CN112831490A - 制备固定化酶的方法及固定化酶和茶渣的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备固定化酶的方法及固定化酶和茶渣的用途。该方法包括如下步骤：称取0.05～0.1g的茶渣，粉碎，过筛，收集粒径均一的茶渣；将处理后的茶渣用有机溶剂浸润，并超声波处理1～6h，离心后一次烘干，再用10～20g/L的山梨醇溶液浸润6～10h，二次烘干；向处理后的茶渣中加入浓度为0.5wt％～1.5wt％的交联剂150～300μL，一次孵育1～5h，洗涤、烘干，再加入30～100μL的酶液，二次孵育5～10h，洗涤、烘干，即得固定化酶。本发明的方法以茶渣作为固定化酶载体，充分利用茶渣资源，且制备的固定化酶重复利用率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备固定化酶的方法及固定化酶和茶渣的用途。
背景技术
茶叶是世界上最古老、消费最广泛的芳香饮料之一，在全球范围内具有巨大的经济和药用价值。据联合国粮农组织统计，自20世纪初以来，全球茶叶年消费量已达数百万吨。中国和印度是世界上最大的茶叶生产国和消费国。我国的茶园面积近年来持续不断增长，因而茶叶产量继续增加。数据显示，2019年全国干毛茶产量为279.34万吨，销售量达到202.56万吨，同比增长6.02％，国内销售总额为2739.50亿元，约占全球茶叶总产量的38％。除了将茶叶作为饮料消费外，大量的茶叶也可以经过提取和加工成为速溶茶粉用作茶饮料的原料。茶叶在消费和深加工过程中会产生大量茶叶“废弃物”，即所谓的茶渣。茶渣的主要成分是纤维素、半纤维素、木质素、单宁和结构蛋白。茶渣传统处理方法是将其转化为生物燃料、家畜饲料或作物肥料，这些方法已实施多年，但已不能满足茶渣快速积累的需要。因此，如何更有效地利用茶渣、开发更多茶渣的利用途径是目前生物质资源化利用的研究热点之一。
酶是一类极其重要的具有催化功能的蛋白质，其在生物、医药和食品化工等领域应用非常广泛。然而游离状态的酶对环境十分敏感，在高离子强度、高温及有机溶剂中稳定性差，且可重复利用率低，导致其利用受到很大的限制。固定化酶是利用固体材料和载体将游离酶限制在一定区域内进行催化反应的技术，固定化酶能够克服游离酶不稳定且催化效率低的缺点，具有回收率高且可多次重复利用的优势。因此，寻找和开发高效固定化酶载体一直是固定化酶研究领域关注的重点。
CN105274163A公开了一种红茶茶叶渣固定化酶制备D-甘露糖的方法。表面上看，其为红茶茶叶渣固定化酶；但是，根据其记载的技术内容可知，其采用茶树木屑颗粒固定化酶，然后酶解红茶茶叶渣来制备D-甘露糖。具体地，该专利文献将茶树树干处理得到氧化茶树木屑颗粒；将含甘露聚糖酶的上层清液与氧化茶树木屑颗粒混合，蒸干，得甘露聚糖酶木屑颗粒；将甘露聚糖酶木屑颗粒置于红茶茶叶渣混合液中，使其完全酶解，蒸发至无结晶析出，收集结晶，即制得D-甘露糖。显然，固定化酶的载体为茶树木屑颗粒，红茶茶叶渣仅仅作为酶解原料而已。
尽管茶树树干与茶渣同源，但二者的性质差别很大，因而形成固定化酶的工艺存在明显不同，二者之间不具有借鉴意义。此外，茶渣作为废弃物，来源广泛，可以实现变废为宝。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种制备固定化酶的方法。该方法以茶渣作为固定化酶载体，充分利用茶渣资源，且制备的固定化酶重复利用率高。
本发明的另一个目的在于提供一种固定化酶，由上述方法制备而得。
本发明的再一个目的在于提供一种茶渣在作为固定化酶载体中的用途。利用茶渣作为固定化酶载体所制备的固定化酶重复利用率高，且充分利用茶渣资源。
本发明发现，茶渣作为一种纤维素材料，其比表面积高，生物相容性好，表面含有羟基、醛基等大量官能团，易与蛋白质形成网络结构，具有蛋白吸附性高、传质阻力低等优点，是一种极佳的天然固定化酶载体。基于此，本发明将茶渣作为固定化酶载体将酶固定，从而完成本发明。本发明采用如下技术方案实现上述目的。
一方面，本发明提供一种制备固定化酶的方法，包括如下步骤：
1)称取0.05～0.1g的茶渣，粉碎，过筛，收集粒径均一的茶渣；
2)将步骤1)处理后的茶渣用有机溶剂浸润，并超声波处理1～6h，离心后一次烘干，再用10～20g/L的山梨醇溶液浸润6～10h，二次烘干；
3)向步骤2)处理后的茶渣中加入浓度为0.5wt％～1.5wt％的交联剂150～300μL，一次孵育1～5h，洗涤、烘干，再加入30～100μL的酶液，二次孵育5～10h，洗涤、烘干，即得固定化酶。
在步骤1)中，茶渣指茶叶经提取工艺处理后再干燥得到的茶叶废弃物或者茶叶经冲泡后再干燥得到的茶叶废弃物。上述茶叶包括绿茶、红茶、黑茶、白茶等通过常规栽培得到的茶产品。上述提取工艺中，茶叶经水相萃取等工艺提取有效成分(如茶多酚等)。
根据本发明的方法，优选地，在步骤1)中，所述茶渣选自以下组之一：
(1)茶叶经提取工艺处理后再干燥得到的茶叶废弃物，或者
(2)茶叶经冲泡后再干燥得到的茶叶废弃物；
所述过筛所用筛网的目数为35～300目。
茶渣粉碎可以采用机械粉碎或人工粉碎，如采用高速粉碎机粉碎。
本发明的过筛所用筛网的目数可以为35～300目，优选为35～100目。根据本发明的一个具体实施方式，过筛所用筛网的目数为35目。根据本发明的另一个具体实施方式，过筛所用筛网的目数为100目。利用上述目数的筛网，筛选得到的茶渣粒径大小适中，能够更好地通过交联剂将酶固定化。
在步骤2)中，将茶渣用有机溶剂浸润。浸润茶渣所用的有机溶剂可以为异丙醇、正己烷或乙酸乙酯，优选为乙酸乙酯或异丙醇。超声波处理时间可以为1～6h，优选为2～4h，更优选为2～3h。选择上述有机溶剂并配合超声波处理，能使茶渣在较短的时间内充分浸润、分散。根据本发明的一个具体实施方式，茶渣用乙酸乙酯浸润，并超声波分散处理2h。根据本发明的另一个具体实施方式，茶渣用异丙醇浸润，并超声波分散处理2h。上述超声波处理所用设备可以为超声波振荡器。
将有机溶剂浸润后的茶渣进行离心处理。离心条件并没有特别限制，只要能够将有机溶剂与茶渣分离即可。
将离心得到的茶渣进行一次烘干，条件可以为在60～80℃下干燥0.5～2h，优选为70～80℃下干燥1～2h。根据本发明的一个具体实施方式，一次烘干为在80℃下干燥2h。上述干燥所用设备可以为烘箱等。
将一次烘干后的茶渣用10～20g/L的山梨醇溶液浸润6～10h。优选地，用10～15g/L的山梨醇溶液浸润茶渣6～8h。更优选地，用10g/L的山梨醇溶液浸润茶渣6h。除非特别声明，本发明的溶液均以水为溶剂。本发明发现，将茶渣用山梨醇溶液浸润，可以促进酶固定在茶渣上，提高重复利用率。
将山梨醇溶液浸润后的茶渣进行二次烘干，条件可以为在60～80℃下干燥0.5～2h，优选为70～80℃下干燥1～2h。根据本发明的一个具体实施方式，二次烘干为在80℃下干燥2h。上述干燥所用设备可以为烘箱等。
根据本发明的方法，优选地，在步骤2)中，所述有机溶剂为异丙醇、正己烷或乙酸乙酯；超声波处理的时间为2～4h；一次烘干为在60～80℃下干燥0.5～2h，二次烘干为在60～80℃下干燥0.5～2h。
在步骤3)中，将茶渣与交联剂混合，进行一次孵育。根据本发明的方法，优选地，在步骤3)中，所述交联剂选自戊二醛溶液、新戊二醇二缩水甘油醚溶液或聚乙二醇二缩水甘油醚溶液中的一种。更优选地，交联剂为聚乙二醇二缩水甘油醚溶液。这样可以进一步提高固定化酶的重复利用率。除非特别声明，本发明的溶液均以水为溶剂。
交联剂的浓度可以为0.5wt％～1.5wt％，优选为0.5wt％～1wt％。交联剂的用量为150～300μL，更优选为200～250μL。
根据本发明的一个具体实施方式，向步骤2)处理后的茶渣中加入浓度为0.5wt％的戊二醛溶液200μL。根据本发明的另一个具体实施方式，向步骤2)处理后的茶渣中加入浓度为1wt％的聚乙二醇二缩水甘油醚溶液200μL。
根据本发明的方法，优选地，在步骤3)中，一次孵育的条件为：在温度20～40℃下，在转速100～200rpm的摇床中混合孵育1～3h。更优选地，在温度25～35℃，转速130～180rpm的摇床中混合孵育1.5～2.5h。上述孵育条件能使交联剂充分地接枝到茶渣上。
将一次孵育后的茶渣洗涤和烘干。采用300～800μL溶剂洗涤茶渣2～5次，洗去未固定到茶渣上的交联剂。溶剂选自去离子水、超纯水、双蒸水、纯水和蒸馏水中的任意一种。优选地，采用500μL双蒸水洗涤茶渣3次。采用双蒸水清洗茶渣，成本低廉，绿色环保，适合工业化生产。将洗涤后的茶渣烘干。烘干条件为：20～40℃干燥0.5～2h，优选为25～35℃干燥0.5～1h。上述干燥所用设备可以为烘箱等。
向烘干后的茶渣中加入酶液进行二次孵育。根据本发明的方法，优选地，在步骤3)中，酶液的浓度为0.5～100μg/mL。根据本发明的方法，优选地，酶液中所含的酶选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶或蛋白酶中的一种。更优选地，酶液中所含的酶为脂肪酶。这样可以进一步提高固定化酶的重复利用率。
向烘干后的茶渣中加入30～100μL浓度为0.5～100μg/mL的酶液。优选地，向烘干后的茶渣中加入30～70μL浓度为5～50μg/mL的酶液。根据本发明的一个具体实施方式，向烘干后的茶渣中加入30μL浓度为10μg/mL的脂肪酶酶液。脂肪酶即三酰基甘油水解酶，能够催化油脂水解和进行转酯化反应。脂肪酶催化油脂后生成游离的脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯；也可以催化甘油三酯与短链醇之间的酯交换反应，生成产物甘油酯和单链脂肪酸酯。
根据本发明的方法，优选地，在步骤3)中，二次孵育的条件为：在温度20～40℃下，在转速100～200rpm的条件下混合孵育8～10h。更优选地，在温度25～35℃下，在转速130～180rpm的条件下混合孵育8～9h。上述孵育条件可以使酶充分固定于茶渣上。
将二次孵育后的茶渣洗涤和烘干。采用pH6～8的磷酸盐缓冲液洗涤茶渣2～5次，洗去未固定到茶渣上的酶。优选地，采用pH6～8的磷酸盐缓冲液洗涤茶渣3次。这样既可以将茶渣上未固定的酶洗去，还可以节约资源，减少浪费。将洗涤后的茶渣烘干。烘干条件为：在20～40℃干燥1～3h，优选为在25～35℃干燥1.5～2.5h。上述干燥所用设备可以为烘箱等。
另一方面，本发明还提供一种固定化酶，其为以茶渣为载体的固定化酶，通过上述方法制备。这里不再赘述。本发明的固定化酶重复利用8次后酶活性保持在75％以上，优选为76％以上，更优选为78％以上。
再一方面，本发明还提供一种茶渣在作为固定化酶载体中的用途。该茶渣能够使得固定化酶重复利用8次后酶活性保持在75％以上，优选为76％以上，更优选为78％以上。
本发明将茶渣作为固定化酶载体，负载酶制得固定化酶。这样的固定化酶直接用于酶催化反应，方法简单易行，成本低，制备时间短，为茶渣开发出一个全新的资源化利用领域。此外，本发明的方法制备得到的固定化酶重复利用率高。本发明既解决了大量茶渣无法被利用，造成资源浪费的问题，又解决了酶稳定性差，可重复利用率低的问题。
附图说明
图1为实施例1制备的固定化脂肪酶的重复利用效率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
(1)称取0.05g茶渣，高速粉碎机粉碎，过35目筛，收集茶渣。
(2)将步骤(1)处理后的茶渣用乙酸乙酯浸润，超声波处理2h；离心后，在80℃干燥2h；再用10g/L的山梨醇溶液浸润6h，然后在80℃干燥2h。
(3)向步骤(2)处理后的茶渣中加入200μL浓度为0.5wt％的戊二醛溶液，在温度为30℃、转速为150rpm的摇床内孵育1.5h；然后用500μL双蒸水洗涤3次，去除过量的戊二醛溶液；再在30℃干燥30min；向干燥后的茶渣中加入30μL浓度为10μg/mL的脂肪酶酶液(Lipase，三酰基甘油水解酶，EC3.1.1.3)，继续在温度为30℃、转速为150rpm的摇床内混合孵育8h；用pH为6～8的磷酸盐缓冲液洗涤3次，洗去未固定到茶渣上的酶；将洗涤后的茶渣在30℃干燥2h，即得固定化脂肪酶。
以月桂酸4-硝基苯酯为底物，检测固定化脂肪酶酶活性。
将一次酶促反应后的茶渣固定化酶用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再进行二次酶促反应，检测酶活性，以此类推，计算固定化脂肪酶的重复利用率。
经检测，用本发明的方法将脂肪酶负载于茶渣固定化后，固定化脂肪酶重复利用8次后酶活性保持在76％，仍具有较高活性，如图1所示。
实施例2
(1)称取0.05g茶渣，高速粉碎机粉碎，过100目筛，收集茶渣。
(2)将步骤(1)处理后的茶渣用异丙醇浸润，超声波处理2h；离心后，在80℃干燥2h烘干；再用10g/L的山梨醇溶液浸润6h，然后在80℃干燥2h。
(3)向步骤(2)处理后的茶渣中加入200μL浓度为1wt％的聚乙二醇二缩水甘油醚溶液，在温度为30℃、转速为150rpm的摇床内孵育1.5h；然后用500μL双蒸水洗涤3次，去除过量的聚乙二醇二缩水甘油醚溶液；再在30℃干燥1h；向干燥后的茶渣中加入30μL浓度为10μg/mL的脂肪酶酶液(Lipase，三酰基甘油水解酶，EC3.1.1.3)，继续在温度为30℃、转速为150rpm的摇床内混合孵育8h；用pH为6～8的磷酸盐缓冲液洗涤3次，洗去未固定到茶渣上的酶；将洗涤后的茶渣在30℃干燥2h，即得固定化脂肪酶。
以月桂酸4-硝基苯酯为底物，检测固定化脂肪酶酶活性。
将一次酶促反应后的茶渣固定化酶用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再进行二次酶促反应，检测酶活性，以此类推，计算固定化脂肪酶的重复利用率。
经检测，用本发明的方法将脂肪酶负载于茶渣固定化后，固定化脂肪酶重复利用8次后酶活性保持在78％，仍具有较高活性。作为交联剂，聚乙二醇二缩水甘油醚的固定化效果优于戊二醛。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
Claims (10)
1.一种制备固定化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)称取0.05～0.1g的茶渣，粉碎，过筛，收集粒径均一的茶渣；
2)将步骤1)处理后的茶渣用有机溶剂浸润，并超声波处理1～6h，离心后一次烘干，再用10～20g/L的山梨醇溶液浸润6～10h，二次烘干；
3)向步骤2)处理后的茶渣中加入浓度为0.5wt％～1.5wt％的交联剂150～300μL，一次孵育1～5h，洗涤、烘干，再加入30～100μL的酶液，二次孵育5～10h，洗涤、烘干，即得固定化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述茶渣选自以下组之一：
(1)茶叶经提取工艺处理后再干燥得到的茶叶废弃物，或者
(2)茶叶经冲泡后再干燥得到的茶叶废弃物；
所述过筛所用筛网的目数为35～300目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述有机溶剂为异丙醇、正己烷或乙酸乙酯；超声波处理的时间为2～4h；一次烘干为在60～80℃下干燥0.5～2h，二次烘干为在60～80℃下干燥0.5～2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述交联剂选自戊二醛溶液、新戊二醇二缩水甘油醚溶液或聚乙二醇二缩水甘油醚溶液中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，一次孵育的条件为：在温度20～40℃下，在转速100～200rpm的摇床中混合孵育1～3h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，酶液的浓度为0.5～100μg/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述酶液中所含的酶选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶或蛋白酶中的一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，二次孵育的条件为：在温度20～40℃下，在转速100～200rpm的条件下混合孵育8～10h。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的固定化酶，其为以茶渣为载体的固定化酶，该固定化酶重复利用8次后酶活性保持在75％以上。
10.一种茶渣在作为固定化酶载体中的用途，其特征在于，该茶渣使得固定化酶重复利用8次后酶活性保持在75％以上。
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