发明中，所述金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面的体积优选为15～25μL，更优选为18～22μL，最优选为20μL。
在本发明中，所述金电极的直径优选为1～4mm，更优选为2～3mm。在本发明中，所述金电极的表面积优选为2～4m2，更优选为2.5～3.5m2，最优选为3.1m2。所述金电极的长度优选为40～80mm，更优选为50～70mm，最优选为60mm。本发明对所述金电极的来源没有特殊限定，采用市售商品即可。
本发明优选对金电极打磨后使用，所述打磨优选包括以下步骤：将所述金电极在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化铝浆打磨，再用ddH2O洗涤金电极，氮气吹干。在本发明中，所述0.5μm的氧化铝浆与0.05μm的氧化铝浆的浓度相同，所述氧化铝浆中氧化铝的质量体积浓度优选为1.5～2.0mg/ml，更优选为1.6～1.8mg/ml。在本发明中，所述氧化铝浆与洗涤用的ddH2O的体积比优选为(4～8):(5～15)，更优选为(5～7):(8～12)，最优选为6:10。
在本发明中，所述金电极打磨后，将打磨后的金电极在含有铁离子的电解质溶液中进行循环伏安扫描，至ΔEp＜0.12V为打磨合格。
在本发明中，所述含铁离子的电解质溶液优选包括以下重量份数的组分：1.5～2.0份氯化钾、0.2～0.6份铁氰化钾、0.4～0.6份亚铁氰化钾和200～300份去离子水；更优选包括1.7～1.9份氯化钾、0.3～0.5份铁氰化钾、0.5～0.58份亚铁氰化钾和220～280份去离子水；最优选包括1.86份氯化钾、0.41份铁氰化钾、0.53份亚铁氰化钾和250份去离子水。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。
在本发明中，所述循环伏安扫描的参数优选为：初始电压-0.1～-0.3V，高压0.2～1.0V，低压-0.1～0.3V，扫描速度0.05～0.15V/S。在本发明中，所述初始电压优选为-0.1～-0.3V，更优选为-0.2V；所述高压优选为0.2～1.0V，更优选为0.4～0.8V，最优选为0.6V；所述低压优选为-0.1～-0.3V，更优选为-0.2V；所述扫描速度优选为0.05～0.15V/S，更优选为0.08～0.12V/S，最优选为0.1V/S。本发明对所述扫循环伏安曲线的设备没有特殊要求，采用本领域技术人员常规选用的设备即可。
得到打磨合格的金电极后，在硫酸溶液中进行循环伏安扫描，直到得到稳定的循环伏安曲线，表明金电极清洗干净。在本发明中，所述硫酸溶液的摩尔浓度优选为0.4～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L。
在本发明中，在硫酸溶液中扫循环伏安曲线的参数优选为：初始电压-0.1～-0.3V，高压1.2～2.0V，低压-0.1～-0.3V，扫描段数15～25，扫描速度0.05～0.15V/S。所述初始电压优选为-0.1～-0.3V，更优选为-0.2V；所述高压优选为1.2～2.0V，更优选为1.4～1.8V，最优选为1.6V；所述低压优选为-0.1～-0.3V，更优选为-0.2V；所述扫描段数优选为15～25，更优选为18～22，最优选为20；所述扫描速度优选为0.05～0.15V/S，更优选为0.08～0.12V/S，最优选为0.1V/S。本发明对所述扫循环伏安曲线的设备没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用的即可。
在本发明中，将所述金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面，25～42℃孵育2～4h，水洗涤金电极表面，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极。在本发明中，所述孵育的温度优选为25～42℃，更优选为30～40℃，最优选为37℃；所述孵育的时间优选为2～4h，更优选为2.5～3.5h，最优选为3h。
在本发明中，所述水洗涤的次数优选为1～5次，更优选为2～4次，最优选为3次。所述洗涤用的水优选为去离子水。
得到金属有机骨架修饰金电极后，本发明将溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干。
在本发明中，将所述溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面后进行孵育，所述孵育的温度优选为25～42℃，更优选为30～40℃，最优选为37℃；所述孵育的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，最优选为2h。
在本发明中，所述溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面的体积优选为15～25μL，更优选为18～22μL，最优选为20μL。
在本发明中，所述水洗涤的次数优选为1～5次，更优选为2～4次，最优选为3次。所述洗涤用的水优选为去离子水。
在本发明中，所述溶菌酶适体溶液中溶菌酶适体的摩尔浓度优选为0.8～1.2mol/L，更优选为0.9～1.1mol/L，最优选为1.0mol/L。在本发明中，优选采用去离子水溶解溶菌酶适体。
在本发明中，所述溶菌酶适体的序列优选为：
5’-ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG-3’。
在本发明中，所述溶菌酶适体的序列为委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
在本发明中，以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；水洗涤第一电化学阻抗谱检测后的金电极，氮气吹干，滴涂待测样品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到待测样品电阻抗图谱。
在本发明中，所述待测样品滴涂到所述溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极表面的体积优选为15～25μL，更优选为18～22μL，最优选为20μL。
本发明在所述第一次电化学阻抗谱检测后的金电极表面滴涂待测样品，滴涂后进行孵育反应。所述孵育的温度优选为25～42℃，更优选为30～40℃，最优选为37℃；所述孵育的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，最优选为2h。
在本发明中，所述水洗涤的次数优选为1～5次，更优选为2～4次，最优选为3次。所述洗涤用的水优选为去离子水。
在本发明中，所述电化学阻抗谱检测优选使用三电极系统，包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含有铁离子的电解质溶液，频率为0.1～1.0×106Hz，初始电压为0.2～0.3V，振幅为4.0～6.0V。
在本发明中，所述含铁离子的电解质溶液优选包括以下重量份数的组分：1.5～2.0份氯化钾、0.2～0.6份铁氰化钾、0.4～0.6份亚铁氰化钾和200～300份去离子水；更优选为1.7～1.9份氯化钾、0.3～0.5份铁氰化钾、0.5～0.58份亚铁氰化钾和220～280份去离子水；最优选为1.86份氯化钾、0.41份铁氰化钾、0.53份亚铁氰化钾和250份去离子水。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。
在本发明中，所述电化学阻抗检测的条件：频率优选为0.1～1.0×106Hz，更优选为0.3～0.8×106Hz，最优选为0.5～0.6×106Hz；所述初始电压优选为0.2～0.3V，更优选为0.25V；所述振幅优选为4.0～6.0V，更优选为4.5～5.5V，最优选为5.0V。
本发明根据所述待测样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，与预定的标准曲线，得到待测样品中溶菌酶的浓度，所述标准曲线为标准品溶液中溶菌酶的浓度与电阻抗差值之间的线性曲线。
在本发明中，所述标准曲线的获取方法优选包括以下步骤：按照上述技术方案对标准品溶液进行检测，得到不同浓度标准品对应的电子转移电阻，根据标准品谱图中的电子转移电阻与基础谱图中的电子转移电阻得到电子转移电阻差，差值跟标准品溶液中的溶菌酶的浓度线性拟合，得到线性曲线。
在本发明中，所述标准品溶液至少包括9个梯度浓度，分别为0.8～1.2×10-7mol/L、4.5～5.5×10-8mol/L、0.8～1.2×10-8mol/L、4.5～5.5×10-9mol/L、0.8～1.2×10-9mol/L、4.5～5.5×10-10mol/L、0.8～1.2×10-10mol/L、4.5～5.5×10-11mol/L和0.8～1.2×10- 11mol/L；更优选为0.9～1.1×10-7mol/L、4.8～5.2×10-8mol/L、0.9～1.1×10-8mol/L、4.8～5.2×10-9mol/L、0.9～1.1×10-9mol/L、4.8～5.2×10-10mol/L、0.9～1.1×10-10mol/L、4.8～5.2×10-11mol/L和0.9～1.1×10-11mol/L；最优选为1.0×10-7mol/L、5.0×10-8mol/L、1.0×10-8mol/L、5.0×10-9mol/L、1.0×10-9mol/L、5.0×10-10mol/L、1.0×10-10mol/L、5.0×10-11mol/L和1.0×10-11mol/L。
下面结合实施例对本发明提供的一种检测溶菌酶的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
标准曲线的制作：
将20μL金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面，37℃孵育3h，去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将20μL溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
打磨的步骤为：将金电极在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化铝溶液打磨，再用ddH2O洗涤金电极，氮气吹干。
2)用去离子水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极3次，氮气吹干，滴涂20μL标准品溶液，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到标准品溶液电阻抗图谱；
电化学阻抗谱检测使用三电极系统，包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含铁离子的溶液，检测条件：频率为0.1×106Hz，初始电压为0.2V，振幅为4.0V。
3)根据所述标准品溶液电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，以标准品溶液中的溶菌酶浓度的对数值为横坐标，以所述差值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。
标准曲线方程为：y＝19.79711+1.74757X，
标准曲线的相关系数为0.99111，
线性范围为1.0×10-7～1.0×10-11mol/L。
实施例2
选择性实验
将20μL金属有机骨架溶液滴涂到打磨的金电极表面，37℃孵育3h，去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将20μL溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
打磨的步骤为：将金电极在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化铝溶液打磨，再用去离子水洗涤金电极，氮气吹干。
2)用去离子水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极3 次，氮气吹干，分别滴涂20μL的去离子水、牛血清白蛋白溶液(浓度为1.0×10-8mol/L)、溶菌酶溶液(浓度为1.0×10-8mol/L)、免疫球蛋白G溶液(浓度为1.0×10-8mol/L)、和凝血酶溶液(浓度为1.0×10-8mol/L)，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到标准品溶液电阻抗图谱；
电化学阻抗谱检测优选使用三电极系统，包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含铁离子的溶液，检测条件：频率为1.0×106Hz，初始电压为0.24V，振幅为5.0V。
3)根据第二次电化学阻抗谱检测得到的电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差为纵坐标，以去离子水、牛血清白蛋白溶液、溶菌酶溶液、免疫球蛋白G溶液和凝血酶溶液为横坐标，得到选择性实验结果，结果见图2。
从图2中可以得出，溶菌酶适体对溶菌酶具有高度的专一性，对凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)响应较低，进而凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)不会干扰溶菌酶的检测，表明本发明的检测方法对溶菌酶具有选择专一性。
实施例3
将20μL金属有机骨架溶液滴涂到打磨的金电极表面，37℃孵育3h，去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将20μL溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
打磨的步骤为：将金电极在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化铝溶液打磨，再用ddH2O洗涤金电极，氮气吹干。
2)用去离子水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极3次，氮气吹干，滴涂20μL人尿样品，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到人尿样品电阻抗图谱；
电化学阻抗谱检测优选使用三电极系统，包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含铁离子的溶液，检测条件：频率为1.0×106Hz，初始电压为0.3V，振幅为6.0V。
3)根据所述人尿样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，差值为4000khom，与预定的标准曲线，得到溶菌酶的浓度，溶菌酶的浓度为1.0×10-9mol/L。
实施例4
将20μL金属有机骨架溶液滴涂到打磨的金电极表面，37℃孵育3h，去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将20μL溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面3次，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
打磨的步骤为：将金电极在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化铝溶液打磨，再用去离子水洗涤金电极，氮气吹干。
2)用去离子水洗涤所述步骤1)第一次电化学阻抗谱检测后的金电极3次，氮气吹干，滴涂20μL人尿样品，37℃孵育2h，再次去离子水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到人尿样品电阻抗图谱；
电化学阻抗谱检测优选使用三电极系统，包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含铁离子的溶液，检测条件：频率为0.5×106Hz，初始电压为0.25V，振幅为4.5V。
3)根据所述人尿样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，差值为6500khom，与预定的标准曲线，得到溶菌酶的浓度，溶菌酶的浓度为3.2×10-7mol/L。
由以上实施例可知，采用本发明的检测方法操作简单，不需要标记，且灵敏度较高，检测限可达2.0×10-11mol/L，线性范围：1.0×10-7～1.0×10-11mol/L。金属有机骨架的稳定性高，可长期储存。由于溶菌酶适体的专一性，凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)干扰物响应较低，不会干扰溶菌酶的检测，得到的检测结果具有较高的准确度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 临沂大学
<120> 一种检测溶菌酶的方法
<130> 2017年03月
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcagggcta aagagtgcag agttacttag 30
Claims (7)
1.一种检测溶菌酶的方法，包括以下步骤：
1)将金属有机骨架溶液滴涂到金电极表面，25～42℃孵育2～4h，水洗涤金电极表面，氮气吹干后，得到金属有机骨架修饰金电极；再将溶菌酶适体溶液滴涂到所述金属有机骨架修饰金电极表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干；以得到的溶酶体适体-金属有机骨架修饰金电极为工作电极，采用三电极系统进行第一电化学阻抗谱检测，得到基础电阻抗图谱；
2)用水洗涤所述步骤1)第一电化学阻抗谱检测后的金电极，氮气吹干，滴涂待测样品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗涤金电极表面，氮气吹干，进行第二电化学阻抗谱检测，得到待测样品电阻抗图谱；
3)根据所述待测样品电阻抗图谱中的电子转移电阻减去所述基础电阻抗图谱中的电子转移电阻后得到的电子转移电阻差，与预定的标准曲线，得到待测样品中溶菌酶的浓度，所述标准曲线为溶菌酶的浓度与电阻抗差值之间的线性曲线；
所述金属有机骨架的结构如图3所示。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述金属有机骨架溶液中金属有机骨架的质量体积浓度为0.5～2.5mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述金属有机骨架的粒度为1～3μm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述溶菌酶适体溶液中溶菌酶适体的摩尔浓度为0.8～1.2mol/L。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于，所述溶菌酶适体的序列为：
5’-ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG-3’。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的制作中用的标准品溶液至少包括9个梯度浓度，分别为0.8～1.2×10-7mol/L、4.5～5.5×10-8mol/L、0.8～1.2×10-8mol/L、4.5～5.5×10-9mol/L、0.8～1.2×10-9mol/L、4.5～5.5×10-10mol/L、0.8～1.2×10-10mol/L、4.5～5.5×10-11mol/L和0.8～1.2×10-11mol/L。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述三电极系统包括工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；检测液采用含有铁离子的电解质溶液；
检测条件：频率为0.1～1.0×106Hz，初始电压为0.2～0.3V，振幅为4.0～6.0V。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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