CN105154425B

CN105154425B - 一种生物酶反应器的构建方法

Info

Publication number: CN105154425B
Application number: CN201510660603.9A
Authority: CN
Inventors: 王立晖; 刘鑫龙; 龙尾; 安娜; 王鹿; 张颖; 东方
Original assignee: Tianjin Modern Vocational Technology College
Current assignee: Tianjin Modern Vocational Technology College
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2035-10-14
Also published as: CN105154425A

Abstract

本发明创造提供一种生物酶反应器的构建方法，通过包括下述的步骤获得：将酶液、十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液、鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液、模板剂水溶液混合，得到混合乳液，然后将混合乳液中部分溶剂蒸发，再加水调节模板剂浓度后，加入前驱体，充分反应后获得生物酶反应器。本发明创造解决了现有技术中存在的因生物酶在反应中难以获得最佳催化微环境，使得固定化酶的稳定性、重复使用性、催化活性以及反应传质效率难以满足需求的问题。

Description

一种生物酶反应器的构建方法

技术领域

本发明创造属于生物酶反应器的构建技术领域，涉及一种新型的生物酶反应器的构建方法。

背景技术

面对越来越严重的环境危机和能源危机，环境友好型的催化剂逐渐被大家认同。酶催化因其具有反应条件温和、专一性强、效率高等优势而得到越来越多的关注。但是，游离酶对所处环境十分敏感，在强碱、强酸、高温及部分有机溶剂中不够稳定，容易变性失活。而酶的固定化不仅可提高酶的稳定性，还有利于酶的回收和重复利用及连续自动化生产，这对降低生产成本，提高生产效率具有重要意义。

利用固体材料作为酶的载体，通过为酶构建一个适宜的催化微环境，从而提高酶的稳定性和催化活性。在众多研究的材料中，二氧化硅材料的结构最简单、成本最低廉，尤其是通过溶胶-凝胶方法制备的，也是最安全的材料，无论是对环境，还是对于人体健康。对于酶的固定化，当前最主要的方法是将酶吸附到预合成的硅材料中，而硅材料结构的不同对固定化后酶的性能有重要影响。Hollmann等人采用溶胶-凝胶法将漆酶固定在硅材料中并用于去除雌激素，在反应过程中固定化后的漆酶热稳定性和有机溶剂耐受性都得到了不同程度的提升(Immobilization of Laccase by Encapsulation in A Sol–Gel Matrixand Its Characterization and Use for the Removal of Estrogens，Biotechnol.Prog.,2011,27,6)，但因为扩散抑制效应的存在，使得反应时间较长，产率相对降低，不利于实际应用。而Bernal课题组通过将β-半乳糖苷酶固定于大孔二氧化硅中，在提高了热稳定性和溶剂耐受性的基础上，一定程度上降低了扩散抑制的影响，提高了固定化酶的催化活性(Hierarchically Porous Rutile Titania:Harnessing SpontaneousCompositional Change in Mixed-Metal Oxides,Chemistry of Mater ials,2006,18,6345-6351)，尽管酶在固定化后，热稳定性和催化活性都有了一定程度的提高，但在重复使用过程中酶分子极易从孔中脱落，导致催化活性降低的现象非常严重，重复使用性无法满足需要。造成这些现象的原因，可以说在设计载体材料的时候，没有考虑到酶分子的结构特征和催化过程的需求，导致酶分子无法在反应环境中充分展现自身的催化性能。

发明内容

本发明创造为解决现有技术中的问题，提供了一种生物酶反应器的构建方法，解决了现有技术中存在的因生物酶在反应中难以获得最佳催化微环境，使得固定化酶的稳定性、重复使用性、催化活性以及反应传质效率难以满足需求的问题。

本发明创造提供的生物酶反应器的构建方法，通过包括下述的步骤获得：将酶液、十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液(溶液A)、鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液(溶液B)、模板剂水溶液混合(溶液C)，得到混合乳液(乳液D)，然后将混合乳液(乳液D)中部分溶剂蒸发，再加水调节模板剂浓度后，加入前驱体，充分反应后获得生物酶反应器。

其中，溶液A中十六烷基棕榈酸酯的含量为5-15wt％，溶液B中鸡蛋卵磷脂的含量为0.1-0.5wt％，溶液C中模板剂的含量为2.5-4.5wt％；该三种溶液的质量用量比为溶液A：溶液B：溶液C＝(1-2)：(0.3-0.9)：(8-15)。

其中，所述酶液、溶液A、溶液B、溶液C的混合方式和顺序无限制，优选的，先将酶液在震荡条件下加入溶液A，然后向其中缓慢加入溶液B，然后在连续搅拌条件下，将上述酶液、溶液A和溶液B的混合液加入到溶液C中，能够为构建稳定的双水相微环境提供有利条件。

其中，所述乳液D中60wt％以上的溶剂被蒸发，优选为80wt％以上。

其中，所述乳液D部分溶剂被蒸发后，加水将模板剂的浓度调整至2.5-4.5wt％。

其中，前驱体的加入量为V_模板剂/V_前驱体＝0.01-0.05。

其中，在上述过程中加入前驱体后，将混合物于35-50℃反应釜静置，水解缩合反应充分进行后，减压过滤并去除模板剂，得到生物酶反应器。

进一步，所述水解缩合反应的温度优选为40±2℃。

进一步，所述去除模板剂的过程采用乙醇洗涤反应产物12h。

其中，所述前驱体可以为二(三乙氧基硅基)烷类、二(三乙氧基硅基)稀类、二(三乙氧基硅基)苯类、二(三乙氧基硅基)噻吩类、正硅酸烷基酯类或戊基硅倍半硅氧烷类化合物；优选为钛酸酯化合物，更优选为钛酸正丁酯、四异丙基钛酸酯、二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯。

其中，所述模板剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，优选为P123(EO₂₀PO₇₀EO₂₀)、F127(EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆)、或聚环氧乙烷-聚(乳酸-羟基乙酸)-聚环氧乙烷。

本发明创造构建的生物酶反应器，具有介孔-微孔兼备、孔径大小一定、表面亲疏水性质满足需要的优良性质。在模板剂的作用下，通过构建多相双乳液体系和仿生钛化过程，能够有效且灵活调节孔道结构特征和表面性质，同时实现脂肪酶的固定化，有效提高了酶的稳定性、催化活性和重复利用性能，简化了反应结束后回收催化剂的操作，并能够满足连续自动化催化生产的需要。采用本发明创造获得的生物酶反应器作为合成生物柴油的催化剂，生物柴油得率可达85％、甚至90％以上，且重复利用15次以上的反应产物得率无明显下降，得率下降率不超过8％。

附图说明

图1是生物酶反应器结构示意图，其中，蓝色(A)部分为含有孔道的硅或钛结构，白色部分(B)为材料中的空洞，内部存在的为生物酶分子。

具体实施方式

下面通过结合附图对本发明创造进行进一步说明。为叙述方便，具体实施过程中略去了对一些公知的或常规的过程或手段的具体描述。

实施例1

将5wt％的假丝酵母脂肪酶液在震荡条件下倒入1.1g 10.5wt％十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液，然后缓缓向混合液中加入0.3g 0.25wt％鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液，最后在连续搅拌条件下，将上述溶液加入到12g的3.45wt％的P123水溶液中，得混合乳液。将上述混合乳液中80wt％溶剂蒸发，加水调节乳液中P123的浓度为3.45wt％。在中性条件下，向其中加入钛酸正丁酯(TBT)，V_P123/V_TBT＝0.018，将混合物于40℃反应釜静置，使水解和缩合反应充分进行。24h后减压过滤，并用乙醇洗涤材料12h后去除模板剂，重新获得粒状粉末即为生物酶反应器。

在25ml容器内，加入0.42g油酸和一定量的乙醇(醇油摩尔比2:1)，正己烷作为共溶剂，加入上述生物酶反应器，置于恒温水浴摇床35℃，200r/min振荡反应10h，利用气相色谱检测并计算生物柴油得率。过滤将回收的反应器加入下一批次底物中进行反应并测得产物得率。本例中生物酶反应器催化合成的生物柴油的得率达到了96％，重复使用15次后，产物得率为94％。

实例2

将实例1中的10.5wt％十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液溶度改为14wt％，0.25wt％鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液溶度改为0.4wt％，P123水溶液的用量变为14.5g，浓度为4.0wt％，钛酸正丁酯(TBT)的用量调节为V_P123/V_TBT＝0.03。以其作为催化剂，首次使用生物柴油得率约为87％。生物酶反应器重复利用15次后，生物柴油得率为79％。

实例3

将实例1中的钛酸正丁酯更换为正硅酸乙酯(TEOS)，调节用量为V_P123/V_TEOS＝0.016。以其作为催化剂，首次使用生物柴油得率约为90％。生物酶反应器重复利用15次后，生物柴油得率为55％。

实例4

将实例1中的假丝酵母脂肪酶更换为洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，P123水溶液的用量变为10g，浓度为3.25wt％，钛酸正丁酯(TBT)的用量调节为V_P123/V_TBT＝0.027。以其作为催化剂，首次使用生物柴油得率约为95％。生物酶反应器重复利用15次后，生物柴油得率为94％。

实例5

将实例1中的生物酶反应器置于柱状结构中并与蠕动泵相连，将底物置于原料罐中，流速5L/h，循环5h后生物柴油产率达94％。更换新的底物继续反应，重复更换15次后，生物柴油得率为94％。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims

1.一种生物酶反应器的构建方法，通过包括下述的步骤获得：将酶液、十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液、鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液、模板剂水溶液混合，得到混合乳液，然后将混合乳液中部分溶剂蒸发，再加水调节模板剂浓度后，加入前驱体，充分反应后获得生物酶反应器。

2.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液中十六烷基棕榈酸酯的含量为5-15wt％，鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液中鸡蛋卵磷脂的含量为0.1-0.5wt％，模板剂水溶液中模板剂的含量为2.5-4.5wt％；且十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液、鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液、模板剂水溶液的质量用量比为十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液：鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液：模板剂水溶液＝(1-2)：(0.3-0.9)：(8-15)。

3.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，先将酶液在震荡条件下加入十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液，然后向其中缓慢加入鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液，然后在连续搅拌条件下，将上述酶液、十六烷基棕榈酸酯的柠檬油精溶液和鸡蛋卵磷脂的异丙醇溶液的混合液加入到模板剂水溶液中，得到混合乳液。

4.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述混合乳液中60wt％以上的溶剂被蒸发。

5.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述混合乳液中80wt％以上的溶剂被蒸发。

6.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述混合乳液中部分溶剂被蒸发后，加水将模板剂的浓度调整至2.5-4.5wt％。

7.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，前驱体的加入量为V_模板剂/V_前驱体＝0.01-0.05。

8.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，在加入前驱体后，将混合物于35-50℃反应釜静置，水解缩合反应充分进行后，减压过滤并去除模板剂，得到生物酶反应器。

9.根据权利要求8所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述水解缩合反应的温度为40±2℃。

10.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述前驱体为二(三乙氧基硅基)烷类、二(三乙氧基硅基)稀类、二(三乙氧基硅基)苯类、二(三乙氧基硅基)噻吩类、正硅酸烷基酯类或戊基硅倍半硅氧烷类化合物。

11.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述前驱体为钛酸酯化合物。

12.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述前驱体为钛酸正丁酯、四异丙基钛酸酯、二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯。

13.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述模板剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物。

14.根据权利要求1所述的生物酶反应器的构建方法，其特征在于，所述模板剂为P123(EO₂₀PO₇₀EO₂₀)、F127(EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆)、或聚环氧乙烷-聚(乳酸-羟基乙酸)-聚环氧乙烷。