CN101735999B - 一种固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种固定化酶法转化虎杖提取液提高白藜芦醇的方法，其采用专用固定化酶对虎杖材料粗提液进行生物转化，短时间内使其中白藜芦醇类似物转化为白藜芦醇，然后采用萃取分离技术获得高纯度的白藜芦醇。本发明可提高虎杖材料中白藜芦醇含量10-20倍，避免了同类技术中转化时间过长、催化时间不易控制以及反应完成后酶无法回收造成成本提高的问题，同时采用层析、结晶等分离、精制技术，获得大于95％的白藜芦醇和一定纯度的副产物大黄素两种产品。
Description
技术领域：
本发明涉及生物转化技术及植物中天然活性物质提取领域，特别是提供了一种使用固定化酶转化虎杖材料来提纯白藜芦醇的工艺。
背景技术：
虎杖(Polygonum cuspidatum Sie bet Zucc)为蓼科蓼属小灌木，为我国传统中药，其中富含白藜芦醇(3，4’，5-三羟基反式二苯乙烯，Resvertrol)。白藜芦醇为一种中活性非黄酮多酚物质。广泛存在于葡萄、花生等天然食品或药物中，是一种具有明确生理功能的植物生理活性物质，具有抗癌和治疗心血管疾病的功效。
查新发现，国内外对于“生物转化法提取白藜芦醇”方面的文献和专利已有报道。如中国专利CN101255449工艺为：选择专用菌种，于产酶培养基中，25℃-50℃下培养，收集上清液为粗酶液。然后将含有白藜芦醇苷的样品粉碎至60目，按一定比例加入粗酶液，静置转化10-24h后，通过乙醇加热回流方式进行提取，得到白藜芦醇粗品。中国专利CN101338327A提供了一种从虎杖中提取纯度98％以上白藜芦醇的工艺，首先将虎杖粉碎后经乙醇提取，浓缩回收后使用酶在45℃-50℃恒温酶解4-5天，然后将酶灭活过滤，滤渣经絮凝过滤处理后使用氧化铝层析精制，最后经结晶干燥得到产品。《中国传统医药》(2009.09)发表李易非等人论文，介绍了一种酶解法提取虎杖中白藜芦醇的工艺，《中国现代医药》(2008.02)发表李胜银等人的论文，介绍了一种利用纤维素酶提取虎杖中白藜芦醇的研究成果。
经文献查新得知，目前利用生物转化法生产高纯度白藜芦醇的方法已经有很多中。但是普遍存在着酶解时间过长，酶解时间难以控制，工艺复杂，转化率较低的问题，最重要的其他方法转化后无法将酶回收再次利用，无形中提高了白藜芦醇的生产成本。
发明内容
本发明的目的就在于为了克服上述缺陷，提供一种使用固定化酶技术从虎杖中生产高纯度白藜芦醇的工艺，可提高虎杖材料中白藜芦醇含量10-20倍，避免了同类技术中转化时间过长、催化时间不易控制以及反应完成后酶无法回收造成成本提高的问题。
为达到上述目的，本发明的工艺步骤包括：
a)选择活力大于或等于5000U/g的β-葡萄糖苷酶，配制20％浓度的酶液；
b)将海藻酸钠在常温下置于蒸馏水中并搅拌均匀，海藻酸钠和蒸馏水的重量比为2～5∶100，静置溶胀20min，然后在70～100℃下隔水加热，使其充分溶解，完成后冷却至45℃以下；
c)将酶液倾入海藻酸钠凝胶中，充分搅拌均匀，匀速滴入2～5％浓度的CaCl2溶液中形成凝胶颗粒，调整流速使形成的颗粒直径在2～4mm之间，完成后滤出颗粒，使用蒸馏水冲洗后再次加入到2～5％浓度的CaCl2溶液中，于4～10℃下静置4～6h，然后滤出颗粒，用蒸馏水充分冲洗，使用吸水纸张隔纱布将颗粒表面水分吸干，即得固定化酶，密封保存于4～10℃条件下；
d)选取虎杖，充分阴干，经粉碎机粉碎，过40～60目筛；
e)将粉碎后的虎杖加入浓度为80～95％的乙醇，在30～35℃下对混合体系进行超声波处理，料液比为虎杖∶乙醇＝1g∶3ml，功率80～150W，提取3次，每次1～2h，完成后抽滤并合并滤液；
f)将滤液蒸发至原体积的6～9％，然后向其中补充水，调pH至4.0～6.0，备用；
g)向上步所得提取液中加入固定化酶，提取液∶固定化酶＝1ml∶0.03～0.1g，在45～55℃下低速搅拌15～24h，催化完成后将固定化酶滤出；
h)对催化完成后的粗提液按体积比粗体液∶乙酸乙酯＝1∶3～5的比例萃取三次，萃取合并乙酸乙酯，得白藜芦醇粗提物；
i)然后柱层析分离，浓缩，结晶，得白藜芦醇精品。
步骤d)中，隔水加热的优化温度为80～90℃。
步骤c)中，CaCl2溶液的最合适浓度为2.5～3％。
步骤g)中，催化反应的最合适温度为49～50℃。
其利用酶固定化技术，提高了转化酶的稳定性，同时转化后固定化酶可以快速与反应物分离，避免了转化后残余酶对后续分离纯化过程的影响，提高虎杖材料中白藜芦醇含量10倍以上。而且酶可以重复使用数次，辅以微波低温、快速提取技术，简化生产工艺和操作，缩短生产周期，大幅降低生产成本，提高了产品质量，结合层析，结晶等分离精制技术，可以获得95％的白藜芦醇和一定纯度副产物大黄素等两种产品。
具体实施方式
实施例1：
1、固定化酶的制作：
a)购置β-葡萄糖苷酶，活力大于或等于5000U/g，然后配制20％浓度的酶液备用。
b)按海藻酸钠和蒸馏水重量配比为2～5∶100称取海藻酸钠和蒸馏水，将海藻酸钠在常温下加入蒸馏水中搅拌均匀，静置溶胀20min，然后在80～90℃下隔水加热，使其充分溶解，以颜色均匀，无凝结颗粒状为标准，完成后冷却至45℃以下。
c)将准备好的酶液倾入海藻酸钠凝胶中，充分搅拌至均匀，然后使用注射器或者横流泵，通过7号针头匀速滴入2.5～3％浓度的CaCl2溶液中形成凝胶颗粒，调整流速使形成的颗粒直径在2～4mm之间，完成后滤出颗粒，使用蒸馏水冲洗后再次加入2.5～3％浓度的CaCl2溶液中，于4～10℃下静置4～6h，然后滤出颗粒，用蒸馏水充分冲洗，使用吸水纸张隔纱布将颗粒表面水分吸干，即得固定化酶，密封保存于4～10℃条件下。
2、虎杖粗提液的制备：
d)选取虎杖，充分阴干，经粉碎机粉碎，过40～60目筛。
e)超声波辅助提取：将粉碎后的虎杖，使用80～95％乙醇以1g∶3mL的比例(虎杖干重：乙醇体积，虎杖单位为g，甲醇单位为mL)混合，在30～35℃下对混合体系使用超声波处理，功率控制在80～150W，提取3次，每次1～2h，完成后抽滤并合并滤液。
f)将滤液蒸发至原体积的6～9％，然后向其中补充上步骤中所使用的乙醇体积5～10％的水，调pH至4.0～6.0之间，备用。
3、虎杖粗提液的转化及提取
j)向上步提取液中加入的固定化酶，提取液∶固定化酶＝1ml∶0.03～0.1g，在49～50℃下低速搅拌15～24h。催化完成后将固定化酶滤出，蒸馏水冲洗后保存，可重复使用。
h)对催化完成后的粗提液按体积比粗体液∶乙酸乙酯＝1∶5的比例萃取三次，合并乙酸乙酯，既得白藜芦醇粗提物。
i)白藜芦醇的精制：采用柱层析分离，浓缩，结晶，得白藜芦醇精品
实施例2：
1、固定化酶的制作：同实施例1
2、虎杖粗提液的制备：
a)选取虎杖，充分阴干，经粉碎机粉碎，过40～60目筛。
b)超声波辅助提取：使用80～95％甲醇以1∶3的比例(虎杖干重：甲醇体积，虎杖单位为g，甲醇单位为mL)在30～35℃下对混合体系使用超声波处理，功率控制在80～150W，提取3次，每次1～1.5h，完成后抽滤并合并滤液。
c)将滤液蒸发至原体积的6～9％，然后向其中补充原乙醇体积5～10％的水，调pH至4.0～6.0之间，备用。
3、虎杖粗提液的转化及精提：
d)向上步提取液中加入提取液重量5％的固定化酶，在提取液上方按粗提液：乙酸乙酯＝1∶3的比例加入乙酸乙酯，在45～52℃下用搅拌机低速搅拌15～24h。
e)催化过程中，每隔5～8h更换乙酸乙酯1次，重复三次，合并乙酸乙酯层备用。
f)完成后将乙酸乙酯完全取出，以防止固定化酶被污染，乙酸乙酯层完全取出后，将固定化酶滤出，蒸馏水冲洗后保存，可重复使用。
4.白藜芦醇的精制
采用常规方法柱层析分离，浓缩，结晶，得白藜芦醇精品。
Claims (4)
1.一种固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法，其特征在于，步骤包括：
a)选择活力大于或等于5000U/g的β-葡萄糖苷酶，配制20％浓度的酶液；
b)将海藻酸钠在常温下置于蒸馏水中并搅拌均匀，海藻酸钠和蒸馏水的重量比为2～5∶100，静置溶胀20min，然后在70～100℃下隔水加热，使其充分溶解，完成后冷却至45℃以下；
c)将酶液倾入海藻酸钠凝胶中，充分搅拌均匀，匀速滴入2～5％浓度的CaCl2溶液中形成凝胶颗粒，调整流速使形成的颗粒直径在2～4mm之间，完成后滤出颗粒，使用蒸馏水冲洗后再次加入到2～5％浓度的CaCl2溶液中，于4～10℃下静置4～6h，然后滤出颗粒，用蒸馏水充分冲洗，使用吸水纸张隔纱布将颗粒表面水分吸干，即得固定化酶，密封保存于4～10℃条件下；
d)选取虎杖，充分阴干，经粉碎机粉碎，过40～60目筛；
e)将粉碎后的虎杖加入浓度为80～95％的乙醇，在30～35℃下对混合体系进行超声波处理，料液比为虎杖∶乙醇＝1g∶3ml，功率80～150W，提取3次，每次1～2h，完成后抽滤并合并滤液；
f)将滤液蒸发至原体积的6～9％，然后向其中补充水，调pH至4.0～6.0，备用，补充水量为上步骤中所使用的乙醇体积的5～10％；
g)向上步所得提取液中加入固定化酶，提取液∶固定化酶＝1ml∶0.03～0.1g，在45～55℃下低速搅拌15～24h，催化完成后将固定化酶滤出；
h)对催化完成后的粗提液按体积比粗体液∶乙酸乙酯＝1∶3～5的比例萃取三次，萃取合并乙酸乙酯，得白藜芦醇粗提物；
i)然后柱层析分离，浓缩，结晶，得白藜芦醇精品。
2.根据权利要求1所述的固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法，其特征在于，步骤b)中，隔水加热的优化温度为80-90℃。
3.根据权利要求1所述的固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法，其特征在于，步骤c)中，CaCl2溶液的最合适浓度为2.5-3％。
4.根据权利要求1所述的固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法，其特征在于，步骤g)中，催化反应的最合适温度为49-50℃。
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