CN102514261A - 一种微生物生物印迹薄膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到分子印迹领域，具体的说是一种微生物印迹薄膜及其制备。导电基体依次沉积壳聚糖/石墨烯复合膜、微生物模板和壳聚糖膜即得到微生物生物印迹薄膜。使用本方法制备生物印迹薄膜过程简单，制备条件温和，可以应用于微生物的筛选、分离和检测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及到分子印迹领域，具体的说是一种微生物印迹薄膜及其制备。
背景技术
分子印迹技术是以一种合成人工抗体的技术，其主要原理是：选择能与模板分子形成共价键或者非共价键的功能单体，与模板分子形成复合物，然后通过交联剂共聚形成交联聚合物。将模板分子洗脱后，在聚合物中留下的孔穴与模板分子的形状、大小和表面基团相匹配。通过这些孔穴即生物识别位点对目标分子进行识别。采用分子印迹技术制成人工抗体作为生物识别元件是近几年来生物传感器研究的热门方向。分子印迹技术可以应用催化，分离，纯化，药物传递，检测等领域。在大多数情况下，分子印迹技术的目标物质都是小分子，比如：有毒有机物，氨基酸，糖类等等。对于微生物这类微米尺度的物质的印迹技术仍比较少，主要是由于目标物质过大，移动，固定都比较困难。并且分子印迹常用的方法通常都涉及到有机溶剂，有机溶剂本身会使微生物的细胞壁发生溶解，交联等反应，这些问题给微生物的生物印迹带来了很多困难。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备微生物生物印迹薄膜及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种微生物生物印迹薄膜，导电基体依次沉积壳聚糖/石墨烯复合膜、微生物模板和壳聚糖膜即得到微生物生物印迹薄膜。
所述导电基体沉积厚度为15-20μm的壳聚糖/石墨烯复合膜，将微生物吸附到复合膜上形成微生物模板，而后采用壳聚糖将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋，微生物高度约即得到微生物生物印迹薄膜，即石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋时壳聚糖厚度控制在250-300nm，SRB高度约为500nm。
将上述得到的微生物生物印迹薄膜通过氟硅烷偶联剂进行表面修饰，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后将微生物模板洗脱掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形状相匹配的生物识别位点的微生物生物印迹薄膜。
所述壳聚糖/石墨烯为浓度为0.3mg mL-1的石墨烯与质量分数为0.5％的壳聚糖溶液的混合液，其中石墨烯按如下步骤制备：
1)将天然石墨、NaNO3和浓硫酸按体积比1∶1∶45的比例混合于冰水浴中反应4-4.5h，待用；
2)向步骤1)冰水浴混合物中加入KMnO4，同时将反应温度升至35℃并保持反应温度2-2.5h，而后加入H2O并将温度升至98℃，反应进行2-2.5小时后再加入40-60℃温水和30mL H2O2，并在室温下继续反应1-1.5h，待用；
3)将步骤2)所得物质洗涤后烘干，并粉碎加入到H2O中超声使其得到均一的混合溶液，而后将混合溶液与N2H4按体积比为50∶1的比例混合于120-122℃下反应12-12.5h，得到石墨烯。
微生物生物印迹薄膜的制备方法，在导电基体上沉积厚度为15-20μm的壳聚糖/石墨烯复合膜，再将微生物吸附到复合膜上形成微生物模板，而后采用壳聚糖将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋，包埋后通过氟硅烷偶联剂对导电基体进行表面修饰，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后将微生物模板洗脱掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形状相匹配的生物识别位点的微生物生物印迹薄膜。
所述石墨烯/壳聚糖复合膜的沉积，将浓度为0.3mg mL-1的石墨烯与质量分数为0.5％的壳聚糖溶液混合，采用恒电位沉积，以-1.2V电压下于导电基体上沉积250-350s，即可得到均匀的石墨烯/壳聚糖复合膜。
所述石墨烯按如下步骤制备：
1)将天然石墨、NaNO3和浓硫酸按体积比1∶1∶45的比例混合于冰水浴中反应4-4.5h，待用；
2)向步骤1)冰水浴混合物中加入KMnO4，同时将反应温度升至35℃并保持反应温度2-2.5h，而后加入H2O并将温度升至98℃，反应进行2-2.5小时后再加入40-60℃温水和30mL H2O2，并在室温下继续反应1-1.5h，待用；
3)将步骤2)所得物质洗涤后烘干，并粉碎加入到H2O中超声使其得到均一的混合溶液，而后将混合溶液与N2H4按体积比为50∶1的比例混合于120-122℃下反应12-12.5h，得到石墨烯。
所述微生物模板的吸附，将微生物溶液滴加石墨烯/壳聚糖复合膜表面，并加入PBS缓冲液后，置于4℃下2h，使微生物吸附到复合膜的表面。所述壳聚糖膜的包埋，将质量分数为0.5％的壳聚糖溶液采用恒电位沉积法，以-1.2V沉积30-40s，将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋。所述导电基体为ITO电极或者FTO电极。
本发明所具有的优点：本发明中采用石墨烯/壳聚糖复合膜作为微生物吸附的载体，石墨烯的加入增强了该复合膜的导电性，壳聚糖分子增加了该薄膜的生物相容性。且使用的沉积条件温和，可控，易于操作。使用该种方法制备的微生物生物印迹薄膜具有一定的选择性，对于形状和尺寸不同的微生物能很好的区分。
附图说明
图1.为本发明实施例提供的生物印迹薄膜的制备流程图。
图2.为本发明实施例提供的生物印迹薄膜生物印迹位点的原子力显微镜照片。
图3.为本发明实施例提供的制备方法对不同形状的细菌的选择性结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
石墨烯的制备步骤：
将1g天然石墨，1g NaNO3和46mL浓硫酸(98％)混合在冰水浴中反应4-5h。然后将6g KMnO4加入到混合物溶液中同时将温度升至35℃并保持反应温度，反应进行2-3h后加入90-95mL H2O并将温度升至98℃，反应进行两小时后加入200mL温水，20mL 30％的H2O2，并在室温下继续反应1-2h.整个反应过程中要始终保持搅拌。将制备得到的产物过滤，在使用蒸馏水洗涤之后在60℃的烘箱中干燥24-48h，得到黄色固体。将该反应产物研磨碎后，称取0.1g加入到100mL的H2O中超声1-2h，得到均一的混合溶液，加入2-3mL N2H4后分装在反应釜中在121℃下反应10-12h，得到石墨烯材料。
实施例2
微生物生物印迹薄膜的制备步骤(见图1)：
1)ITO电极的切割与清洗。将ITO电极用玻璃刀切割为均匀大小的玻璃片(1×4cm)，然后置于烧杯中依次加入无水乙醇和超纯水，分别超声处理30分钟，取出后用万用表测出导电面，晾干，备用；
2)石墨烯/壳聚糖复合膜载体的沉积。将实施例1中制备得到的石墨烯离心清洗后加入到质量分数为0.5％的壳聚糖溶液中，得到含石墨烯浓度为0.3mg mL-1石墨烯/壳聚糖混合液。采用恒电位沉积方法，使用三电极体系，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，以步骤1)中的ITO电极为工作电极，在-1.2V左右沉积250-350s，即可得到均匀的石墨烯/壳聚糖复合膜，将复合膜晾干，备用；
3)微生物模板的吸附。取微生物溶液滴加到步骤2)中制备好的石墨烯/壳聚糖复合膜表面(细菌在滴加之前要通过离心进行洗涤，去除其中的代谢产物和培养基，是微生物很好的分散)，置于干净的培养皿中，加入少量PBS缓冲液后，置于4℃下2h，使微生物吸附到复合膜的表面；本实施例微生物溶液采用取10μL含有107cfu mL-1的杆状细菌溶液。
4)壳聚糖膜的二次沉积，在质量分数为0.5％的壳聚糖溶液中，采用恒电位沉积方法，使用三电极体系，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，以步骤3)中制备的吸附有微生物的ITO电极为工作电极，在-1.2V左右沉积30-40s，将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋(壳聚糖厚度控制在250-300nm，SRB高度约为500nm)；
5)生物印迹膜的表面修饰。为减少使用过程中微生物在非生物印迹位点的吸附，将步骤4)制备好的包埋有微生物的ITO电极片，浸泡在质量分数为0.1％的氟硅烷偶联剂(氟硅烷偶联剂用超纯水和异丙醇配置，且需要现配现用)中，在表面修饰含有氟硅烷的基团；
6)微生物模板的洗脱。将步骤5)中制备的经表面修饰过的ITO电极浸泡在丙酮中2-3h，将微生物模板洗脱掉，留下有微生物模板分子尺寸和形状相匹配的生物识别位点(见图2)。
实施例3
微生物生物印迹薄膜的选择性评价：
通过电化学阻抗法对实施例2中得到的微生物生物印迹薄膜的选择性进行评价。采用三电极体系，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，以实施例2)中制备的有微生物生物印迹薄膜的ITO电极为工作电极，使用含有5mM[Fe(CN)6]4-/3-的0.2M PBS(pH 7.4)缓冲液为电解液。电化学阻抗谱的试验参数设置为开路电位下进行测量，正弦波的振幅为10mV，频率范围从0.1HZ到100kHZ。分别取相同浓度的杆状细菌和球状细菌滴加到实施例2中得到的修饰有微生物生物印迹识别位点的ITO电极上。通过测量滴加前后得到的电化学阻抗谱，并对这些谱图进行拟合处理，得到微生物加入前后阻抗的变化量(见图3)。实验结果显示由于模板采用的是杆状细菌，所以该薄膜对杆状细菌的响应要大于球状细菌，说明该薄膜表现出一定的选择性。
Claims (10)
1.一种微生物生物印迹薄膜，其特征在于：导电基体依次沉积壳聚糖/石墨烯复合膜、微生物模板和壳聚糖膜即得到微生物生物印迹薄膜。
2.按权利要求1所述的微生物生物印迹薄膜，其特征在于：所述导电基体沉积厚度为15-20μm的壳聚糖/石墨烯复合膜，将微生物吸附到复合膜上形成微生物模板，而后采用壳聚糖将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋，微生物高度约即得到微生物生物印迹薄膜。
3.按权利要求2所述的微生物生物印迹薄膜，其特征在于：将上述得到的微生物生物印迹薄膜通过氟硅烷偶联剂进行表面修饰，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后将微生物模板洗脱掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形状相匹配的生物识别位点的微生物生物印迹薄膜。
4.按权利要求1或2所述的微生物生物印迹薄膜，其特征在于：所述壳聚糖/石墨烯为浓度为0.3mg mL-1的石墨烯与质量分数为0.5％的壳聚糖溶液的混合液，其中石墨烯按如下步骤制备：
1)将天然石墨、NaNO3和浓硫酸按体积比1∶1∶45的比例混合于冰水浴中反应4-4.5h，待用；
2)向步骤1)冰水浴混合物中加入KMnO4，同时将反应温度升至35℃并保持反应温度2-2.5h，而后加入H2O并将温度升至98℃，反应进行2-2.5小时后再加入40-60℃温水和30mL H2O2，并在室温下继续反应1-1.5h，待用；
3)将步骤2)所得物质洗涤后烘干，并粉碎加入到H2O中超声使其得到均一的混合溶液，而后将混合溶液与N2H4按体积比为50∶1的比例混合于120-122℃下反应12-12.5h，得到石墨烯。
5.一种权利要求1所述的微生物生物印迹薄膜的制备方法，其特征在于：在导电基体上沉积厚度为15-20μm的壳聚糖/石墨烯复合膜，再将微生物吸附到复合膜上形成微生物模板，而后采用壳聚糖将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋，包埋后通过氟硅烷偶联剂对导电基体进行表面修饰，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后将微生物模板洗脱掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形状相匹配的生物识别位点的微生物生物印迹薄膜。
6.按权利要求5所述的微生物生物印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述石墨烯/壳聚糖复合膜的沉积，将浓度为0.3mg mL-1的石墨烯与质量分数为0.5％的壳聚糖溶液混合，采用恒电位沉积，以-1.2V电压下于导电基体上沉积250-350s，即可得到均匀的石墨烯/壳聚糖复合膜。
7.按权利要求6所述的微生物生物印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述石墨烯按如下步骤制备：
1)将天然石墨、NaNO3和浓硫酸按体积比1∶1∶45的比例混合于冰水浴中反应4-4.5h，待用；
2)向步骤1)冰水浴混合物中加入KMnO4，同时将反应温度升至35℃并保持反应温度2-2.5h，而后加入H2O并将温度升至98℃，反应进行2-2.5小时后再加入40-60℃温水和30mL H2O2，并在室温下继续反应1-1.5h，待用；
3)将步骤2)所得物质洗涤后烘干，并粉碎加入到H2O中超声使其得到均一的混合溶液，而后将混合溶液与N2H4按体积比为50∶1的比例混合于120-122℃下反应12-12.5h，得到石墨烯。
8.按权利要求5所述的微生物生物印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述微生物模板的吸附，将微生物溶液滴加石墨烯/壳聚糖复合膜表面，并加入PBS缓冲液后，置于4℃下2h，使微生物吸附到复合膜的表面。
9.按权利要求5所述的微生物生物印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖膜的包埋，将质量分数为0.5％的壳聚糖溶液采用恒电位沉积法，以-1.2V沉积30-40s，将吸附在石墨烯/壳聚糖复合膜上的微生物部分包埋。
10.按权利要求5所述的微生物生物印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述导电基体为ITO电极或者FTO电极。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20140402 Termination date: 20171220 |