CN101724621A - 一种微载体固定化脂肪酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微载体固定化脂肪酶及其制备方法。该方法，包括下述步骤：1)脂肪酶复合液的制备：在脂肪酶溶液中加入所述脂肪酶溶液重量的1％～60％的载体合成用组分，混合均匀得到脂肪酶复合液；2)将步骤1)制备的脂肪酶复合液经喷雾干燥得到微载体固定化脂肪酶；所述载体合成用组分是含有预聚物的溶液、分散液或乳液；所述预聚物是聚丙烯酸酯类、聚氨酯类或二者任意比例混合的组分。该方法实现微型载体制备和脂肪酶固定化同时完成；该方法工艺简单，制备的微载体固定化脂肪酶具有通用性强、活性高、易于从反应体系中分离、重复利用性好等优点。

Description

一种微载体固定化脂肪酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微载体固定化脂肪酶及其制备方法。

背景技术

生物酶的固定化技术是酶工程的核心内容之一，它有效地克服了游离酶在工业化应用中稳定性差、耐热性差、不能重复利用以及不易与产物分离的缺点，极大地推动了生物酶在各个领域的应用，促进了生物技术的迅猛发展。脂肪酶是工业上应用较广的一种酶，它能够在油-水界面上催化水解、酯化、转酯化、内酯合成、多肽合成及手性化合物的拆分等多种反应。脂肪酶的固定化技术已经成为决定脂肪酶应用的关键技术。

脂肪酶固定化的方法有很多种，比较常见的方法包括：吸附法、共价结合法、包埋法和微囊法等。脂肪酶固定化可以只采用一种上述方法，有时因特殊需要也往往采用两种及以上的复合方法进行固定化。脂肪酶常用的固定化载体与其他种类的酶固定化用的载体没有太大区别，主要包括天然多孔材料、各类凝胶、合成树脂和复合改性材料等。目前市场上已经有多种商品化的固定化脂肪酶，其中应用较广的固定化脂肪酶是以颗粒状合成树脂为载体，采用共价结合的方法进行固定化的一类酶。这类固定化脂肪酶具有活力较高、酶载量大、使用寿命长的优点，其缺点是工艺复杂，酶分子经过多个步骤、以共价方式结合在预先制备好的载体上，固定化过程酶活损失严重，工艺对酶自身纯度要求也很高。另外此类固定化酶价格很高，一般在每公斤几千元以上，有的甚至超过万元。

发明内容

本发明的目的是提供一种微载体固定化脂肪酶及其制备方法。

本发明所提供的微载体固定化脂肪酶的制备方法，包括下述步骤：

1)脂肪酶复合液的制备：在脂肪酶溶液中加入所述脂肪酶溶液重量的1％～60％的载体合成用组分，混合均匀得到脂肪酶复合液；

2)将步骤1)制备的脂肪酶复合液经喷雾干燥得到微载体固定化脂肪酶；

所述载体合成用组分是含有预聚物的溶液、分散液或乳液；所述预聚物是聚丙烯酸酯类、聚氨酯类或二者任意比例混合的组分。喷雾过程中载体合成用组分中的预聚物在一定温度下聚合，形成载体。

所述方法中，所述载体合成用组分的含固量(固体含量)为2％-66％，优选含固量为9％-50％，特别优选25％～50％；如9％-16％、9％-32％，16％-32％、30-32％、23％-30％、16％-30％、32％、30％、23％、45％、16％、9％。

所述方法中，所述脂肪酶复合液的脂肪酶活力范围为0～50000U/g溶液但不包括0U/g溶液；优选为6000～20000U/g溶液，如3000～1 8000 U/g、3000-6000 U/g、3000 U/g-10489U/g、6000U/g-10489U/g、5000U/g-6000U/g、3000 U/g-6153U/g、3000 U/g、6000U/g、10489U/g、6153U/g、5000U/g、4000U/g。

所述载体合成用组分的添加量为所述脂肪酶溶液重量的6％～60％，优选为12％-60％，特别优选为20％-60％，如6％-20％、20％-30％、6％-30％、43％-60％、30％-43％、20％、6％、30％、43％、60％。

所述方法中，所述脂肪酶溶液根据需要可以加入质量百分浓度为1～10‰的通用酶稳定剂，所述通用酶稳定剂为PEG、明胶和海藻糖中的一种或两种以上任意混合。通用酶稳定剂的添加量可为10‰、5‰、2‰、1‰；PEG可为PEG8000、PEG6000等。

所述方法中，所述聚丙烯酸酯是以丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸异辛酯、丙烯酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、醋酸乙烯和丙烯酸中两种或三种以上任意组合为单体进行聚合反应得到的共聚物；所述聚氨酯是多异氰酸酯与低聚多元醇的嵌段共聚物；所述低聚多元醇优选为聚醚二醇或聚酯二醇，所述多异氰酸酯为芳香族异氰酸酯或脂肪族二异氰酸酯；所述芳香族异氰酸酯优选为甲苯二异氰酸酯或二苯甲烷二异氰酸酯，所述脂肪族二异氰酸酯优选为六次亚甲基二异氰酸酯。

所述聚丙烯酸酯优选为下述1)-6)中任意一项所述的共聚物：

1)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为(1～3)∶(1～4)∶(2～6)的比例聚合反应得到的共聚物；

2)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为1.1∶1.3∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

3)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸和丙烯酸异辛酯按质量分数比为6∶4∶3∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

4)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为1∶1∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

5)丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙烯酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为3∶2∶1∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

6)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯和醋酸乙烯按质量分数比为2∶1∶3∶6的比例聚合反应得到的共聚物；

所述聚氨酯优选为下述1)-4)中任意一项所述的共聚物：

1)甲苯二异氰酸酯与聚醚二醇按照物质的量(摩尔)比为3∶2的比例聚合得到的共聚物；

2)甲苯二异氰酸酯与聚酯二醇按照物质的量(摩尔)比为3∶1的比例聚合得到的共聚物；

3)六次亚甲基二异氰酸酯与聚酯二醇按照物质的量(摩尔)比为2∶1的比例聚合得到的共聚物；

4)二苯甲烷二异氰酸酯与聚酯二醇按照物质的量(摩尔)比为9∶2的比例聚合得到的共聚物。

当所述预聚物是聚丙烯酸酯和聚氨酯混合的组分时，所述聚丙烯酸酯和聚氨酯的质量比优选为(1-4)∶(1-2)；更优选为1∶1、3∶2或者4∶1；所述低聚多元醇的重均分子质量为0.4～3.1kDa，如，当低聚多元醇为聚醚二醇时，其重均分子量可为1.9kDa，当低聚多元醇为聚酯二醇时，其重均分子量可为2.3kDa、1.2kDa、1.3kDa。

所述方法中，所述脂肪酶溶液为脂肪酶发酵液或脂肪酶纯粉水溶液。

所述方法中，喷雾干燥应理解为通常所说的干燥方法，是液态物料雾化后水份经迅速蒸发而除去的干燥方法。所述方法中，所述喷雾干燥时干燥风在干燥室入口处的温度为100～360℃，优选为126～220℃，最优选为126-210℃，如126℃-160℃、126℃-170℃、126℃-170℃、126℃-190℃、160℃-180℃、170℃-190℃、190℃-210℃、180℃、160℃、170℃、190℃、210℃、126℃；干燥室出口温度为10～98℃，优选为60-90℃，如60-65℃、60-70℃、65℃-70℃、70℃-90℃、80℃-90℃、60-75℃、75℃-80℃、60℃、65℃、70℃、90℃、80℃、75℃；所述方法中，整个喷雾过程时间为60秒以下，优选为10-55秒，如48-55秒、25-35秒、45-50秒、30-36秒、10-16秒、20-25秒、10-20秒、10-30秒25-45秒、16-25秒、16-36秒。喷雾干燥采用的雾化方式不限，可以是离心式、压力式和气流式，优选为离心式。喷雾干燥的同时固定化载体合成用组分在高温下发生聚合反应合成颗粒状微载体，同时脂肪酶分子通过共价结合或包埋的方式实现固定化。

所述方法中，还包括将微载体固定化脂肪酶控制含水量；所述控制含水量是是将采用自然晾干、真空冷冻干燥或在0℃至90℃下真空干燥，使固定化酶的含水量控制在15％以下，优选为使固定化酶的含水量控制在2～6％；所述真空干燥的温度优选为25-80℃，最优选30-75℃；

喷雾干燥制备的微载体固定化脂肪酶的水解活力可在0～400000U/g，基本能够达到100000～200000U/g。

本发明所提供的微载体固定化脂肪酶是上述方法制备的固定化脂肪酶，具有易于从反应体系中分离和反复利用的特点。

本发明的固定化脂肪酶的制备方法含脂肪酶复合液的制备，实现脂肪酶液与载体合成用预聚物(或称预聚体，单体经初步聚合而成的物质，是可反应性半成品)充分混合；复合液经喷雾干燥制备微载体固定化酶，实现微型载体制备和脂肪酶固定化同时完成。该方法工艺操作简单，便于工业化连续性生产。该制备方法中载体的制备和脂肪酶固定化同时完成：在合成固定化用载体的同时，脂肪酶分子可以通过共价结合或包埋的方式实现固定化，其中共价结合是通过脂肪酶分子非活性位点与载体中活性基团在高温下结合实现的。本发明的方法具有步骤少、过程短、酶活损失少的特点，市场应用前景广阔。

本发明的方法可以将脂肪酶发酵液直接转化成固定化脂肪酶，改变了传统的脂肪酶先提取后进行固定化的工艺，最大程度上减少了酶处理过程中的损失，通过喷雾制备微载体固定化酶活收率最高能够达到96％以上。

本发明的方法工艺简单，制备的微载体固定化脂肪酶粒径在300μm以下，基本为5-85um，这样的粒径使其比表面积大，具有通用性强、活性高、易于从反应体系中分离、重复利用性好等优点。

本发明的微载体固定化脂肪酶能够催化各类酯化、转酯化反应，通过实验证明该酶可成功用于在棕榈酸异辛酯合成、地沟油甲酯化、维生素A棕榈酸酯合成和鱼油乙酯化等领域，并且表现出较高的催化活性。

附图说明

图1为本发明固定化脂肪酶的电镜扫描图。

具体实施方式

下述实施例所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中，脂肪酶活力均用橄榄油水解方法测定(行业标准QB/T1803-1993)。

实施例1、本发明固定化脂肪酶的制备及其效果验证

1、本发明固定化脂肪酶的制备

从市场上购买深圳市绿微康生物工程有限公司产脂肪酶原料LVK-F，活力30000U/g，用水溶解脂肪酶原料LVK-F获得脂肪酶溶液，加入PEG6000，使其质量百分浓度为10‰，混合均匀后加入脂肪酶溶液质量20％的载体合成用组分(预聚物分散在水中获得的乳液，其中预聚物为聚丙烯酸酯类组分，由重量分数比为1.1∶1.3∶2的丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯聚合反应得到的共聚物，载体合成用组分含固量32％，聚合物相对分子质量分布范围为15～50kDa(重均分子量37kDa))，混合均匀后得到混合液体即为脂肪酶复合液，脂肪酶活力为3000U/g。

将500g上述获得的脂肪酶复合液(总共含1500000U脂肪酶)用江阴市干燥机械厂QP系列II型喷雾干燥器进行喷雾固定化，喷雾条件干燥室进口温度126℃，出口温度60℃，雾化方式为气流式，喷雾过程时间(料液雾化进入干燥塔到收集器的时间)为20-25秒。喷雾干燥时，载体合成用组分在高温下发生聚合反应合成颗粒状微载体，同时脂肪酶分子通过共价结合或包埋的方式实现固定化。喷雾完成后，23℃自然晾干至含水量7％，得到87g微载体固定化脂肪酶。

2、本发明微载体固定化脂肪酶进行活力测定的效果验证

将步骤1获得的制备的微载体固定化脂肪酶用橄榄油水解方法检测(行业标准QB/T 1803-1993)，结果表明获得的微载体固定化脂肪酶活力为13800U/g，粒径在10～45μm，整个制备过程总酶活力收率(总酶活力收率＝微载体固定化脂肪酶总活力/喷雾前酶液总活力×100％)为80.5％。活力测定完成后，将微载体固定化脂肪酶从反应体系中分离出来再进行活力测定，重复6次，以上述初次测定结果为100％，分离出微载体固定化脂肪酶重复6次的测定的活力都保持在初始活力的80％以上。

实施例2、本发明固定化脂肪酶的制备及其效果验证

1、本发明固定化脂肪酶的制备

以亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolyica)(保藏编号CGMCC NO.1470，专利公布号为CN 1948470A；专利申请号为200510112638.5)为生产菌株，在装有600L发酵培养基(培养基为将豆粕10g/L、豆油20g/L、K₂HPO₄ 0.1g/L、KH₂PO₄ 0.1g/L、消泡剂0.1g/L混于水中获得的液体培养基)的发酵罐中，在28℃下发酵，过滤得到6000U/g的脂肪酶发酵液，经硫酸铵分级沉淀(使硫酸铵的饱和度依次分别达到35％、80％，收集达到80％的沉淀)获得脂肪酶纯粉，活力200000U/g。脂肪酶纯粉用水溶解获得脂肪酶溶液。

在上述获得的脂肪酶溶液中加入海藻糖，使海藻糖质量百分浓度为5‰，混合均匀后加入脂肪酶溶液质量6％的载体合成用组分(预聚物分散在水中获得的乳液，其中预聚物为聚丙烯酸酯，预聚物具体是由重量分数比为6∶4∶3∶2的丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸和丙烯酸异辛酯聚合而成的聚合物；载体合成用组分含固量30％，聚合物相对分子质量分布范围为20～52kDa(重均分子量38kDa))，混合均匀后得到混合液体即为脂肪酶复合液，脂肪酶活力6000U/g。

将800g上述获得的脂肪酶复合液液体(总共含4800000U脂肪酶)用常州市华夏干燥制粒设备有限公司压力式喷雾干燥机YPG-50进行喷雾固定化，喷雾条件干燥室进口温度210℃，出口温度65℃，雾化方式为压力式(雾化压力2.5MPa)，喷雾时间(料液雾化进入干燥塔到收集器的时间)为10-16秒。喷雾干燥时，载体合成用组分在高温下发生聚合反应合成颗粒状微载体，同时脂肪酶分子通过共价结合或包埋的方式实现固定化。喷雾完成后真空冷冻(-15℃)干燥至固定化酶的含水量为3.6％，得到37g微载体固定化脂肪酶。

2、本发明微载体固定化脂肪酶进行活力测定的效果验证

将步骤1获得的制备的微载体固定化脂肪酶用橄榄油水解方法检测(行业标准QB/T 1803-1993)，结果表明获得的微载体固定化脂肪酶活力为106000U/g，粒径在30～85μm，整个制备过程总酶活力收率为83％。活力测定完成后将微载体固定化脂肪酶从反应体系中分离出来再进行活力测定，重复12次(以上述初次酶活测定为100％，后面12次的活力值都跟第一次测定的活力值比较)活力都保持在85％以上。

实施例3、本发明固定化脂肪酶的制备及其效果验证

1、本发明固定化脂肪酶的制备

实施例2中发酵液，活力6000U/g，过滤除去菌体等杂质后超滤浓缩至15000U/g，然后加入脂肪酶发酵液质量43％的载体合成用组分(预聚物分散在水中获得的乳液，其中预聚物是质量比为3∶2的聚丙烯酸酯与聚氨酯组分，总含固量23％，其中聚丙烯酸酯是丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按重量份数比为1∶1∶2的比例聚合反应得到的共聚物，聚合物相对分子质量分布范围为20～50kDa(重均分子量30kDa)；聚氨酯是甲苯二异氰酸酯与聚醚二醇(相对分子质量分布范围为0.9～2.7kDa(重均分子量1.9kDa))按照物质的量(摩尔)比为3∶2的比例聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范围为25～60kDa(重均分子量44kDa))，混合均匀后得到混合液体即为脂肪酶复合液；其活力为10489U/g。

将5000g上述获得的液体(总共含52445000U脂肪酶)用常州市嘉鹏干燥设备有限公司离心喷雾干燥机LPG100进行喷雾固定化，喷雾条件干燥室进口温度190℃，出口温度70℃，雾化方式为离心式，喷雾时间(料液雾化进入干燥塔到收集器的时间)为30-36秒。喷雾完成后60℃真空干燥至含水量4.0％，得到674g微载体固定化脂肪酶。

2、本发明微载体固定化脂肪酶用于棕榈酸异辛酯的合成的效果验证

将步骤1获得的制备的微载体固定化脂肪酶用橄榄油水解方法检测(行业标准QB/T 1803-1993)，结果表明步骤1制备的微载体固定化酶活力为70000U/g，粒径在5～35μm，整个制备过程总酶活力收率为90％。

将步骤1制备的固定化脂肪酶按照下述反应体系连续进行多次催化酯化反应：0.100g步骤1制备的固定化酶，1.000g棕榈酸，0.508g异辛醇(酸醇摩尔比为1∶1)，5mL正己烷。将反应体系在40℃，160r/min摇床，反应12小时。每次催化反应后，将所用固定化酶取出，经正己烷清洗后，重新放入新的上述相同体系继续反应。每次反应后，采用酸碱滴定确定酯化率(酯化率＝(1-反应完后剩余酸量/反应前酸总量)×100％)，记录反应酯化率仍保持在90％以上的反应次数。结果表明酯化率在90％以上的反应次数为46次，结果表明上述微载体固定化脂肪酶表现出较高活性和使用寿命。

实施例4、本发明固定化脂肪酶的制备及其效果验证

1、本发明固定化脂肪酶的制备

以亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)(保藏编号CGMCC NO.1470，专利公布号为CN 1948470A；专利申请号为2005101 12638.5)为生产菌株，在装有3600L发酵培养基(培养基为将豆粕15g/L、豆油26g/L、K₂HPO₄ 0.1g/L、KH₂PO₄ 0.1g/L、消泡剂0.3g/L混于水中获得的液体培养基)的发酵罐中，温度28℃下发酵。取新下罐发酵液，该发酵液脂肪酶水解活力为8000U/g发酵液，过滤除去菌体等杂质，加入脂肪酶发酵液质量30％的载体合成用组分(预聚物分散在水中获得的乳液，预聚物是质量比为4∶1的聚丙烯酸酯与聚氨酯组分，总含固量45％；其中聚丙烯酸酯是丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙烯酯和甲基丙烯酸甲酯按照质量比为3∶2∶1∶2聚合反应得到的共聚物，聚合物相对分子质量分布范围为36～62kDa(重均分子量49kDa)；聚氨酯是六次亚甲基二异氰酸酯与聚酯二醇(相对分子质量分布范围为1.5～3kDa(重均分子量2.3kDa))按照2∶1的物质的量(摩尔)比聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范围为55～106kDa(重均分子量79kDa))混合均匀后得到混合液体即为脂肪酶复合液；其活力为6153U/g。

将12000g上述获得的液体(总共含73836000U脂肪酶)进行喷雾固定化，喷雾条件干燥室进口温度170℃，出口温度90℃，雾化方式为离心式(仪器同实施例3)，喷雾时间(料液雾化进入干燥塔到收集器的时间)为45-50秒。喷雾完成后80℃真空干燥至含水量4.3％，得到424g微载体固定化脂肪酶。图1为该固定化脂肪酶的电镜扫描图。

2、本发明微载体固定化脂肪酶用于催化合成脂肪酸甲酯反应的效果验证

将步骤1获得的制备的微载体固定化脂肪酶用橄榄油水解方法检测(行业标准QB/T 1803-1993)，结果表明步骤1制备的微载体固定化酶活力为160000U/g，粒径范围在5～50μm，整个制备过程总酶活力收率为92％。

将步骤1制备的固定化脂肪酶按照下述反应体系连续进行多次催化转酯化反应：0.01g步骤1制备的固定化酶，2g地沟油(酸值120mgKOH/g)，5ml正己烷，0.1g水，279μl甲醇。将反应体系在40℃，170r/min摇床，反应12小时。每次催化反应后，将所用固定化酶取出，经正己烷清洗后，重新放入新的上述相同体系继续反应。每次反应后均用气相色谱法测定脂肪酸甲酯的含量，计算转酯化率(气相色谱分析中面积归一积分法，目标产物面积占总面积的比率)，记录反应酯化率仍保持在90％以上的反应次数。结果显示，步骤1制备的微载体固定化脂肪酶均能够连续31次催化上述转酯化反应，且转化率均在90％以上。

实施例5、本发明固定化脂肪酶的制备及其效果验证

1、本发明固定化脂肪酶的制备

取实施例4发酵液，经1000g，10分钟离心，收集上清液，加入明胶和PEG8000，使明胶和PEG8000的质量百分浓度均为2‰，充分溶解后，加入脂肪酶溶液质量60％的载体合成用组分(预聚物分散在水中获得的乳液，预聚物是质量比为1∶1的聚丙烯酸酯和聚氨酯组分，总含固量16％，其中聚丙烯酸酯是丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、醋酸乙烯按照2∶1∶3∶6的质量比聚合反应得到的共聚物，聚合物相对分子质量分布范围为39～55kDa(重均分子量46kDa)；聚氨酯是甲苯二异氰酸酯与聚酯二醇(相对分子质量分布范围为0.9～1.5kDa(重均分子量1.2kDa))按照3∶1的物质的量(摩尔)比聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范围为32～51kDa(重均分子量38kDa))混合均匀即为脂肪酶复合液；测定表明其活力为5000U/g。

取1000g上述混合溶液(总共含5000000U脂肪酶)进行喷雾固定化，设备同实施例3，喷雾条件干燥室进口温度160℃，出口温度80℃，雾化方式为离心式，喷雾时间(料液雾化进入干燥塔到收集器的时间)48-55秒，喷雾完成后40℃真空干燥至含水量2％。得到90g固定化脂肪酶。

2、本发明微载体固定化脂肪酶用于合成维生素A棕榈酸酯反应的效果验证

将步骤1获得的制备的微载体固定化脂肪酶用橄榄油水解方法检测(行业标准QB/T 1803-1993)，结果表明步骤1制备的微载体固定化酶活力为48000U/g，粒径范围在20～55μm，整个制备过程总酶活力收率为88％。

以维生素A醋酸酯和棕榈酸为底物，两者摩尔比1∶1，加入维生素A醋酸酯重量1％的步骤1制备的微载体固定化酶，40℃，160r/min摇床，反应9小时。结果显示，步骤1制备的微载体固定化脂肪酶均能够连续18次催化上述反应，且转化率均在77～79％。

实施例6、本发明固定化脂肪酶的制备及其效果验证

1、本发明固定化脂肪酶的制备

取实施例4发酵液，经3000g，10分钟离心，收集上清液，加入明胶，使明胶的质量百分浓度为1‰，充分溶解后，加入脂肪酶溶液质量12％的载体合成用组分(预聚物分散在水中获得的乳液，总含固量9％，预聚物是聚氨酯类组分，是二苯甲烷二异氰酸酯与聚酯二醇(相对分子质量分布范围为0.8～1.8kDa(重均分子量1.3kDa))按照9∶2的物质的量(摩尔)比聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范围为16～56kDa(重均分子量36kDa))混合均匀，即为脂肪酶复合液，测定脂肪酶活力为4000U/g。

取2000g上述混合溶液(总共含8000000U脂肪酶)进行喷雾固定化，设备同实施例3，喷雾条件干燥室进口温度180℃，出口温度75℃，雾化方式为离心式(离心速度13000r/s)，喷雾时间(料液雾化进入干燥塔到收集器的时间)25-35秒，喷雾完成后25℃真空干燥至含水量1.5％。得到72g固定化脂肪酶。

2、本发明微载体固定化脂肪酶用于合成鱼油乙酯反应的效果验证

将步骤1获得的制备的微载体固定化脂肪酶用橄榄油水解方法检测(行业标准QB/T 1803-1993)，结果表明步骤1制备的微载体固定化酶活力为104000U/g，粒径范围在15～50μm，整个制备过程总酶活力收率为95％。

将步骤1制备的固定化脂肪酶按照下述反应体系连续催化多次鱼油乙酯化反应；粗鱼油10g，无水乙醇1.95ml，步骤1制备的微载体固定化酶为0.08g。将反应体系在40℃，175r/min摇床，反应21小时。反应完成后离心将酶分离，反复重复上述反应，气相色谱法测定甘油三酯的转化率。结果显示，该微载体固定化脂肪酶能够连续12次催化上述反应(转化率90％以上)。

Claims (10)

1.一种微载体固定化脂肪酶的制备方法，包括下述步骤：

1)脂肪酶复合液的制备：在脂肪酶溶液中加入所述脂肪酶溶液重量的1％～60％的载体合成用组分，混合均匀得到脂肪酶复合液；

2)将步骤1)制备的脂肪酶复合液经喷雾干燥得到微载体固定化脂肪酶；

所述载体合成用组分是预聚物分散到水中得到的溶液、分散液或乳液；所述预聚物是聚丙烯酸酯、聚氨酯或二者任意比例混合的组分；所述百分含量为重量百分含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚丙烯酸酯是以丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸异辛酯、丙烯酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、醋酸乙烯和丙烯酸中两种或三种以上任意组合为单体进行聚合反应得到的共聚物；所述聚氨酯是多异氰酸酯与低聚多元醇的嵌段共聚物；所述低聚多元醇优选为聚醚二醇或聚酯二醇，所述多异氰酸酯为芳香族异氰酸酯或脂肪族二异氰酸酯；所述芳香族异氰酸酯优选为甲苯二异氰酸酯或二苯甲烷二异氰酸酯，所述脂肪族二异氰酸酯优选为六次亚甲基二异氰酸酯。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述脂肪酶复合液的脂肪酶活力范围为0～50000U/g溶液但不包括0U/g溶液；优选为3000～20000U/g溶液；特别优选为3000～18000U/g溶液。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中还包括将所述脂肪酶溶液中加入质量百分浓度为1～10‰的通用酶稳定剂，所述通用酶稳定剂为PEG、明胶和海藻糖中的一种或两种以上任意混合；所述载体合成用组分的添加量为所述脂肪酶溶液重量的6％～60％，优选为12％-60％，特别优选为20％-60％；所述百分含量为重量百分含量。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述载体合成用组分的含固量为2％～66％，优选含固量为25％～50％。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述聚丙烯酸酯优选为下述1)-6)中任意一项所述的共聚物：

1)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为(1～3)∶(1～4)∶(2～6)的比例聚合反应得到的共聚物；

2)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为1.1∶1.3∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

3)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸和丙烯酸异辛酯按质量分数比为6∶4∶3∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

4)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为1∶1∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

5)丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙烯酯和甲基丙烯酸甲酯按质量分数比为3∶2∶1∶2的比例聚合反应得到的共聚物；

6)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯和醋酸乙烯按质量分数比为2∶1∶3∶6的比例聚合反应得到的共聚物；

所述聚氨酯优选为下述1)-4)中任意一项所述的共聚物：

1)甲苯二异氰酸酯与聚醚二醇按照物质的量比为3∶2的比例聚合得到的共聚物；

2)甲苯二异氰酸酯与聚酯二醇按照物质的量比为3∶1的比例聚合得到的共聚物；

3)六次亚甲基二异氰酸酯与聚酯二醇按照物质的量比为2∶1的比例聚合得到的共聚物；

4)二苯甲烷二异氰酸酯与聚酯二醇按照物质的量比为9∶2的比例聚合得到的共聚物。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于：当所述预聚物是聚丙烯酸酯和聚氨酯混合的组分时，所述聚丙烯酸酯和聚氨酯的质量比优选为(1-4)∶(1-2)；更优选为1∶1、3∶2或者4∶1；所述低聚多元醇的重均分子质量为0.4～3.1kDa；所述脂肪酶溶液为脂肪酶发酵液或脂肪酶纯粉水溶液。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于：所述喷雾干燥时干燥风在干燥室入口处的温度为100～360℃，优选为126～220℃，最优选为126-210℃；干燥室出口温度为10～98℃，优选为60-90℃；所述方法中，整个喷雾过程时间为60秒以下，优选为10-55秒。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将微载体固定化脂肪酶控制含水量；所述控制含水量是采用自然晾干、真空冷冻干燥或在0℃至90℃下真空干燥，使固定化酶的含水量控制在15％以下，优选为使固定化酶的含水量控制在2～6％；所述真空干燥的温度优选为25-80℃，最优选30-75℃。

10.权利要求1-9中任意所述的方法制备的微载体固定化脂肪酶。

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