CN101230341A - 喷雾干燥的酶产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有酶和生物质的颗粒;及一种制备颗粒的方法,包括将含有酶和生物质的发酵肉汤原料喷雾干燥,得到含有酶和生物质的固体颗粒;还涉及一种制备含有酶的颗粒的方法,包括将含有酶的水性液体原料喷雾干燥,得到喷雾干燥的第一含酶颗粒,随后使此第一干燥颗粒经过选自制粒、包衣和其组合的过程得到第二干燥的含酶颗粒。
Description
本案是申请日2000年9月29日,申请号00814580.6,发明名称“喷雾干燥的酶产品”的分案申请。
技术领域
本发明涉及含酶的颗粒、制备含酶的颗粒的方法,及含酶的颗粒在组合物中的用途和此颗粒及组合物的应用。
背景技术
在许多工业和应用方面,酶产品都是已知和有用的。
已知的提供干燥微粒状酶产品的技术包括:
-喷雾干燥产品,记载在Michael S.Showell(编辑)的:《粉末状去污剂》(Powdered detergents)中;表面活性剂科学丛书(SurfactantScience Series);1998;vol.71;140-142页;Marcel Dekker和GB1,360,969。
-分层产品,如WO 97/23606和US 5,814,501记载的。
工业和应用渴求和必需的生物学化合物例如酶的改良的性质,导致了复合微粒酶产品的发展,这是一项有许多挑战性难题的任务。产品的制备过程和加工所用组分及化学药品应是价廉的,但也应为酶产品提供理想的性能,如改进的酶储存稳定性、低起尘特性、改良的颗粒机械强度、理想的颜色、形状和大小。
发明概述
本发明第一方面涉及制备一种颗粒的方法,包括使含有酶和生物质的发酵肉汤原料喷雾干燥,以得到含有酶和生物质的固体颗粒。
第二方面,本发明涉及一种制备含有酶的颗粒的方法,包括使含有酶的水性液体原料喷雾干燥,得到喷雾干燥的第一含酶颗粒,随后使此第一干燥颗粒经过选自制粒、包衣和二者的组合的工艺,得到第二干燥的含酶颗粒。
在其它方面,本发明也提供了含有酶和生物质的颗粒、含有这些颗粒的组合物及使用这些颗粒和组合物的方法。
本发明提供了制备性质优良的干燥酶颗粒的简单而廉价的方法。
定义
本发明上下文使用的术语“发酵肉汤”应理解为水性组合物,含有酶和微生物细胞和/或其细胞碎片,这些细胞在发酵过程中产生了酶。
本发明上下文使用的术语“细胞碎片”应理解为发酵过的微生物细胞的不溶解部分,包括从细胞扩展的结构,如从真菌细胞扩展的菌丝体。
本发明上下文使用的术语“生物质(biomass)”应理解为微生物细胞、细胞碎片或其组合的同义词。
本发明上下文使用的术语“发酵滤液”应理解为除去了微生物细胞和细胞碎片的发酵肉汤。
本发明上下文使用的术语“酶浓缩物”应理解为已经过加工提高了酶浓度的发酵滤液。
本发明上下文使用的术语“SPAN”(跨度)应理解为颗粒大小分布(PSD)的宽度,表示为:
SPAN=(D90-D10)/D50
PSD可以用各颗粒的质量平均直径表示。D50表示的平均直径是50%重量的颗粒具有小于此值的直径,50%重量的颗粒具有大于此值的直径。值D10和D90表示的直径值指分别有10%和90%重量的颗粒,具有比所述的值小的直径。
术语“Rayleigh雾化器”应理解为能产生有低SPAN值的液滴的雾化器(通常可以得到的SPAN值低于1.5,例如在0.9-1.3之间),所述的雾化器其特征是包含喷雾部分和表面部分,表面部分包括至少一个孔洞。在一个优选实施方案中,Rayleigh雾化器是旋转雾化装置,在其中将液体分散到旋转的有孔洞的空圆柱体的内表面,从而将液体雾化,液体从孔洞穿过圆柱体,形成液滴。WO 94/21383的权利要求9-30和图1-18记载了此雾化器,权利要求1-8记载了雾化的方法,将所有的内容引入本文作为参考。
发明详述
微生物
使之发酵产生含有酶和生物质的发酵肉汤的微生物细胞或微生物体可以是任何适于发酵的微生物。
微生物包括单细胞微生物,例如原核生物,或非单细胞微生物,例如真核生物。
有用的单细胞类的细胞是细菌细胞,例如革兰氏阳性细菌,包括担不局限于:芽孢杆菌属(Bacillus)细胞,例如,Bacillus alkalophilus,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);或链霉菌属(Streptomyces)细胞,如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus);或革兰氏阴性细菌,如大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌。在一优选实施方案中,细菌类的微生物是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、Bacillus clausii、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。在另一优选实施方案中,芽孢杆菌属(Bacillus)细胞是一种嗜碱性芽孢杆菌细胞。
微生物也可以是真核生物,如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。在另一优选实施方案中,微生物是真菌细胞。此处用“真菌”包括phylaAscomycota,Basidiomycota,Chytridiomycota和Zygomycota(其定义见Hawksworth等,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cabridge,UK)以及Oomycota(见Hawksworth等,1995,同上,第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等,1995,见上)。
在一个更优选的实施方案中,该真菌微生物是酵母细胞。这里所用“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。因为酵母的分类将来可能改变,为了本发明的目的,酵母应按《酵母的生物学和活性》(Biology andActivities of Yeast)(Skinner,F.A.Passmore,S.M.和Davenport,R.R.编著,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中的描述来定义。
在一个甚至更优选的实施方案中,该酵母微生物是假丝酵母属(candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。
在一个最优选实施方案中,该酵母微生物是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergernsis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、糖化酵母(S.diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(S.kluyveri)、诺地酵母(S.norbensis)或Saccharomyces oviformis细胞。在另一个最优选的实施方案中,该酵母微生物是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中,该酵母微生物是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一个更优选的实施方案中,该真菌微生物是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和Oomycota的所有丝状类型(正如Hawksworth等,1995,见上,所定义的)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的,碳代谢为专性需氧的。相反,酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽来进行的,而且碳代谢可以通过发酵进行。
在一个甚至更优选的实施方案中,该丝状真菌微生物是但不限于支顶孢(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的种的细胞。
在一个最优选的实施方案中,该丝状真菌微生物是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)或米曲霉(A.oryzae)细胞。在另一个最优选的实施方案中,该丝状真菌微生物是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminearum)、禾赤镰孢(F.graminum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、合欢木镰孢(F.negundi)、尖镰孢(F.oxysporum)、多枝镰孢(F.reticulatum)、粉红镰孢(F.roseum)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、肤色镰孢(F.sarcochrom)、拟分枝孢镰孢(F.sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum细胞。
在另一个最优选的实施方案中,该丝状真菌微生物是Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。
本发明也包含上述微生物的变种,其是用常规的基因操作方法通过改变所述微生物遗传物质而获得的,这样将编码酶的外来核苷酸序列插入到所述微生物中。
酶
本申请上下文使用的酶可以是能够通过发酵得到的任何酶或不同酶的组合。相应地,当提到“酶”时,通常应理解为包括单一的酶和一种以上的酶的组合。
应理解的是:术语“酶”包括酶的变体(例如用重组技术制备的)。这些酶的变体的例子记载于以下文献中:例如EP 251,446(Genencor),WO 91/00345(Novo Nordisk),EP 525,610(Solvay)和WO94/02618(Gist-Brocades NV)。本说明书和权利要求书中使用的酶的分类法与学术出版公司1992年出版的《生物化学和分子生物学国际联合会命名委员会的建议(1992)》一致(Recommendations(1992)of theNomenclature Committee of the International Union of Biochemistryand Molecular Biology,Academic Press,Inc.1992)。
相应地,适用于本发明的酶产品中的酶的种类包括氧化还原酶(EC1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂解酶(EC4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
本申请上下文中的优选的氧化还原酶是过氧化物酶(EC 1.11.1),例如haloperoxidase、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4),而优选的转移酶是以下任何亚类中的转移酶:
a)转移一碳基团的转移酶(EC 2.1);
b)转移醛或酮残基的转移酶(EC 2.2);酰基转移酶(EC 2.3);
c)糖基转移酶(EC 2.4);
d)转移烷基或芳香基而不包括非甲基的转移酶,(EC 2.5);和
e)转移含氮基团的转移酶(EC 2.6)。
本发明的最优选类型的转移酶是转谷氨酰胺酶(蛋白质-谷酰胺γ-谷氨酰转移酶;EC 2.3.2.13)。
适当的转谷氨酰胺酶的进一步的例子记载于WO 96/06931(NovoNordisk A/S)。
本发明的优选的水解酶是:羧基酯水解酶(EC 3.1.1.-)例如脂肪酶(EC 3.1.1.3);植酸酶(EC 3.1.3.-),例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26);糖苷酶(EC 3.2,它归为本文称为“糖酶”的组的范围中),例如α淀粉酶(EC 3.2.1.1);肽酶(EC 3.4,也称为蛋白酶);和其他的羰基水解酶。
在本文中,用术语“糖酶”不仅表示能使尤其是五元环和六元环结构的碳水化合物链(例如淀粉)断开的酶(即糖苷酶,EC 3.2),也包括能使糖产生异构的酶,例如,六元环结构如D-葡萄糖转化成五元环结构如D-果糖。
相关的糖酶包括以下各种(EC号在括号内):α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纤维素酶(3.2.1.4)、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、内切-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、壳多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1,4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖内切-1,3-β-D-葡萄糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精内切-1,6-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡萄糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖内切-1,3-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖内切-1,6-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶(arabinosidases)(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、脱乙酰壳多糖酶(chitosanases)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。
市售可获得的氧化还原酶(EC 1.-.-.-)的例子包括GluzymeTM(可以从Novo Nordisk A/S得到的酶)。
市售可获得的蛋白酶(肽酶)包括KannaseTM、EverlaseTM、EsperaseTM、AlcalaseTM、NeutraseTM、DurazymTM、SavinaseTM、PyraseTM、PancreaticTrypsin NOVO(PTN)、Bio-FeedTM Pro和Clear-LensTMPro(所有都可以从Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,Denmark获得)。
其他商业可获得的蛋白酶包括MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、OpticleanTM和PurafectTM(能够从Genencor International公司或Gist-Brocades得到)。
市售可获得的脂酶的例子包括LipoprimeTM、LipolaseTM、LipolaseTMUltra、LipozymeTM、PalataseTM、NovozymTM 435和LecitaseTM(所有都可以从Novo NordiskA/S得到)。其他市售可获得的脂酶包括LumafastTM(从Genencor International Inc.获得的门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)脂酶);LipomaxTM(从Gist Brocades/Genencor Int.Inc.获得的类产碱假单胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂酶;和从Solvay enzymes得到的芽胞杆菌属(Bacilluss p.)脂酶)。
市售可获得的糖酶的例子包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTM Alpha、Bio-FeedTM Beta、Bio FeedTM Plus、Bio-FeedTM Plus、NovozymeTM188、CelluclastTM、CellusoftTM、CeremylTM、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、FinizyTM、FungamylTM、GamanaseTM、GlucanexTM、LactozyTM、MaltogenaseTM、PentepanTM、PectinexTM、PromozymeTM、PulpzymeTM、NovamylTM、TermamylTM、AMGTM(Amyloglucosidase Novo)、MaltogenaseTM、SweetzymeTM和AquazymTM(所有都可以从Novo Nordisk A/S得到)。
可以通过在同一发酵肉汤中同时发酵2种或多种酶并在本发明的方法中使用此液体或其加工过的液体作为原料而得到酶的组合。或者可以通过分别发酵各种酶并使用不同发酵肉汤和/或其加工过的液体的混合物作为本发明方法的原料,得到酶的组合。
发酵肉汤和含有酶的液体
本发明所述方法根据该方法的步骤采用发酵肉汤或含有酶的液体作为原料。
如上所述,本发明的第一方面,原料是发酵肉汤并且此方法包括将所述的发酵肉汤喷雾干燥的步骤。依照本发明,此处定义的发酵肉汤含有微生物细胞和/或其细胞碎片(生物质)。可以在喷雾干燥前除去一些生物质以优化肉汤的性质和对喷雾干燥的适应性,例如调整粘稠度。然而,除去的生物质越多,方法将越昂贵。相应地,在一个优选实施方案中,发酵肉汤含有至少10%生物质,更优选至少50%,甚至更优选至少75%,最优选至少90%或至少95%从发酵得到的生物质。在另一优选实施方案中,肉汤含有0-31%w/w的干物质,优选0-20%w/w,更优选0-15%w/w,例如10-15%w/w干物质,而此范围应排除0%干物质。生物质可以构成不超过90%w/w的干物质,优选不超过75%w/w,更优选不超过50%w/w干物质,而酶可以构成不超过50%w/w的干物质,优选不超过25%w/w,更优选不超过10%w/w干物质。
在本发明第一方面的另一优选实施方案中,喷雾干燥前除去发酵肉汤原料中的粗颗粒或物体如稻草、碎石、大豆碎粒和其它不能溶解的非生物质。这些粗颗粒或物体可以来源于添加物,例如发酵中加入的营养物。可以通过过滤、沉降、离心和/或倾析肉汤而除去粗颗粒或物体。此过程称为除渣。
在本发明的第二方面,原料是含有酶的液体,此方法包括将所述的含有酶的液体喷雾干燥以得到第一干燥的含酶颗粒,随后使此第一干燥颗粒经过第二加工步骤得到第二干燥的含酶颗粒。
将要根据本发明的第二方面进行干燥的原料,优选为水性液体,例如一或多种酶的水性溶液或分散体。
在本发明的第二方面的一个优选实施方案中,原料是发酵肉汤,或已经过一或多个加工步骤的发酵肉汤,例如上述定义的发酵滤液或所酶浓缩物。
可以用已知方法,例如过滤、离心、絮凝和这些方法的结合从发酵肉汤中除去生物质得到发酵滤液。
可以加工发酵滤液得到酶浓缩物。此加工包括蒸发溶剂(如水)、超滤以降低水和低分子组分的含量,将发酵滤液中的酶提取到第二溶液中。也可以通过柱层析进行纯化,例如将发酵滤液泵过一个含有树脂的柱,使酶以比滤液中的水、盐或其他组分慢或快的速度通过。
在本发明的第一和第二方面,喷雾干燥前,在本发明的原料中可以加入改善由此得到的含酶的干燥粉末或产品的性质的材料。有用的添加剂包括选自盐、无机矿物质或粘土、碳水化物、着色剂、纤维素或其衍生物、杀虫剂、分散剂、防泡剂、粘度调节剂、酸性试剂、碱性试剂、酶稳定剂、酶抑制剂、粘合剂、其他的酶及其组合的材料。加入无机盐如碱和碱土的氯化物盐、硫酸盐、硝酸盐和碳酸盐,例如钙盐,可以活化酶。可以用其他盐,尤其是硫酸钠或氯化钠作为填充材料。可以加入碳水化合物,如蔗糖和/或淀粉,增加颗粒的强度和改善酶的稳定性。加入着色剂如二氧化钛可以为肉汤和最终微粒状的酶产品提供所需的颜色。加入纤维素可以为酶颗粒提供强度和弹性。加入稳定剂如甲硫氨酸或硫代硫酸盐可以保护酶,因而所得酶产品在本发明的加工和储存过程中不会失活。加入无机物和粘土,如沸石、高岭土、膨润土、滑石和/或硅酸盐可以为干燥的酶颗粒和形成的颗粒剂提供增加的紧密度。加入抑制剂,如硼酸蛋白酶抑制剂,可以降低酶的蛋白酶消化作用或自身消化作用而提高产量。加入杀虫剂,如Rodalon能控制微生物稳定性并可以减少最终产品的不良气味。加入酸或碱可以将pH控制在所需的水平。
在本发明的第一方面和第二方面,在喷雾干燥前,原料也可以经过物理处理,如加热和/或冷却和/或辐射肉汤及混合、通气或超声处理。
在本发明的一个重要的实施方案中,在喷雾干燥前,优选处理原料以杀死活的微生物细胞或处理原料使肉汤或液体中剩余的遗传物质如DNA(基因或质体)或其他多核苷酸水解或分解。
在本发明的第一方面,可以加入杀虫剂如Rodalon(氯化苯甲烃铵)、加热(巴氏灭菌法)或辐射以使肉汤消毒。在本发明的第二方面,对发酵滤液或酶浓缩物肉汤消毒,可以采用处理肉汤的同样的方法,或也可以通过除菌过滤达到。在所有情况下,可以用已知方法,如多核苷酸的酶消化达到遗传物质的分解。
对于许多应用,有用的含有酶的颗粒需要颗粒含有某一最小量的活性酶。相应地,在一优选实施方案中,原料应含有某一最小的液体中的酶浓度和/或酶应构成液体中固体(即,不挥发组分)的某一最小百分比,以通过本发明的方法产生有有用酶浓度的颗粒。我们意外地发现能提供直接产生有足够高的酶含量的发酵肉汤的发酵作用,以致可以直接将肉汤干燥,或通过除去生物质、灭菌及加入添加剂,仅最小程度进行精制得到酶含量足够高的干燥粉末,从而得到在大多数应用中有用的酶产品。进行任何进一步的精制过程前,本发明的发酵肉汤或发酵滤液中优选的酶含量为至少每升发酵肉汤液相中有3mg活性酶蛋白,更优选至少20mg/L,更优选至少50mg/L,最优选至少75mg/L,例如80mg/L或更多。
用于本发明方法的原料还应具有适于泵送液体的粘度,优选在5-5000cps范围。
干燥方法
本发明通过喷雾干燥方法干燥肉汤、滤液或浓缩物,该方法包括将肉汤、滤液或浓缩物通过雾化装置传送到干燥室中,其中雾化肉汤、滤液或浓缩物的液滴与空气气流混合,蒸发并除去液滴的挥发性部分,剩下干燥的含有酶的颗粒。
在本发明的一个优选实施方案中,通过一个泵送装置输送肉汤、滤液或浓缩物,并优选预热至5-150℃,优选50-120℃,更优选90-110℃。
雾化装置可以适当地选自高速转盘式雾化器(high speed rotatingdisk atomizers)、压力喷嘴雾化器(pressure nozzle atomizers)、气动喷嘴雾化器(pneumatic nozzle atomizers)或声波喷嘴雾化器(sonicnozzle atomizers),如1990年5月9日至11日由职业进步中心(Centerfor professional advancement)在阿姆斯特丹进行的微囊化专题讨论会会议材料(Course Material from the Microencapsulation Seminar)所提及的。
然而,能用其提供优等干燥的含酶颗粒的一种优选的特殊雾化器是Rayleigh雾化器,用它可得到颗粒的改进的性质,例如得到增强的机械强度、低起尘性(lower dusting)、窄的颗粒大小分布,即低的SPAN值和改良的球形体积。WO94/21383记载了一种这样的雾化器,将该文献合并于此作为参考。
喷雾干燥粉末通常具有10-15%重量的水含量,优选进一步干燥到更低的水含量,例如低于约5%w/w,其方法是通过将喷雾干燥颗粒输送到流化床干燥设备中,在其中由向上的气流使喷雾干燥颗粒保持流体化蒸发除去其中过量的水分,此气流优选加热并干燥的空气。
所得的喷雾干燥的固体含酶颗粒的性质取决于喷雾干燥条件和加入原料中的添加剂。在一些喷雾干燥方法中,在干燥步骤开始形成非常小的颗粒,随后在喷雾干燥结束时聚结或粘合在一起形成大的有些易碎的团块。这些聚结成块的颗粒优选有150-2000μm的平均直径或大小。在其他喷雾干燥方法中,例如使用WO 94/21383的雾化设备,会由于雾化器的特别的设计制备出更小的不聚结的更均匀的颗粒。这些颗粒一般有更好的起尘、强度和SPAN性质且平均大小优选落在50-300μm的范围内,更优选在100-200μm范围内。
优选的喷雾干燥方法产生窄的大小分布,即窄的SPAN值。优选地,SPAN值低于约2.5,更优选低于约2.0,更优选低于约1.5,最优选低于约1.0。
干燥颗粒的加工
本发明第二方面的(上述)方法需要第一喷雾干燥颗粒随后经过选自制粒、包衣及其组合的工艺得到第二干燥的含酶颗粒。制粒工艺包括混合制粒、造粒、挤出、流化床和压紧工艺。
然而本发明也包括这样的方法,其中由喷雾干燥发酵肉汤得到的颗粒随后经过选自制粒、包衣及其组合的工艺。
此进一步的加工改进含酶颗粒的性质。
混合制粒
混合制粒(mixer granulation)工艺包括将喷雾干燥的含有酶的颗粒与水及选自粘合剂、纤维、盐、水不溶性矿物质、色素、酶稳定剂或其组合的组分混合。加入足量的水使固体组分聚结成有所需的平均大小的颗粒。
粘合剂包括有高熔点或无熔点和具有非蜡性质的粘合剂,例如聚乙烯吡咯烷酮、糊精、聚乙烯醇、纤维素衍生物,例如羟丙基纤维素、甲基纤维素或CMC。一种适宜的粘合剂是碳水化合物类粘合剂,如能从法国Roquette Freres得到的Glucidex 21D。
纤维包括纤维形式的纯和/或不纯的纤维素,例如锯屑、纯纤维性纤维素、棉或其他形式的纯或不纯的纤维性纤维素。也可以使用以纤维性纤维素为基质的助滤剂。市场上有一些纤维形式的纤维素的商标例如CEPO和ARBOCELL。在一个Svenska Tramjolsfabrikerna AB的出版物“Cepo纤维素粉末”中,对于Cepo S/20纤维素,声称大致最大纤维长度是500μm,大致平均纤维长度是160μm,大致最大纤维宽度是50μm,大致平均纤维宽度是30μm。它还声称CEPO SS/200纤维素的大致最大纤维长度150μm,大致平均纤维长度50μm,大致最大纤维宽度45μm,大致平均纤维宽度25μm。有这些尺寸的纤维素纤维非常适于本发明的目的。词“Cepo”和“Arbocel”是商标。优选的纤维性纤维素是ArbocelTMBFC200。也可以使用EP 304331 B1记载的合成纤维,典型的纤维可以用聚乙烯、聚丙烯、聚酯,尤其是尼龙、聚甲酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸化合物制成。
盐包括水溶性和/或不溶性盐,例如碱金属和/或碱土金属的硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐和磷酸盐。
水不溶性矿物质包括沸石、粘土如高岭土和膨润土、滑石和/或硅酸盐。
色素包括二氧化钛。
酶稳定剂包括碱性或中性材料、还原剂、抗氧化剂和/或第一过渡系列金属离子的盐。它们各自可以与其它同类或不同类的保护剂联合使用。碱性稳定剂的例子是通过活跃地中和例如氧化剂提供化学清除效果的碱金属硅酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐。还原性保护剂的例子是亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐或硫代硫酸盐,抗氧化剂的例子是甲硫氨酸、丁基化羟基甲苯(BHT)或丁基化羟基苯甲醚(BHA)。最优选的稳定剂是硫代硫酸盐,例如硫代硫酸钠。本领域技术人员可以从例如US 4,106,991(NOVO NORDISK)和相关的文献EP 170360 B1(NOVO NORDISK)、EP 304332 B1(NOVONORDISK)、EP 304331(NOVO NORDISK)、WO 90/09440(NOMO NORDISK)和WO 90/09428(NOVO NORDISK)得知混合制粒方法,在这些文献中,向喷雾干燥的含酶颗粒加入水代替了加入本发明的液体酶浓缩物。混合制粒过程也包括US 4,661,452记载的所谓“球形造粒”(marumerizer)法,将该文献合并于此作为参考。
在一个优选实施方案中,将要在混合制粒法处理的含酶的混合物也可以含有微粒组分,其直径小于最终颗粒的直径。通过在该工艺中加入这样的微粒组分,会更易于控制大小和/或大小分布,如丹麦专利申请PA1999 01000(在本申请的申请日未公开)所述,将其结合于此作为参考。微粒组分可以是由可以保持微粒完整性(即在混合制粒过程中不碎裂)的无机或有机原料制成的团块。无机微粒组分可以是例如聚结的二氧化硅和/或盐。有机微粒复合物可以是天然化合物如聚结的碳水化合物,例如糖、淀粉糊精或可以是聚结的人造化合物或聚合物。然而优选的微粒复合物是植物粉。在本发明的范围内,术语“植物粉”包括所有天然来源的(粉的来源)固体植物原料通过减小大小(研磨)而获得的粉状的产品。本发明的方法使用研磨谷粒、豆类和/或锦葵科(Malvaceae)果实(如棉籽)得到的植物粉末是方便的。本发明的范围内可以作为粉末来源的谷类尤其是小麦或黑麦,还可以使用大麦、燕麦、稻和玉米及高粱和其他类的粟。虽然荞麦不是一种谷类(是一种软花属植物),但其山毛榉果实样产生粉末的部分也可以同样作为本发明范围内的粉末来源。在本发明的一种特定的变化中,豆类可以作为粉末的来源。此处豆类应理解为属于果实和蔬菜的植物类食物来源(豆类)。豆类如豌豆属(豌豆)、木豆属(Cajamus)(木豆),鹰嘴豆属(鹰嘴豆)、兵豆属(兵豆)、菜豆属(草豆)、豇豆属(豇豆)、Dolchius(lablab bean)、Cassavalia(刀豆)、野豌豆属(蚕豆或野豌豆)、Peluschken(紫花豌豆(maple pea))、落花生属(花生)、羽扇豆属、苜蓿、大豆及利马豆的果实,和如果适用,其他豆类和其他锦葵科果实(例如棉属的果实,棉)、马铃薯或山药作为粉末的来源,也在本发明的范围内。尤其优选的是豌豆特别是大豆。本发明的微粒复合物也可以是上述粉末和/或团块的组合。优选的微粒复合物是小麦制成的粉末,如商业可获得的产品Farigel(Farigel de Ble F1100,WestHove,法国)。本发明的植物粉优选经过蒸汽处理,如用温度约100℃-约110℃的干燥过热蒸汽在接近常压至低过压(例如0.8-1.2巴的过压)经过高达约1小时的处理时间(在下述过热蒸汽处理装置中的驻留时间)处理。干燥过热蒸汽是过热的不饱和蒸汽,可以用常规方法过热和除去可能的水凝物或从高压膨胀蒸汽而获得。本发明的微粒组分的特点是在研磨植物来源的粉末后经过蒸汽处理,即对准备用于混合制粒过程的制备好的微粒组分进行处理。用蒸汽处理的微粒组分的优点是会降低微粒组分中可能会引起产品中微生物生长的细菌或真菌的数量,但更重要的是微粒组分将完全或部分胶凝化。胶凝化提高颗粒的完整性使其不会在制粒过程中碎裂、溶解或分散,而保持其微粒特性。
微粒组分的优选的平均颗粒大小至少为40μm,更优选至少60μm,例如至少80μm,例如至少100μm。一些有用的微粒组分可以更大,有至少140μm或至少200μm的平均颗粒大小。
混合装置可以是批式混合器或连续混合器,例如对流式混合器[见,例如Harnby等,工业过程中的混合,pp.39-53(ISBN 0-408-115742)]。也可以使用非对流式混合装置,如转鼓式混合器或所谓的造粒锅(pan-granulators)。
造粒工艺
在造粒工艺(prilling process)中,喷雾干燥的酶颗粒悬浮在熔融的蜡中,悬浮液喷雾冷却,例如通过雾化装置,进入冷却室,含有酶颗粒的蜡的液滴在其中固化。可以从Michael S.Showell(编辑);《(粉末状去污剂》(powdered detergents);表面活性剂科学丛书(SurfactantScience Series);1998;71卷;140-142页;Marcel Dekker和DK-PA 199901358得知此工艺,将二者引入本文作为参考。造粒工艺使用的雾化器适当地与上述喷雾干燥过程记载的相同,优选Rayleigh雾化器。
可以制成有所需的平均大小和统一的密度的造粒颗粒,进一步将酶保护在蜡基质中。此处使用的术语“蜡”,应理解为熔点在25-150℃范围内的化合物。优选的蜡是熔点在所述范围内的有机物或有机化合物的盐或其混合物。使用不同蜡的混合物时,可选地与重/或轻的固体联合,可以得到有所需真密度的酶颗粒。并且,蜡或蜡的混合物的一个重要的特点是蜡(优选在碱性或中性溶液中)应是水溶性或水可分散的,因而酶颗粒的蜡基质可以分散和/或溶解在水性溶液中。水溶性蜡的例子是聚乙二醇(PEG’s)。相应地,在水溶性蜡当中,蜡在水中的溶解度应优选高达75份蜡/25份水,例如对于PEG 1000。在水不溶性蜡中,可分散在水性溶液中的是甘油三酯和油类。另外,一种有用的蜡不溶解或分散在基本非水性的液相中。本文使用的术语“基本非水性”可以定义为液相含有少量(例如低于5%w/w或低于3%w/w)水或无水(非水性)。蜡也应与酶相容,即它不应使酶失活,例如通过与酶反应或永久性地改变结构,例如折叠、螺旋部分、片层部分、辅基和此类对酶保持活性必需的结构。另外,蜡应与酶混合,即酶可以溶解在(熔融的)蜡中和/或酶可以以无定形的或结晶形的酶蛋白颗粒的形式分散在(熔融的)蜡中。适宜的蜡是在室温(25℃)为固态的蜡,因此有高于此温度的熔点或熔融范围(聚合物蜡趋向于在一个温度范围内熔融)。优选的蜡有在约35℃-约120℃范围内的熔点或熔融范围。低限优选在蜡熔融的温度至含有酶颗粒的液体去污剂通常储存的温度(20-30℃)之间设一合理的距离。并且,在酶颗粒的制备中当蜡的熔点低于35℃时预期有困难。温度高限设在通常适用于酶而不引起酶活性由于加热变性显著丧失的最高温度。更优选的熔点或范围在约40℃-约100℃,例如在约50℃-约80℃。在另一优选的实施方案中,蜡的分子量在约150道尔顿-10,000道尔顿。蜡可以是化学合成的或它同样可以是从天然来源分离出的蜡或其衍生物。相应地,本发明的蜡优选选自以下蜡的非限定性的列表。
-聚乙二醇,缩写为PEG,蜡类。商业可获得的不同的PEG蜡有不同的分子大小,其中有低分子大小的PEG,也有最低的熔点。适宜的PEG类蜡的例子是PEG 1500、PEG 3000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 9000,例如从德国BASF公司获得的。为满足对于蜡和/或酶颗粒真密度和熔点所需的性质,也考虑到有低熔点的蜡与有高熔点的蜡的混合物是本发明非常有用的实施方案。
-聚丙烯或聚乙烯或其混合物。
-在室温为固体的非离子表面活性剂,例如有高水平乙氧基基团的乙氧基化脂肪醇,例如BASF的Lutensol AT80,每分子有80单位环氧乙烷。或者环氧乙烷、环氧丙烷的聚合物或其共聚物是有用的,例如嵌段共聚物,如德国BASF的Pluronic PE 6800。
-从天然来源分离出的蜡,例如巴西棕榈蜡(熔点在80-88℃之间),小烛树蜡(熔点在68-70℃之间)和蜂蜡。其他天然来源的蜡或其衍生物是从动物或植物衍生得到的蜡,例如来源于海洋的。这样的蜡的例子是氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化大豆油,其中此处使用的术语“氢化”应解释为使不饱和碳水化物链饱和,例如在甘油三酯中,其中C=C双键转化成C-C单键。氢化棕榈油的一个例子是商业可获得的,例如从Hobum Oele und Fette GmbH-Germany或Deutche Cargill GmbH-Germany得到的。
-脂肪酸醇,例如从Condea Chemie GMBH Germany得到的线形长链脂肪酸醇NAFOL 1822(C18,20,22),有处于55-60℃之间的熔点和约0.96g/cm3的真密度。
-单酸甘油酯和/或二酸甘油酯是有用的蜡,例如硬脂酸甘油酯,其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物。一个这样的例子是得自于丹麦Danisco Ingredients的Dimodan PM,它有约1g/cm3的熔点。
-脂肪酸,例如氢化线性长链脂肪酸。
-石蜡,即固态烃。
-微晶蜡。
在另外的实施方案中,可以在C.M.McTaggart等,Int.J.Pharm.19,139(1984)或Flanders等,Drug Dev.Ind.Pharm.13,1001(1987)找到在本发明中有用的蜡,将二者合并于此作为参考。
挤出工艺
在挤出(extrusion)或制丸(pelletizing)工艺中,单独或与添加剂如混合制粒工艺所述的添加剂混合向喷雾干燥的含酶颗粒加入水分,产生一种含酶的糊状物。然后挤压此糊状物成丸或在压力下通过小孔挤出并切成大颗粒,随后干燥。从Michael S.Showell(编辑);《粉末状去污剂》;表面活性剂科学丛书(Surfactant Science Series);1998;71卷;140-142页;Marcel Dekker和US 4,661,452可以得知挤压过程,将二者合并于此作为参考。
流化床工艺
本发明上下文的流化床工艺包括使喷雾干燥的含酶颗粒在流化床中流体化,并将含有粘合剂的溶液喷雾到流体化的粉末上,以使含有酶的粉末颗粒结合形成更大更硬的颗粒。
喷雾干燥的含酶颗粒不大适于制备分层颗粒的方法,该方法此处定义为这样的方法,其中酶作为包围惰性微粒核材料的一层而使用,例如在一流化床设备中,将惰性核流体化,在核上喷雾含有酶的溶液而加上酶层。此方法需要干燥的含酶粉末再溶解或再悬浮在液体中以将含酶层包围在惰性核周围,因而引入一个比上述方法更耗能的步骤。相应地,在一优选实施方案中,干燥的含酶颗粒的随后步骤不是分层的过程。
包衣工艺
由此得到的喷雾干燥的颗粒或粒剂可以优选用一或多个包衣层包衣,以为颗粒提供进一步改良的性质。可以适当地使用本领域已知的包衣层和方法,例如WO 89/08694、WO 89/08695、270608B1和/或WO00/01793记载的包衣层。可以从US 4,106,991、EP 170360、EP 304332、EP 304331、EP 458849、EP 458845、WO 97/39116、WO 92/12645A、WO89/08695、WO 89/08694、WO 87/07292、WO 91/06638、WO 92/13030、WO 93/07260、WO 93/07263、WO 96/38527、WO 96/16151、WO 97/23606、US 5,324,649、US 4,689,297、EP 206417、EP 193829、DE 4344215、DE 4322229A、DD 263790、JP 61162185A和/或JP 58179492找到常规包衣材料的其他例子。
包衣可以包含选自上述混合制粒部分记载的粘合剂、纤维、盐、水不溶性无机物、色素、酶稳定剂或这些物质的组合的材料。
在一个特别的实施方案中,包衣含有较少数量的能与从周围介质进入颗粒或粒剂中而使酶失活(对酶有害)的组分反应的保护剂,即在此组分与酶接触并使酶失活之前与其反应。此保护剂可以例如能中和、还原此对酶有害的组分或以其它方式与此组分反应。能使酶失活的典型的组分是氧化剂例如过硼酸盐、过碳酸盐、有机过酸及类似物。
保护剂可以分为几类:碱性或中性材料、还原剂、抗氧化剂和/或第一过渡系列金属离子的盐。它们各自可以与其它同类或不同类的保护剂联合使用。碱性保护剂的例子是通过活跃地中和例如氧化剂提供化学清除效果的碱金属硅酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐。还原性保护剂的例子是亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐或硫代硫酸盐,抗氧化剂的例子是甲硫氨酸、丁基化羟基甲苯(BHT)或丁基化羟基苯甲醚(BHA)。最优选的保护剂是硫代硫酸盐,例如硫代硫酸钠。包衣中保护剂的数量可以是包衣的5-40%w/w,优选5-30%,例如10-20%。
包衣层应形成基本连续的均质层而将含有酶的颗粒或粒剂包裹起来。
包衣层可以根据所需的用途在颗粒或粒剂中发挥任何一项功能。例如,包衣层可以达到一或多种以下功能:
(i)进一步降低酶颗粒或粒剂的起尘趋势;
(ii)进一步保护酶颗粒或粒剂中的酶不被漂白物质/系统氧化(例如过硼酸盐、过碳酸盐、有机过酸及类似物);
(iii)颗粒/粒剂进入液体介质(例如水性介质)时能以理想的速率溶解;
(iv)为酶颗粒/粒剂提供更好的物理强度。
包衣层可以还含有一或多种以下物质:抗氧化剂、氯清除剂、增塑剂、色素、润滑剂(例如表面活性剂或抗静电剂)、另外的酶和芬芳剂。
在本发明的上下文中用于包衣层的增塑剂包括例如:多元醇,例如糖、糖醇或分子量小于1000的聚乙二醇(PEGs);尿素,邻苯二甲酸酯例如邻苯二甲酸二丁基或二甲基酯;和水。
适宜的色素包括但不限于精细分散的增白剂,例如二氧化钛或高岭土,着色的色素,水溶性着色剂,及一或多种色素和水溶性着色剂的组合。
用于本文中时,术语“润滑剂”指任何降低表面摩擦力、使颗粒表面润滑、减少形成静电的趋势和/或降低颗粒脆碎性的添加剂。润滑剂通过降低包衣层中粘合剂的粘结性,在促进包衣过程方面也可以起到相关作用。因此润滑剂可以作为抗聚结剂和润湿剂。
适宜的润滑剂的例子是聚乙二醇(PEGs)和乙氧基化脂肪醇。
在本发明的一个优选实施方案中,本发明喷雾干燥的颗粒或随后加工的粒剂用有高恒定湿度的保护性包衣层包衣,例如在本申请的申请日未公开的丹麦专利申请WO 00/01793的5-9页和所给实施例中记载的,将其合并于此作为参考。
粉碎/研磨和筛选
能够理解的是上述方法可以在任何阶段适当地补充以粉碎/研磨和/或筛选过程。例如在随后的加工步骤之前将喷雾干燥的含酶颗粒研磨,及筛分最终的产品以得到所需大小的部分将是理想的。
含有酶和生物质的颗粒
本发明包括含有酶和生物质的颗粒,例如由本发明的第二方面获得的颗粒,即从选自喷雾干燥发酵肉汤、将喷雾干燥的发酵肉汤制粒、将喷雾干燥的发酵肉汤包衣及将喷雾干燥的发酵肉汤制粒和包衣的工艺得到的颗粒。
应用
本发明的颗粒用于广泛的组合物和应用领域。有用的组合物的例子是清洁组合物、纺织品加工组合物、皮革加工组合物、纸浆或纸加工组合物、食品和饮料组合物、动物饲料组合物和个人护理(personal care)组合物。清洁组合物包括例如去污剂和抗微生物组合物。纺织品加工组合物包括用于纺织品例如牛仔布的酶漂白和/或砂洗(stone washing)的组合物。食品和饮料组合物包括用于酒、油和脂肪、柑橘和果汁产品、淀粉和糖制品、酒和/或酿造产品、豆制品和烘焙面粉或面团等制造业的酶组合物。
相应地,本发明包括含有颗粒的组合物,颗粒是优选从选自发酵肉汤喷雾干燥、将喷雾干燥的发酵肉汤制粒、将喷雾干燥的发酵肉汤包衣和将喷雾干燥的发酵肉汤制粒和包衣的工艺得到的含酶和生物质的颗粒。
本发明也包括含有酶和生物质的颗粒和含有这些颗粒的组合物的用途。尤其是用于处理纺织品、皮革、纸浆、纸、食品、饮料、硬表面和人或动物体的用途。含有酶和生物质的颗粒和含有这些颗粒的组合物也可以用于制造治疗人体或动物的药品。
去污剂组合物
一种优选的组合物是去污剂组合物,其中含有表面活性剂和从喷雾干燥发酵肉汤得到的含酶及生物质的颗粒或从这些喷雾干燥颗粒得到的粒剂。
例如,可以将本发明的去污剂组合物配成手洗或机洗去污剂组合物,其中包括适用于污染纤维预处理的去污添加剂成分和添加了织物软化剂的漂洗成分,或配制成用于一般家庭硬表面清洁操作的去污剂组合物,或配制成用于餐具的手洗或机洗操作的去污剂组合物。
在一个具体方面,本发明提供含有本发明含酶和生物质的喷雾干燥颗粒或粒剂的去污添加剂。该去污添加剂以及该去污剂组合物可以含有一或多种其它酶例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常,所选酶的性质应与所选的去污剂相适应,(即最适pH、与其它的酶和非酶成分的兼容性,等等),并且该一种或多种酶应当以有效的量存在。
蛋白酶:合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶,优选微生物的碱性蛋白酶,或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶;尤其是来自芽胞杆菌属的枯草杆菌蛋白酶,例如枯草杆菌蛋白酶Novo,枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶309,枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO 94/25583中的镰孢属蛋白酶。
有用的蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO98/20116和WO 98/34946中的变体,尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体:27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的商业上可获得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect0xPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶:合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(同义词Thermomyces)的脂肪酶,例如EP 258 068和EP 305 216中描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶、或WO 96/13580中描述的来自H.insolens的脂肪酶;假单胞菌属(Pseudomonas)的脂肪酶例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272),洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属的菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶;芽胞杆菌属脂肪酶例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993),Biochemica etBiophysica Acta,1131,253-360),嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
其它例子包括例如记载于WO 92/05249、WO 94/01541、EP407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中的脂肪酶变体。
优选的商业上可获得的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase ultraTM(Novo Nordisk A/S)。
淀粉西酶:适合的(α和/或β)淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰的突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。淀粉酶包括,例如,从芽胞杆菌属例如地衣芽孢杆菌的特定菌株中获得的α-淀粉酶,更详细的描述在GB 1,296,839中。
有用的淀粉酶的例子是描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO 97/43424中的变体,尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可获得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/s)、RapidaseTM和PurastarTM(来自GenencorInternational Inc.)。
纤维素酶:适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶,例如由Humicola insolens、Myceliophthora thermophila和尖镰孢产生的真菌纤维素酶,它们公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。
特别适合的纤维素酶是具有护色功能的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其它例子有例如描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纤维素酶变体。
商业上可获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovoNordisk A/S),ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor InternationalInc.),以及KAC-500(B)TM(Kao公司)。
过氧化物酶/氧化酶:适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞菌属(Coprinus)的过氧化物酶,例如来自灰盖鬼伞(C.Cinereus)的过氧化物酶,和WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的它的变体。
商业上可获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可以通过加入含有一或多种酶的独立添加剂,或通过加入含有所有这些酶的组合添加剂,将所述的一种或多种去污剂酶包含在去污剂组合物中。本发明的去污剂添加剂即独立添加剂或组合添加剂,可以配制成含有一或多种本发明的酶颗粒。
本发明的去污剂组合物可以是任何方便的形式例如条形、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体去污剂可以是水性的,典型地含有高达70%的水和0-30%的有机溶剂,或非水性的。
该去污剂组合物含有一或多种表面活性剂,该表面活性剂可以是非离子包括半极性表面活性剂,和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。这些表面活性剂典型地按重量计以0.1%到60%的水平存在。
当被包括在内时,该去污剂通常含有大约1%到大约40%的阴离子表面活性剂,例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯,烷基-或烯基丁二酸或肥皂。
当被包括在内时,该去污剂通常含有大约0.2%到大约40%的非离子表面活性剂例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺,或氨基葡糖(“葡糖酰胺”)的N-酰基N-烷基衍生物。
该去污剂可以含有0-65%的去污助剂或络合剂例如沸石,二磷酸盐,三磷酸盐,膦酸酯,碳酸盐,柠檬酸盐,次氮基三乙酸,乙二胺四乙酸,二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
该去污剂可以包含一或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素,聚(乙烯基吡咯烷酮),聚(乙二醇),聚(乙烯醇),聚(乙烯吡啶-N-氧化物),聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯,马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
该去污剂可以含有漂白体系,该漂白体系可以包括H2O2来源物质例如过硼酸盐或过碳酸盐,并且可以与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰羟苯磺酸盐结合。或者,该漂白体系可以含有例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。
本发明去污剂组合物中的酶可以通过使用常规稳定剂来稳定,例如多元醇例如丙二醇或丙三醇,糖或糖醇,乳酸,硼酸,或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸,并且该组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述的方法配制。
该去污剂还可以含有其它常规去污成分,例如包括粘土在内的织物调理剂、发泡增效剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、光漂白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。
目前正在设想,在该去污剂组合物中可以加入任何酶,尤其是本发明的酶,其加入量相当于每升洗涤液中加入0.01-100mg酶蛋白,优选每升洗涤液中加入0.05-5mg酶蛋白,尤其是每升洗涤液中加入0.1-1mg酶蛋白。
此外还可以将本发明的酶加入WO 97/07202中所公开的去污剂制品中,其中WO 97/07202在此以参考文献方式并入。
材料和方法
本文使用的蛋白酶活性单位是Kilo Novo Protease(蛋白酶)。样品的KNPU是在标准测定中相对于Savinase标准而确定的,方法是:测定一给定数量样品溶液中由酶消化二-甲基-酪蛋白(DMC)释放出的游离氨基的形成速度(μmol/分钟)。记录在形成的游离氨基和加入的2,4,6-三-硝基-苯-磺酸(TNBS)反应的同时在420nm处光吸收的线性增长监测形成速率。在50℃、pH8.3的硼酸缓冲液中,进行DMC的消化和颜色反应,反应时间9分钟,其后有3分钟的测定时间。
实施例1
高产品效价的蛋白酶发酵肉汤的喷雾干燥
将成批量生产规模的干物质含量为13%w/w的含有蛋白酶的发酵肉汤通过旋转刷滤过器过滤以除去大的固体颗粒。在保持搅拌的条件下向肉汤中加入0.5%Rodalon(50%苯扎氯铵)杀死发酵过的微生物。然后加入甲酸将pH降低到5.5,并将肉汤放置1小时或更长使Rodalon产生效果。将肉汤加热到投料口温度140℃并通过一旋转喷雾喷口导入一干燥腔室(Niro Atomizer,SD200-R喷雾干燥塔)。出口温度为55℃。产生的喷雾干燥粉末的活性为41KNPU/g,水分含量为4.86%。
实施例2
高产品效价的纤维素酶发酵肉汤的生产规模的喷雾干燥
将成批量生产规模的含有纤维素酶的发酵肉汤通过旋转刷滤过器过滤以除去大的固体颗粒。在保持充分搅动的条件下向肉汤中加入0.5%Rodalon(50%苯扎氨铵)杀死生产菌株,并将肉汤放置至少1小时使Rodalon产生效果。在入口温度为140℃时通过旋转喷雾喷口将肉汤输入喷雾塔(Niro Atomizer,SD200-R)。出口温度为55℃。产生的喷雾干燥粉末的预估活性为20000ECU/g,预计水分含量低于5.0%。
实施例3
高产品效价的淀粉酶发酵肉汤的生产规模的喷雾干燥
将成批量生产规模的含有淀粉酶的发酵肉汤通过旋转刷滤过器过滤以除去大的固体颗粒。在保持充分搅动的条件下向肉汤中加入0.5%Rodalon(50%苯扎氯铵)杀死生产菌株,并将肉汤放置至少1小时使Rodalon产生效果。在入口温度为140℃时通过旋转喷雾喷口将肉汤输入喷雾塔(Niro Atomizer,SD200-R)。出口温度为55℃。产生的喷雾干燥粉末的预估活性为960KNU/g,预计水分含量低于5.0%。
Claims (28)
1.一种制备含有酶的颗粒的方法,包括将含有酶和生物质的发酵肉汤原料喷雾干燥,得到含有酶和生物质的固体颗粒,其中该生物质构成从发酵得到的生物质的至少10%,且该酶选自过氧化物酶(EC 1.11.1.-)、漆酶(EC 1.10.3.2)、葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、转移酶(EC 2.-.-.-)、羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)、糖苷酶(EC 3.2.-.-)、肽酶(EC 3.4.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)或连接酶(EC 6.-.-.-)。
2.权利要求1的方法,其中生物质中发酵的微生物是选自芽孢杆菌属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Yarrowia、支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium和木霉属的菌株。
3.权利要求1的方法,其中生物质构成从发酵得到的生物质的至少50%。
4.权利要求3的方法,其中生物质构成从发酵得到的生物质的至少75%。
5.权利要求4的方法,其中生物质构成从发酵得到的生物质的至少90%。
6.权利要求1的方法,其中肉汤含有0-30%w/w干物质。
7.权利要求1的方法,其中生物质构成不超过90%w/w的干物质。
8.权利要求1的方法,其中酶构成不超过50%w/w的干物质。
9.权利要求1的方法,还包括在喷雾干燥前肉汤的除渣。
10.一种制备含有酶的颗粒的方法,包括将含有酶的水性液体原料喷雾干燥,得到喷雾干燥的第一含酶颗粒,并随后使此第一干燥颗粒经过选自制粒、包衣和其组合的工艺,得到含酶的第二干燥颗粒。
11.权利要求10的方法,其中含酶的水性液体是发酵肉汤、酶滤液或酶浓缩物。
12.权利要求1的方法,其中已向原料中加入了选自无机盐、无机矿物质或粘土、碳水化合物、着色剂、纤维素或其衍生物、杀虫剂、分散剂、防泡剂、粘度调节剂、酸性试剂、碱性试剂、酶稳定剂、酶抑制剂、粘合剂、其它酶及其组合的添加剂。
13.权利要求1的方法,其中原料经过了选自加热、冷却、辐射、混合、通气和超声处理等物理处理。
14.权利要求13的方法,其中原料已被加热或冷却到5-150℃。
15.权利要求1的方法,其中已将原料灭菌。
16.权利要求1的方法,其中已处理原料以水解原料中存在的多核苷酸。
17.权利要求1的方法,其中原料是发酵肉汤或发酵滤液浓缩物,每升液相中含有至少3mg活性酶。
18.权利要求1的方法,其中原料具有5-5000cps的粘度。
19.权利要求1的方法,其中喷雾干燥包括通过选自高速转盘式雾化器、压力喷嘴雾化器、气动喷嘴雾化器或声波喷嘴雾化器和Rayleigh雾化器的雾化装置将原料雾化的步骤。
20.权利要求19的方法,其中雾化装置是Rayleigh雾化器。
21.权利要求1的方法,还包括使喷雾干燥的颗粒在流化床干燥设备中进一步干燥。
22.权利要求1的方法,其中喷雾干燥颗粒的SPAN值小于约2.5。
23.含有酶和生物质的颗粒,其中该生物质构成从发酵得到的生物质的至少10%,且该酶选自过氧化物酶(EC 1.11.1.-)、漆酶(EC 1.10.3.2)、葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、转移酶(EC 2.-.-.-)、羧酸酯水解酶(EC3.1.1.-)、糖苷酶(EC 3.2.-.-)、肽酶(EC 3.4.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)或连接酶(EC 6.-.-.-)。
24.权利要求23的颗粒,从选自喷雾干燥发酵肉汤、将喷雾干燥的发酵肉汤制粒、将喷雾干燥的发酵肉汤包衣和将喷雾干燥的发酵肉汤制粒和包衣的工艺得到。
25.一种组合物,含有权利要求23和24的颗粒。
26.权利要求25的组合物,其中组合物选自清洁组合物、纺织品加工组合物、皮革加工组合物、纸浆或纸加工组合物、食物和饮料组合物、动物饲料组合物和个人护理组合物。
27.权利要求26的清洁组合物,其中清洁组合物是还含有表面活性剂的去污剂组合物。
28.权利要求23-27的颗粒和组合物在处理选自纺织品、皮革、纸浆、纸、食物、饮料、硬表面和人或动物体的对象中的用途。
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