JPH08126489A - 酵素担持基材、酵素担持体及びこれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 担体に酵素を結合させた酵素担持体に関し、
失活した酵素を常温で容易に交換できるようにするこ
と。 【構成】 酵素担持体は、担体と、担体にコートされた
ポリマーと、ポリマーにジスルフィド結合している酵素
とを備えている。この酵素担持体では、酵素とポリマー
とがジスルフィド結合しているため、酵素とポリマーと
の間の結合及び離脱反応を常温で容易に行える。この結
果、酵素担持体は、酵素が失活した場合に失活した酵素
を新たな酵素に常温で容易に交換できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、担持基材、担持体及び
これらの製造方法、特に、酵素担持基材、酵素担持体及
びこれらの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】バイオ関連研究の進歩に伴い、酵素の利
用が高まっている。例えば、酵素を用いて化合物を生産
するバイオマスや酵素により有害物質を分解除去するた
めのシステム等が開発されている。このような酵素を用
いる技術分野においては、酵素の安定性と良好なハンド
リング性とが要望されている。

【０００３】そこで、このような要望に応えるために、
酵素を担体に固定化した酵素担持体が提供されている。
一般的な酵素担持体は、担体に酵素を結合したものと、
酵素を担体内に閉じ込めたものとの２種類に分類され
る。担体に酵素を結合した酵素担持体は、酵素と担体と
を物理吸着、イオン結合又は共有結合したものに細分化
できるが、共有結合したものが酵素の安定性が最良であ
るとされている。ここで、酵素と担体とを共有結合する
ための手法としては、担体のアルデヒド基と酵素のア
ミノ基とによりシッフ塩基を形成する方法、担体のカ
ルボン酸を酸塩化物に変換してナトリウムアジドを反応
させ、これに酵素のアミノ基を反応させてアミド結合を
形成するアジド結合法、担体の水酸基にブロモシアン
を反応させ、これに酵素のアミノ基を結合させるブロモ
シアン活性化法、担体のアミノ基又はカルボン酸基に
酵素とカルボジミドとを同時に反応させてアミド結合を
形成させるカルボジイミド活性化法等種々の方法が提案
されている。

【０００４】一方、酵素を担体内に閉じ込めた酵素担持
体としては、ポリマー溶液に酵素を混合し、これをゲ
ル化させることにより得られるポリマーマトリックス内
に酵素を閉じ込めたもの、マイクロカプセル内に酵素
を閉じ込めたもの等が提案されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】酵素と担体とを結合さ
せた前記従来の酵素担持体では、酵素と担体との結合の
安定性を重視するため、担体から酵素を離脱させるのが
困難である。このため、酵素が失活した場合に、酵素を
担体から離脱させて新しい酵素を担体に再結合し、酵素
活性を再生することができない。また、酵素と担体との
結合に用いる試薬が危険性の高いものであるため、工業
化するのが困難である。さらに、担体と酵素との結合処
理には加熱が必要なため、熱に弱い酵素には適用できな
い。

【０００６】一方、酵素を担体内に閉じ込めた酵素担持
体は、酵素をポリマー内部に包含しているため失活した
酵素を交換できない。また、酵素に反応基質が到達しに
くく、酵素と反応基質との反応性が十分ではない。本発
明の目的は、酵素を保持するための酵素担持基材に関
し、常温で容易に酵素を着脱できるようにすることにあ
る。

【０００７】他の目的は、酵素が担体に保持された酵素
担持体に関し、失活した酸素を容易に交換できるように
することにある。さらに他の目的は、常温で容易に酵素
を着脱できる酵素担持基材の製造方法を提供することに
ある。さらに他の目的は、失活した酵素を容易に交換で
きる酵素担持体の製造方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明に係る酵素担持基
材は、酵素を担持するためのものである。この酵素担持
基材は、担体と、担体にコートされかつ酵素とジスルフ
ィド結合し得るポリマー層とを備えている。本発明に係
る酵素担持体は、担体と、担体にコートされたポリマー
と、ポリマーにジスルフィド結合している酵素とを備え
ている。

【０００９】本発明に係る酵素担持基材の製造方法は、
次の工程を含んでいる。 ◎担体を用意する工程。 ◎担体にチオール基を有するポリマーをコートする工
程。 本発明に係る酵素担持体の製造方法は、次の工程を含ん
でいる。 ◎担体を用意する工程。 ◎担体にチオール基を有するポリマーをコートする工
程。 ◎ポリマーを非架橋ジスルフィド結合を有する酵素によ
り処理する工程。

【００１０】＊＊＊＊＊＊＊酵素担持基材 本発明に係る酵素担持基材は、担体と、担体にコートさ
れたポリマー層とを備えている。本発明で用いられる担
体は、酵素反応が行われる溶媒、特に水に不溶性のもの
が好ましい。このような担体としては、シリカゲル，カ
ーボン，アルミナ等の無機物、ポリアミド樹脂，ポリエ
ステル樹脂，ポリウレタン樹脂，シリコーン樹脂，アセ
テート樹脂等の樹脂、綿や絹等の天然繊維が例示でき
る。

【００１１】このような担体の形状は、粒状、棒状、繊
維状、フィルム状、布帛状等のあらゆる形態のものが利
用でき、特に限定されない。但し、単位重量当たりの表
面積の大きい微粒子状又は極細繊維状のものが特に好ま
しい。上述の担体にコートされるポリマー層は、酵素と
ジスルフィド結合し得るポリマーにより形成されてい
る。このようなポリマーとしては、チオール基を有する
ポリマーが挙げられる。具体的には、ケラチン等の蛋白
質を主成分とする天然高分子、エチレンジチオール等を
共重合したポリエステル樹脂やポリウレタン樹脂等の合
成高分子、ジスルフィド結合を有するラジカル重合性モ
ノマーや重縮合性モノマーをグラフト共重合した合成高
分子のジスルフィド結合部分を還元してチオール基に変
換したもの等が例示できる。

【００１２】なお、ポリマー層の形成量は、ポリマー層
を形成するためのポリマーに含まれるチオール基数に応
じて適宜設定され得る。本発明の酵素担持基材は、上述
の担体に上述のポリマー層をコートすると形成できる。
担体にポリマー層を設ける方法は、特に限定されない。
例えば、チオール基を有する高分子を直接担体にコート
する場合は、チオール基を有するポリマーの溶液又は分
散液に担体を浸漬又は分散させ、ポリマーを担体表面に
物理吸着させる方法が好ましい。この方法は、担体の形
態にかかわらず適用できる。担体がフィルム状又は布帛
状の場合は、パッディングやコーティング等の一般的な
被覆方法も採用できる。

【００１３】還元するとチオール基が形成され得るポリ
マーによりポリマー層を形成する場合には、このような
ポリマーを上述の方法により担体にコートする。そし
て、コートされたポリマーを還元し、ポリマーに含まれ
るジスルフィド結合をチオール基に変換する。ポリマー
を還元するための還元剤としては、一般的なものが利用
できるが、ポリマーの耐熱性、耐酸性及び耐アルカリ性
等を考慮して選択するのが好ましい。一般的には、常温
において比較的中性に近い条件で還元できるジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）のホウ酸緩衝溶液を用いるのが好ま
しい。酵素担持体 本発明の酵素担持体は、上述の酵素担持基材のポリマー
層に酵素がジスルフィド結合したものである。

【００１４】ポリマー層にジスルフィド結合される酵素
は、特に限定されるものではなく、あらゆる種類の酵素
が結合され得る。例えば、セルラーゼ，プロテアーゼ，
リパーゼ等の分解酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ，
ペルオキシダーゼ等の酸化還元酵素、Ｌ−グルタミン合
成酵素等の各種酵素が例示できる。このような酵素担持
体は、上述の酵素担持基材に上述の酵素をジスルフィド
結合させると得られる。酵素担持基材と酵素とのジスル
フィド結合は、酵素に含まれる非架橋ジスルフィド結合
と酵素担持基材のポリマー層に含まれるチオール基との
間のＳ−Ｓ交換反応により達成される。

【００１５】ところで、酵素に含まれる非架橋ジスルフ
ィド結合とは、ジスルフィド結合によりポリペプチド鎖
が閉環構造を形成していないものを言う。すなわち、ポ
リペプチド鎖の末端に形成されたジスルフィド結合やア
ミノ酸配列中のシスチンが持つジスルフィド結合等を言
う。一般に、酵素タンパクは、高次構造を固定するため
に、アミノ酸配列の離れた位置にあるシステイン残基同
士のジスルフィド結合により架橋している。このように
高次構造を維持しているジスルフィド結合を酵素担持基
材のポリマー層との固定に利用することも可能である
が、ほとんどの場合は酵素分子の内部に当該ジスルフィ
ド結合が存在するため、このジスルフィド結合と酵素担
持基材側のチオール基とのＳ−Ｓ交換反応を行うのは困
難である。仮に、このようなＳ−Ｓ交換反応が実現でき
ても、酵素タンパクの高次構造が変化し、酵素活性が消
失又は低下することが多い。よって、ポリマー層のチオ
ール基とのＳ−Ｓ交換反応に寄与する非架橋ジスルフィ
ド結合は、酵素活性の低下や高次構造の構造変化を伴い
にくい位置にあるもの、例えば末端ジスルフィド結合が
好ましい。

【００１６】ところが、ジスルフィド結合の性格上、シ
スチンがアミノ酸配列の末端に位置することは極めて稀
であり、アミノ酸配列は、通常、末端以外にシスチンを
含んでいる。したがって、末端ジスルフィド結合を持た
ない酵素については、末端にジスルフィド結合を導入す
る必要がある。末端ジスルフィド結合は、アミノ酸配列
の末端にあるアミノ基又はカルボキシル基と結合し得る
官能基とジスルフィド結合とを有する化合物を酵素に反
応させると形成される。ここで用いる化合物は、常温か
つ中性付近のｐＨで酵素に反応させることができるＮ−
サクシニミディル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（ＳＰＤＰ）が好ましい。ＳＰＤＰは、酵素の
末端アミノ基と反応してアミド結合を形成し、酵素に非
架橋ジスルフィド結合を導入する。

【００１７】酵素側の非架橋ジスルフィド結合と酵素担
持基材側のチオール基とのＳ−Ｓ交換反応は、酵素溶液
に酵素担持基材を入れて常温で反応させると達成され
る。この際、Ｓ−Ｓ交換反応は常温で進行し、チオール
基のイオウ原子と、ジスルフィド結合を構成するイオウ
原子のうち酵素側に結合しているものとの間に新たなジ
スルフィド結合が形成される。これにより、酵素が酵素
担持基材のポリマー層と結合する。利用方法 本発明の酵素担持体は、酵素により化合物を生産するた
めのバイオマス，酵素による有害物質の分解除去，バイ
オセンサー等のバイオ関連分野、高分子や繊維等の改質
加工、酵素加工での酵素の回収及び再利用等の高次加工
分野、付着した汚れを分解する自己浄化型の防汚繊維、
防臭抗菌繊維、消臭繊維等の繊維の機能化分野、消化を
促進する食物繊維等の食品分野等で利用され得る。

【００１８】このような利用分野、例えばバイオマスに
おいて本発明の酵素担持体を利用すると、化合物の生産
に関与する酵素はやがて失活する。本発明では、失活し
た酵素を酵素担持体から除去して新しい酵素を酵素担持
体に導入できる。この場合は、酵素担持体を上述のＤＴ
Ｔのような還元剤を用いて常温で還元し、酵素と酵素担
持基材とを結合させているジスルフィド結合を開裂させ
る。これにより、酵素が酵素担持基材から離脱し、酵素
担持基材にはチオール基を有するポリマー層が再生され
る。次に、酵素担持基材を洗浄して失活した酵素を除去
し、酵素担持基材を非架橋ジスルフィド結合を有する新
しい酵素溶液と常温で反応させる。これにより、新たな
酵素担持体が得られる。なお、このような酵素の取り換
え処理は、全て常温で行われるため、処理中に酵素はダ
メージを受けにくい。

【００１９】このように、本発明の酵素担持体は、酵素
担持基材に保持された酵素を容易に除去し、また酵素担
持基材に酵素を容易に結合できるので、失活した酵素の
取り換えが可能であり、また、酵素そのものの活性を長
寿命化する場合に比べて事実上長期に渡る酵素活性の有
効な利用が可能になる。

【００２０】

【実施例】実施例１ 平均粒径が１０μｍの球状ナイロン６樹脂粒子５ｍｇ
を、羊毛から抽出したケラチン溶液（１００μｇ／ｍｌ
のホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）に添加して１時間攪拌し
た。これにより、ケラチンが表面に物理吸着した球状ナ
イロン６樹脂粒子を得た。

【００２１】上述の球状ナイロン６樹脂粒子を、リン酸
緩衝液を用いて５回洗浄した後に乾燥させ、１ｍＭのジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）ホウ酸緩衝溶液４ｍｌに添
加した。この状態で３０分間放置してケラチンのジスル
フィド結合を還元し、ホウ酸緩衝液を用いて５回洗浄し
た。これにより、酵素担持基材を得た。一方、東洋紡株
式会社製のペルオキシダーゼ（西洋わさび由来のもの、
分子量４００００、酵素活性２６０Ｕ／ｍｇ）溶液１０
０μｌと、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）３５０
μｌとの混合液を調整し、これに１０ｍＭのＮ−サクシ
ニミディル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）を５０μｌ加えて室温で３０分間反応さ
せた。これにより、ペルオキシダーゼ１分子当たり１．
８個の２−ピリジルジスルフィド基が結合した末端ジス
ルフィド結合を有する酵素溶液が得られた。この酵素溶
液について酵素活性を測定したところ、２−ピリジルジ
スルフィド基により修飾されたペルオキシダーゼは、非
修飾のペルオキシダーゼと同等の酵素活性を保持してい
ることが確認できた。

【００２２】次に、上述の酵素担持基材を上述の酵素溶
液に添加して常温で２時間攪拌した。これにより、酵素
担持基材にペルオキシダーゼがジスルフィド結合した酵
素担持体を得た。この酵素担持体について、ペルオキシ
ダーゼの結合量を酵素活性によって測定したところ、粒
子１ｍｇ当たり７ｎｇであった。次に、この酵素担持体
について、ＤＴＴ溶液により還元してペルオキシダーゼ
を除去して洗浄した後に再び上述の操作によりペルオキ
シダーゼを結合するというペルオキシダーゼの脱離と再
結合の操作を１０回繰り返し、ペルオキシダーゼの結合
量を酵素活性によって測定した。この結果、酵素担持基
材粒子１ｍｇ当たり９ｎｇと逆に増加する傾向が見られ
た。実施例２ ６ｍｍ角のポリエステル極細繊維織物（単糸繊度：０．
０７ｄ）を、羊毛から抽出したケラチン溶液（１００μ
ｇ／ｍｌのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）に１時間浸漬し
た。これにより、ケラチンが表面に物理吸着したポリエ
ステル極細繊維織物を得た。

【００２３】このポリエステル極細繊維織物を、１ｍＭ
のＤＴＴホウ酸緩衝溶液４ｍｌに３０分間浸漬し、ケラ
チンのジスルフィド結合を還元した後にホウ酸緩衝液を
用いて５回洗浄した。これにより、酵素担持基材を得
た。次に、上述の酵素担持基材を実施例１で用いたもの
と同様の酵素溶液に常温で２時間浸漬し、Ｓ−Ｓ交換反
応により酵素担持基材とペルオキシダーゼとを結合させ
た。ペルオキシダーゼの結合量は、酵素活性によって測
定したところ２０ｎｇ／ｃｍ² であった。

【００２４】次に、このような酵素担持体を、熱水で１
０分間処理して酵素活性を完全に失活させてからＤＴＴ
溶液により還元し、失活したペルオキシダーゼを洗浄し
て除去してから再び同様の手法により新しいペルオキシ
ダーゼを結合させるというペルオキシダーゼの脱離及び
再固定の操作を行った。そして、ペルオキシダーゼの結
合量を再び酵素活性によって測定したところ、結果は１
８ｎｇ／ｃｍ² であり、結合量はほとんど変化していな
いことが確認できた。実施例３ １ｃｍ角のナイロン６タフタ（経糸７０デニール、１２
フィラメント、緯糸７０デニール、２４フィラメント、
織密度縦１２０本／インチ、横９０本／インチ）を実施
例１で用いたものと同様のケラチン溶液に１時間浸漬し
た。これにより、表面にケラチンが物理吸着したナイロ
ン６タフタを得た。

【００２５】このナイロン６タフタを、１ｍＭのＤＴＴ
ホウ酸緩衝溶液４ｍｌに３０分間浸漬し、ケラチンのジ
スルフィド結合を還元してからホウ酸緩衝溶液を用いて
５回洗浄した。これにより、酵素担持基材を得た。一
方、アルカリプロテアーゼと４０ｍＭのＳＰＤＰとを３
７℃で１時間反応させ、アルカリプロテアーゼ１分子当
たり０．６個の２−ピリジルジスルフィド基が結合した
末端ジスルフィド結合を有する酵素溶液を得た。この酵
素溶液について酵素活性を測定したところ、２−ピリジ
ルジスルフィド基により修飾されたアルカリプロテアー
ゼは、非修飾のアルカリプロテアーゼの約９０％の酵素
活性を保持していることが確認できた。

【００２６】次に、上述の酵素溶液に上述の酵素担持基
材を常温で２時間浸漬した。これにより、酵素担持基材
にアルカリプロテアーゼがジスルフィド結合した酵素担
持体を得た。この酵素担持体について、アルカリプロテ
アーゼの結合量を酵素活性によって測定したところ、４
９ｎｇ／ｃｍ² であった。次に、このような酵素担持体
について実施例２と同様にアルカリプロテアーゼの脱離
及び再結合の操作を行った。その後、アルカリプロテア
ーゼの結合量を酵素活性によって測定したところ、結果
は４７ｎｇ／ｃｍ² であり、当初とほぼ同じであること
が確認できた。実施例４ ナイロン６タフタに代えてポリエステルタフタ（繊度７
５デニール、３６フィラメント、織密度縦９８本／イン
チ、横８４本／インチ）を用いた点を除き、実施例３と
同様の処理によりアルカリプロテアーゼの結合量が２２
ｎｇ／ｃｍ² の酵素担持体を得た。

【００２７】この酵素担持体について、実施例３と同様
にアルカリプロテアーゼの脱離及び再結合の操作を行っ
た。その後、アルカリプロテアーゼの結合量を酵素活性
によって測定したところ、結果は１９ｎｇ／ｃｍ² であ
り、当初とほぼ同じであることが確認できた。実施例５ リパーゼＢと１０ｍＭのＳＰＤＰとを室温で１時間反応
させ、リパーゼＢ１分子当たり１．０個の２−ピリジル
ジスルフィド基が結合した末端ジスルフィド結合を有す
る酵素溶液を得た。この酵素溶液の酵素活性を測定した
ところ、２−ピリジルジスルフィド基により修飾された
リパーゼＢは、非修飾のリパーゼＢと同等の酵素活性を
保持していることが確認できた。

【００２８】次に、上述の酵素溶液に実施例３で用いた
ものと同様の酵素担持基材を常温で２時間浸漬し、Ｓ−
Ｓ交換反応によりリパーゼＢと酵素担持基材とを結合さ
せた。リパーゼＢの結合量は、酵素活性によって測定し
たところ１３ｎｇ／ｃｍ² であった。この酵素担持体に
ついて、実施例２と同じ手法によりリパーゼＢの脱離及
び再結合の操作を行った。そして、リパーゼＢの結合量
を酵素活性によって測定したところ、結果は１０ｎｇ／
ｃｍ² であり、当初とほぼ同じであることが確認でき
た。実施例６ ナイロン６タフタに代えて実施例４で用いたポリエステ
ルタフタを用いて実施例５と同様の処理を行い、リパー
ゼＢの結合量が２０ｎｇ／ｃｍ² の酵素担持体を得た。

【００２９】この酵素担持体について、実施例２と同じ
手法によりリパーゼＢの脱離及び再結合の操作を行っ
た。そして、リパーゼＢの結合量を酵素活性によって測
定したところ、結果は１７ｎｇ／ｃｍ² であり、当初と
ほぼ同じであることが確認できた。比較例１ ジフェニルカルボジイミド存在下において、実施例３で
用いたものと同様のナイロン６タフタとペルオキシダー
セとを４０℃で１０時間反応させた。洗浄後のナイロン
６タフタの酵素活性を調べたところ、酵素活性は確認で
きなかった。一方、洗浄液に反応前と同等の酵素活性が
確認された。これより、ペルオキシダーゼはナイロン６
タフタに全く固定化されなかったことが確認された。比較例２ 比較例１と同様の反応を９０℃で５時間行ったが、洗浄
後のナイロン６タフタには酵素活性が確認できなかっ
た。また、洗浄液にも酵素活性が確認されなかった。こ
れより、このような反応条件の下では、ペルオキシダー
ゼが完全に失活してしまうことが確認できた。

【００３０】

【発明の効果】本発明に係る酵素担持基材は、酵素とジ
スルフィド結合し得るポリマー層を担体にコートしたの
で、常温でも容易に酵素を着脱できる。本発明に係る酵
素担持体は、担体にコートされたポリマーと酵素とをジ
スルフィド結合により結合させているので、失活した酵
素を常温で容易に交換できる。

【００３１】本発明に係る酵素担持基材の製造方法は、
担体を用意する工程と、担体にチオール基を有するポリ
マーをコートする工程とを含んでいるので、常温で容易
に酵素を着脱できる酵素担持基材を製造できる。本発明
に係る酵素担持体の製造方法は、担体を用意する工程
と、担体にチオール基を有するポリマーをコートする工
程と、ポリマーを非架橋ジスルフィド結合を有する酵素
溶液により処理する工程とを含んでいるので、失活した
酵素を常温で容易に交換できる酵素担持体を製造でき
る。

フロントページの続き (72)発明者 高垣 裕 大阪市東成区中道一丁目３番69号

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素を担持するための酵素担持基材であっ
   て、 担体と、前記担体にコートされかつ前記酵素とジスルフ
   ィド結合し得るポリマー層とを備えた酵素担持基材。
2. 【請求項２】担体と、前記担体にコートされたポリマー
   と、前記ポリマーにジスルフィド結合している酵素とを
   備えた酵素担持体。
3. 【請求項３】担体を用意する工程と、 前記担体にチオール基を有するポリマーをコートする工
   程と、を含む酵素担持基材の製造方法。
4. 【請求項４】担体を用意する工程と、 前記担体にチオール基を有するポリマーをコートする工
   程と、 前記ポリマーを非架橋ジスルフィド結合を有する酵素に
   より処理する工程と、を含む酵素担持体の製造方法。