CN102721727B

CN102721727B - 基于分子印迹的电化学传感器、其制备方法和用途

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Publication number: CN102721727B
Application number: CN 201210230339
Authority: CN
Inventors: 吴丹; 魏琴; 李贺; 杜斌; 张勇; 马洪敏; 李燕; 辛强
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: CN102721727A

Abstract

本发明涉及一种基于分子印迹的电化学传感器、其制备方法和用途。所述基于分子印迹的电化学传感器包含工作电极、参比电极和对电极，其中，所述工作电极的基底电极为金电极，其表面修饰磺酸化石墨烯，晾干后在含有邻苯二胺和多巴胺的酸性缓冲溶液中聚合直至邻苯二胺的氧化峰电流下降为零，然后在硫酸介质中洗脱多巴胺，所述参比电极和对电极分别为饱和甘汞电极和铂丝电极。在最佳条件下，通过合适的洗脱方法制备出具有分子识别性能的分子印迹传感器，进而实现了多巴胺的快速分析检测。本发明基于分子印迹的电化学传感器对印迹分子具有快速响应、选择性好、灵敏度高等优点，达到了分子识别的目的，实现了抗坏血酸在较高浓度存在时对多巴胺的检测。

Description

基于分子印迹的电化学传感器、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种电化学传感器、其制备方法和用途，具体而言，本发明涉及一种基于分子印迹的电化学传感器、其制备方法和用途。

背景技术

多巴胺(DA)作为一种重要的神经递质，具有调节躯体活动、精神活动、内分泌和心血管活动的作用。低浓度的多巴胺会引起一些疾病和神经错乱，如精神分裂症、亨廷顿氏病和帕金森氏病。因此，建立起灵敏、准确、快速定量检测多巴胺的方法是非常必要的。通常情况下，多巴胺和抗坏血酸(AA)在中枢神经系统细胞外液及血清等体液中是共存的。抗坏血酸的氧化电位和多巴胺的氧化电位很相近。所以，在传统方法中AA经常会干扰多巴胺的测定。因此，提高工作电极对多巴胺的灵敏度和选择性是长久以来一直努力的方向。

测定多巴胺的方法如荧光、化学发光、电化学、分子印迹技术等不断涌现出来。在众多方法中，分子印迹技术通过对模板分子的高效选择性达到分子识别的目的，具有分子水平上的专一性，在色谱固定相、固相萃取、膜分离、免疫分析、化学传感器等多个领域显示出广阔的发展前景。对于分子印迹传感器的构建而言，分子印迹膜可以采用电聚合法在电极表面原位形成。

本发明在磺酸化石墨烯修饰的金电极上电聚合功能单体邻苯二胺和目标分子多巴胺，对影响多巴胺分子印迹传感器性能的因素进行了初步的探索，成功制备了基于分子印迹的电化学传感器。该传感器能在较高浓度的抗坏血酸存在下实现多巴胺的准确测定，具有较高的灵敏度和选择性，对肿瘤检测、农兽药残留检测、环境污染物检测等具有一定的参考价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基于分子印迹的电化学传感器，所述电化学传感器包含工作电极、参比电极和对电极，其中，所述工作电极的基底电极为金电极，其表面修饰磺酸化石墨烯，晾干后在含有邻苯二胺和多巴胺的酸性缓冲溶液中聚合直至邻苯二胺的氧化峰电流下降为零，然后在硫酸介质中洗脱多巴胺分子，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。

本发明的另一目的是提供所述基于分子印迹的电化学传感器的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)磺酸化石墨烯的合成；

(2)基于分子印迹的电化学传感器的工作电极的制备；

(3)基于分子印迹的电化学传感器的制备及工作曲线的制作。

其中，步骤(1)中所述磺酸化石墨烯的合成具体包括以下步骤：

①预还原：用硼氢化钠在80℃预还原氧化石墨烯1h，以除去多数含氧官能团；

②磺酸化：用磺胺酸的芳基重氮盐冰浴2h；

③彻底还原：用肼再去还原(100℃，24h)，用以除去剩余的含氧官能团。

将合成得到的磺酸化石墨烯分别配制成0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2.0mg·mL^-1的溶液，然后在金电极表面分别滴涂5μL的上述溶液，晾干后将电极放入铁氰化钾溶液中采用循环伏安法进行扫描，用于考察磺酸化石墨烯浓度对其电流值的影响。实验表明，合成得到的磺酸化石墨烯的浓度在0.9～1.1mg·mL^-1范围内时，其氧化峰电流值最大，导电性最好。

步骤(2)中所述基于分子印迹的电化学传感器的工作电极的制备具体包括以下步骤：

①将金电极表面进行抛光处理使其表面光洁，然后在电极表面滴涂上述步骤(1)合成的磺酸化石墨烯，以增强电极的电子传输能力；

②将上述修饰磺酸化石墨烯的金电极，与参比电极和对电极一起正确连接在电化学工作站上，以含邻苯二胺和多巴胺的醋酸-醋酸钠缓冲溶液为聚合底液，在扫描速度为100mV·s^-1、电位范围为0～0.8V时，用循环伏安法连续扫描120圈，至邻苯二胺的氧化峰电流下降为零，其中，所述邻苯二胺和多巴胺的摩尔比为4∶1～3∶1，当邻苯二胺的浓度较低时，即邻苯二胺单体与多巴胺模板分子比例较低时，在电极表面难于形成稳定的分子印迹膜；当邻苯二胺的浓度较高时，虽然在电极表面比较容易形成印迹膜，但却很难洗脱。所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为4.4～5.0，当酸度大于5.0时，在电极表面难于形成稳定的分子印迹膜；而当酸度小于4.4时，得到的分子印迹膜对模板分子的识别能力较低；

③将经过上述处理的修饰磺酸化石墨烯的金电极浸泡在0.5mol·L^-1的H₂SO₄中4～6h，洗脱上述分子印迹传感器中的印迹分子多巴胺，即可得到基于分子印迹的电化学传感器的工作电极。

步骤(3)中所述的基于分子印迹的电化学传感器的制备以及其工作曲线的制作包括如下步骤：

①将参比电极、对电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上以形成本发明的基于分子印迹电化学传感器，其中所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极；

②pH 7.4的PBS缓冲溶液(含0.1mol·L^-1 KCl作为支持电解质)作为底液，采用计时电流的方法测定不同多巴胺浓度下的电流值；绘制多巴胺分子的基于分子印迹传感器的工作曲线。

本发明的再一目的是提供所述基于分子印迹的电化学传感器在检测多巴胺含量中的用途。

本发明的有益成果：

(1)多巴胺分子的基于分子印迹传感器的制备，考察了聚合酸碱度的研究、功能单体与模板分子的比例、磺酸化石墨烯的浓度等影响分子印迹传感器性能的因素，优化出最佳的制备条件，通过合适的洗脱方法制备出具有分子识别性能的分子印迹传感器，进而通过电化学分析方法实现快速分析检测多巴胺的电化学传感器。

(2)多巴胺分子的基于分子印迹传感器的制备，对印迹分子具有快速响应、选择性好、灵敏度高等优点，达到了分子识别的目的，实现了抗坏血酸在较高浓度存在下对多巴胺的痕量检测。

附图说明

下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。

图1为多巴胺分子的基于分子印迹的电化学传感器在5mmol·L^-1铁氰化钾溶液中的循环伏安图。

图中标记：a-裸金电极的循环伏安；b-修饰磺酸化石墨烯的金电极的循环伏安；c-聚合后未洗脱的分子印迹免疫传感器的循环伏安图；d-洗脱后的基于分子印迹电化学免疫传感器的循环伏安图；e-重新结合印迹分子的电化学免疫传感器的循环伏安图。

从图1中可以看出，修饰磺酸化石墨烯的电极在K₃Fe(CN)₆溶液中其氧化电流(图1b)比裸金电极(图1a)要高，说明磺酸化石墨烯的确增强了电子的传输能力。由于形成了致密的非导电聚合膜，所以图1c没有明显的氧化还原峰。当多巴胺分子被洗脱下来时，会在在电极的表面形成空穴，增强了电子的传输能力，所以K₃Fe(CN)₆到达电极表面产生的峰电流变大(图1d)。当多巴胺通过氢键、疏水作用等作用力重新进入膜中与其结构相匹配的“空穴”，导致电极表面的“空穴”变少。因此经多巴胺溶液孵化过的印迹电极再于K₃Fe(CN)₆溶液中扫描时，峰电流又开始下降(图1e)。

具体实施方式

本发明使用的多巴胺购自上海晶纯试剂有限公司，邻苯二胺购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，肼购自天津富宇精细化工有限公司，抗坏血酸(AA)购自淄博化学试剂厂，铁氰化钾、碳酸钠和亚硝酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，硼氢化钠和对氨基苯磺酸购自中国上海试剂一厂。除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。

CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。

实施例1

(1)磺酸化石墨烯的合成

将37.5mg的氧化石墨分散到37.5g的水中。然后超声1h后得到棕色的氧化石墨烯悬浮液。

预还原：先用5wt％的碳酸钠溶液调节上述氧化石墨烯悬浮液的pH为9，将300mg NaBH₄溶解到7.5g水中，然后再将NaBH₄溶液加到氧化石墨烯悬浮液中。将混合物在80℃条件下不断搅拌1h。该还原过程在氮气气氛下进行。悬浮液由咖啡色变为黑色。在还原反应结束后看到聚集，用水离心和清洗2～3次之后，经过超声，将部分还原的氧化石墨烯分散在37.5g的水中，得到悬浮液；

磺酸化：23mg对氨基苯磺酸和9mg亚硝酸钠在5g水和0.25g 1mol·L^-1HCl中反应，冰浴中形成重氮盐。在冰浴且不断搅拌的条件下，向部分还原的氧化石墨烯悬浮液中加入上述重氮盐溶液，且保持冰浴2h。反应混合物通入氮气赶走气泡。反应结束后离心并用水清洗2～3次后，将磺酸化的氧化石墨烯分散到37.5g水中，得到悬浮液；

彻底还原：在之后的还原步骤中，把1g的肼(50％)滴到2.5g水中并加入到磺酸化步骤得到的悬浮液中，且反应混合物在不断搅拌的条件下保持100℃，24h。之后向混合物中加入5wt％的碳酸钠溶液用以沉淀磺酸化的石墨烯。在用水彻底清洗和真空干燥之后，得到磺酸化的石墨烯，通过超声将其均匀分散在水中以配制成1.0mg·mL^-1的磺酸化石墨烯溶液。

(2)基于分子印迹的电化学传感器的工作电极的制备

将金电极用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；

然后在电极表面滴涂5μL1.0mg·mL^-1磺酸化石墨烯，晾干待用；

以含0.04mg·mL^-1邻苯二胺和0.01mg·mL^-1多巴胺(二者的摩尔比为4∶1)的10mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.4)为聚合底液，在扫描速度为100mV·s^-1、电位范围为0～0.8V时，将上述修饰磺酸化石墨烯的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，正确连接在电化学工作站上；

用循环伏安法连续扫描120圈，至邻苯二胺的氧化峰电流下降为零；

将上述处理后的金电极浸泡在0.5mol·L^-1的H₂SO₄中4h，洗脱上述分子印迹传感器中的印迹分子，即可得到基于分子印迹的电化学传感器的工作电极。

(3)基于分子印迹的电化学传感器的制备及工作曲线的制作

将参比电极-饱和甘汞电极、对电极-铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；

10mL pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，在底液中每隔50s连续加入10μL 0.5mg·mL^-1的多巴胺，采用计时电流法分别测定电流变化值；

测定结果表明，多巴胺分子印迹传感器在0.5～7.0mg·L^-1范围内成线性关系，检出限为0.14mg·L^-1。

实施例2

(1)磺酸化石墨烯的合成

预还原：先用5wt％的碳酸钠调节上述氧化石墨烯悬浮液的pH为10，将300mg NaBH₄溶解到7.5g水中，然后再将NaBH₄溶液加到上述氧化石墨烯悬浮液中。将混合物在80℃条件下不断搅拌1h。该还原过程在氮气气氛下进行。悬浮液由咖啡色变为黑色。在还原反应结束后看到聚集，用水离心和清洗2～3次之后，经过超声，将部分还原的氧化石墨烯分散在37.5g的水中，得到悬浮液；

磺酸化：23mg对氨基苯磺酸和9mg亚硝酸钠在5g水和0.25g 1mol·L^-1HCl中反应，冰浴下形成重氮盐。在冰浴且不断搅拌的条件下，向部分还原的氧化石墨烯悬浮液中加入上述重氮盐溶液，且保持冰浴2h。反应混合物通入氮气赶走气泡。反应结束后离心并用水清洗2～3次后，将磺酸化的氧化石墨烯分散到37.5g水中，得到悬浮液；

彻底还原：在之后的还原步骤中，把1g的肼(50％)滴到2.5g水中并加入到磺酸化步骤得到的悬浮液中，且反应混合物在不断搅拌的条件下保持100℃，24h。之后向混合物中加入5wt％的碳酸钠溶液用以沉淀磺酸化的石墨烯。在用水彻底清洗和真空干燥之后，得到磺酸化的石墨烯，通过超声将其均匀分散在水中以配制成0.9mg·mL^-1的磺酸化石墨烯溶液。

(2)基于分子印迹的电化学传感器的工作电极的制备将金电极用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；

然后在电极表面滴涂5μL 0.9mg·mL^-1磺酸化石墨烯，晾干待用；

以含0.03mg·mL^-1邻苯二胺和0.01mg·mL^-1多巴胺(二者的摩尔比为3∶1)的10mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝5.0)为聚合底液，在扫描速度为100mV·s^-1、电位范围为0～0.8V时，将上述修饰磺酸化石墨烯的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，正确连接在电化学工作站上；

将上述处理的金电极浸泡在0.5mol·L^-1的H₂SO₄中6h，洗脱上述分子印迹传感器中的印迹分子，即可得到基于分子印迹的电化学传感器的工作电极。

(3)将参比电极-饱和甘汞电极、对电极-铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；

10mL pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，在底液中每隔50s连续加入10μL 0.5mg·mL^-1的多巴胺和10μL 25mg·mL^-1的抗坏血酸，采用计时电流法分别测定电流变化值；

测定结果表明，当抗坏血酸的存在浓度为多巴胺浓度的50倍时，多巴胺分子印迹传感器在0.5～7.0mg·L^-1范围依然呈现成良好的线性关系。进一步说明本方法具有较强的选择性，可以实现抗坏血酸在较高浓度存在时多巴胺的测定。同时对人血清中的多巴胺进行了加标回收实验，得到的回收率在94.5～106％范围之内，说明本发明的制备方法得到的电化学传感器具有较高的准确度。

Claims

1.一种基于分子印迹的电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器用于检测多巴胺含量，包含工作电极、参比电极和对电极，其中，所述工作电极的基底电极为金电极，其表面修饰磺酸化石墨烯，晾干后在含有邻苯二胺和多巴胺的酸性缓冲溶液中聚合直至邻苯二胺的氧化峰电流下降为零，然后在硫酸介质中洗脱多巴胺分子，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极；

其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）磺酸化石墨烯的合成；

（2）基于分子印迹的电化学传感器的工作电极的制备；

（3）基于分子印迹的电化学传感器的制备及工作曲线的制作；

其中，步骤（1）中所述磺酸化石墨烯的合成包括以下步骤：

① 预还原：用硼氢化钠在80^◦C预还原氧化石墨烯1 h，以除去多数含氧官能团；

② 磺酸化：用磺胺酸的芳基重氮盐冰浴2 h；

③ 彻底还原：在100^◦C用肼再去还原24 h，用以除去剩余的含氧官能团；

将所述磺酸化石墨烯配制为浓度在0.9～1.1 mg∙mL^-1范围；

步骤（2）中所述基于分子印迹的电化学传感器的工作电极的制备包括以下步骤：

① 将金电极表面进行抛光处理使其表面光洁，然后在电极表面滴涂上述步骤（1）合成的磺酸化石墨烯；

② 将上述修饰磺酸化石墨烯的金电极，与参比电极和对电极一起正确连接在电化学工作站上，以含邻苯二胺和多巴胺的醋酸-醋酸钠缓冲溶液为聚合底液，在扫描速度为100mV∙s^-1、电位范围为0～0.8 V时，用循环伏安法连续扫描120圈，至邻苯二胺的氧化峰电流下降为零；

③ 将经过上述处理的修饰磺酸化石墨烯的金电极浸泡在0.5 mol∙L^-1的H₂SO₄中4~6 h，洗脱上述分子印迹传感器中的印迹分子多巴胺，即可得到基于分子印迹的电化学传感器的工作电极；

所述邻苯二胺和多巴胺的摩尔比为4 : 1~3 : 1，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为4.4～5.0。

步骤（3）中所述的基于分子印迹的电化学传感器的制备以及其工作曲线的制作包括如下步骤：

① 将参比电极、对电极和上述步骤（2）制备的工作电极正确连接在电化学工作站上以形成基于分子印迹电化学传感器，其中所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极；

② pH 7.4的含0.1 mol∙L^-1KCl作为支持电解质的PBS缓冲溶液作为底液，采用计时电流的方法测定不同多巴胺浓度下的电流值；绘制多巴胺分子的基于分子印迹传感器的工作曲线。