CN109837255A - 一种化学修饰酮胺氧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明针对现有酶法检测糖化白蛋白技术方案中存在酮胺氧化酶不稳定的问题，目的在于提供一种化学修饰酮胺氧化酶的方法，使用该方法化学修饰的酮胺氧化酶可保持较高的酶活性，同时不易被蛋白酶降解。其特征在于，使用N‑羧基内酸酐类化合物对酮胺氧化酶进行化学修饰，目的在于使修饰后的酮胺氧化酶难以被蛋白酶降解，用于制备稳定性好的测定人体血清糖化白蛋白的试剂盒。其中N‑羧基内酸酐类化合物可以举例为L‑丙氨酸‑N‑羧基环内酸酐、L‑酪氨酸‑N‑羧基酸环内酸酐和L‑天冬氨酸‑4‑苄酯‑N‑羧基环内酸酐等。
Description
技术领域
本发明属体外诊断领域，具体的说是一种化学修饰酮胺氧化酶的方法，用于制备血清糖化白蛋白测量试剂盒。
背景技术
糖化白蛋白是血液中白蛋白与葡萄糖发生非酶促糖化反应所产生的产物，是一个重要的血糖水平的检测指标，其结果能反应患者近2-3周的血糖情况。由于糖化白蛋白反映血糖水平周期较短，糖化白蛋白在治疗效果的确认以及临床用药量的调整方面比血糖检测“金标准”糖化血红蛋白具有一定的优势，而且几乎不受测量时血糖浓度的影响，是糖尿病病人血糖控制的良好指标。另外，与其他血糖指标相比，在患者具有一些特殊疾病或病理状态下（如缺铁性贫血、终末期肾病透析患者、脾切除、妊娠期妇女等），糖化白蛋白能更真实反应患者的实际血糖水平，能更及时地反映血糖的变化，从而辅助临床医生有效地评估疗效、调整治疗方案。
目前，临床上糖化白蛋白检测的常规方法主要为酮胺氧化酶法，其检测原理如下：首先使用蛋白酶将血清中的白蛋白降解为氨基酸碎片；然后使用酮胺氧化酶选择性的将其中的果糖氨基酸（主要是果糖赖氨酸）氧化产生过氧化氢；最后使用Trinder’s反应测定出过氧化氢的含量，进而得到样本中糖化白蛋白的含量。这种方法的优点是可以使用双试剂模式在多种型号的全自动生化仪上进行大量、快速和连续的定量测量，糖化白蛋白的测定结果通常用糖化白蛋白占血清白蛋白的百分比来表示。
通常，第一试剂（R1）的主要成分为酮胺氧化酶、部分Trinder’s反应底物和抗干扰物质；第二试剂（R2）的主要成分为蛋白酶、辣根过氧化物酶和部分Trinder’s反应底物。理想状态下，将样本与R1混合均匀，消除干扰物质后，加入R2使蛋白酶与糖化白蛋白反应，引发上述反应链。然而实际上，蛋白酶并不能高度选择地与白蛋白发生反应，也就是说，在加入R2后，蛋白酶会使反应体系中的白蛋白与酮胺氧化酶同时降解，这样就抑制了第二步反应进行，使测量结果不准确。所以，需要一种保护酮胺氧化酶的方法，使之不与蛋白酶反应，以确保整个测量过程的顺利进行。
在开发测定人血清糖化白蛋白试剂盒的过程中，我们发现，用N-羧基内酸酐类化合物对酮胺氧化酶进行化学修饰，可在一定程度上提高酮胺氧化酶的化学稳定性，可使其在测定过程中免于被蛋白酶降解。
发明内容
本发明提供一种化学修饰酮胺氧化酶的方法，使用该方法化学修饰的酮胺氧化酶可保持较高的酶活性，同时不易被蛋白酶降解。本发明所述的方法对制备高质量的测定人体血清糖化白蛋白含量的试剂盒有用。
本发明所述的方法的特征在于，使用N-羧基内酸酐类化合物对酮胺氧化酶进行化学修饰，目的在于使修饰后的酮胺氧化酶难以被蛋白酶降解。
所以，本发明的内容包括：
[1] 一种化学修饰酮胺氧化酶的方法，其特征在于，使用N-羧基内酸酐类化合物对酮胺氧化酶进行化学修饰。即，使用N-羧基内酸酐类化合物作为修饰剂，化学修饰酮胺氧化酶的方法；
[2] [1]中所述的N-羧基内酸酐类化合物是指分子结构中含有N-羧基环内酸酐的小分子化合物，其特征是可以通过分子上的N-羧基环内酸酐官能团与酮胺氧化酶中游离的氨基发生开环聚合反应，并在酮胺氧化酶的表面生成多肽链。这类化合物可以举例，但不限于L-丙氨酸-N-羧基环内酸酐（CAS：2224-52-4）、L-酪氨酸-N-羧基酸环内酸酐（CAS：3415-08-5）和L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐（CAS：13590-42-6）等。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施案例中所使用的试剂如表一所示.
表一：实施例中试剂来源
| 试剂 | 来源 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich |
| 三羟甲基氨基甲烷 | Sigma-Aldrich |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich |
| 1,4-二氧六环 | Sigma-Aldrich |
| 酮胺氧化酶 | 深圳迈博生物工程公司 |
| L-丙氨酸-N-羧基环内酸酐 | Ark pharm |
| L-酪氨酸-N-羧基酸环内酸酐 | Ark pharm |
| L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐 | Ark pharm |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich |
| N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich |
| 苯酚 | Sigma-Aldrich |
| 4-氨基安替比林 | Sigma-Aldrich |
| 辣根过氧化酶 | Asahi KASEI |
实施例1：
用N-羧基环内酸酐化学修饰酮胺氧化酶
按以下步骤用N-羧基环内酸酐修饰酮胺氧化酶：
[1] 将50mg酮胺氧化酶溶解在10ml PH为7.2的磷酸盐缓冲液中，放置于2℃的冰水浴中冷却20 min；
[2] 将N-羧基环内酸酐用无水1,4-二氧六环配置成10mg/ml的溶液；
[3] 在2℃冰水浴和600 rpm的磁力搅拌下，将10ml N-羧基环内酸酐的1,4-二氧六环溶液滴入酮胺氧化酶溶液中，滴加速率为0.2ml/min，滴加完毕后，将混合溶液在2℃搅拌30min；
[4] 将混合溶液在4000rpm的转速离心，取上清液，透析，冷冻干燥，制备出N-羧基环内酸酐修饰的酮胺氧化酶粉末。
实施例2：
N-羧基环内酸酐修饰的酮胺氧化酶的活性测定
按以下步骤测定酮胺氧化酶的酶活性：
[1] 用PH为8.0的50mM Tris–HCl缓冲液作为溶剂配置酶活性测定溶液，所含成分如下：0.02% 苯酚、0.02% 4-氨基安替比林、5U/ml 辣根过氧化酶和2mM N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸;
[2] 用PH为8.0的50mM Tris–HCl缓冲液作为溶剂将未修饰和修饰过的酮胺氧化酶配置成1mg/ml的溶液；
[3] 将2.9 ml酶活性测定溶液加入石英比色皿，再加入100 ul酮胺氧化酶溶液；同时，以酶活性测定溶液2.9 ml和100 ul去离子水作为空白对照；将溶液静置5min，用紫外分光光度计测定480nm波长的吸光度，并按以下公式计算吸光度：
△Abs.(酶)= Abs.(酶) -Abs.(空白)
[4] 按上述[1]~[3]步骤，分别测定未修饰的酮胺氧化酶与三种N-羧基内酸酐修饰的酮胺氧化酶的酶活性(△Abs.(酶))，计算相对酶活性如下公式：
相对酶活性(%)=△Abs.(修饰后)/△Abs. (未修饰)*100%
测试结果如下表所示，可以看出，用N-羧基环内酸酐修饰的酮胺氧化酶的酶活力均有少量下降，但均保持在较高的水平。
表二：N-羧基环内酸酐修饰的酮胺氧化酶的相对活力
实施例3：
N-羧基环内酸酐修饰的酮胺氧化酶抗蛋白酶降解能力测定
按以下步骤测定酮胺氧化酶的抗蛋白酶降解能力：
[1] 用PH为8.0的50mM Tris–HCl缓冲液作为溶剂配置酶活性测定溶液，所含成分如下：0.02% 苯酚、0.02% 4-氨基安替比林、5U/ml 辣根过氧化酶和2mM N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸;
[2] 用PH为8.0的50mM Tris–HCl缓冲液作为溶剂将未修饰和修饰过的酮胺氧化酶配置成2 mg/ml的溶液；
[3] 用PH为8.0的50mM Tris–HCl缓冲液作为溶剂将蛋白酶K配置成1mg/ml的溶液；
[4] 将蛋白酶K和酮胺氧化酶溶液按体积比1:1均匀混合，并开始计时；同时，将未修饰的酮胺氧化酶与不含蛋白酶的缓冲液1:1混合作为基准对照组；
[5] 在1min、3min、5min、10min时分别取上述混合溶液100ul，迅速加入至含有2.9 ml酶活性测定溶液的石英比色皿；同时，以酶活性测定溶液2.9 ml和100 ul去离子水作为空白对照；将溶液静置5min，用紫外分光光度计测定480nm波长的吸光度，并按以下公式计算吸光度：
△Abs.(酶)= Abs.(酶) -Abs.(空白)
[6] 按上述[1]~[5]步骤，分别测定未修饰的酮胺氧化酶、三种N-羧基内酸酐修饰的酮胺氧化酶和基准对照组的酮胺氧化酶的酶活性(△Abs.(酶))，按以下公式计算四个时间点的相对酶活性；
相对酶活性(%)=△Abs.(酶)/△Abs. (基准)*100%
结果如下表所示，可见，未经化学修饰的酮胺氧化酶极易被蛋白酶K降解导致酶活力降低，而经过N-羧基内酸酐修饰的酮胺氧化酶可也在10min之内能保持较高的酶活性。
表三： N-羧基环内酸酐修饰的酮胺氧化酶抗蛋白酶降解能力测定
Claims (2)
1.一种化学修饰酮胺氧化酶的方法，其特征在于，使用N-羧基内酸酐类化合物对酮胺氧化酶进行化学修饰；即，使用N-羧基内酸酐类化合物作为修饰剂，化学修饰酮胺氧化酶的方法。
2. [1]中所述的N-羧基内酸酐类化合物是指分子结构中含有N-羧基环内酸酐的小分子化合物，其特征是可以通过分子上的N-羧基环内酸酐官能团与酮胺氧化酶中游离的氨基发生开环聚合反应，并在酮胺氧化酶的表面生成多肽链；这类化合物可以举例，但不限于L-丙氨酸-N-羧基环内酸酐（CAS：2224-52-4）、L-酪氨酸-N-羧基酸环内酸酐（CAS：3415-08-5）和L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐（CAS：13590-42-6）等。
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| CN103204821A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-07-17 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种制备氨基酸n-羧基环内酸酐的方法 |
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