CN112824524B - 一株产细菌纤维素菌株及其分离鉴定及产量分析 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产细菌纤维素菌株及其分离鉴定及产量分析。本发明提供了木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11，其保藏编号为CGMCC No.18442，该菌能够在发酵罐条件下生产细菌纤维素，发酵时间短(仅需约3天)，生产效率较高，产物在发酵罐中聚集成絮状，方便分离提取，具有进行工业化生产的潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产细菌纤维素菌株及其分离鉴定及产量分析。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial cellulose)是指在一定条件下，某些细菌合成的一种多孔性网状高分子聚合物，即β-1,4-糖苷键连接的D-葡萄糖链状聚合物，因此也称为β-1,4-葡聚糖。在醋杆菌(Acetobacter)，葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)，驹形杆菌(Komagataeibacter)，土壤杆菌(Agrobacterium)，无色杆菌(Achromobacter)，沙门氏菌(Salmonella)、肠杆菌(Enterobacter)，埃希氏菌(Escherichia)，假单胞菌(Pseudomonas)等细菌中都发现了合成细菌纤维素的能力。
细菌纤维素在化学纯度、吸水性和生物可降解性等方面均优于植物纤维素，被认为是一种性能优异的新型材料。首先细菌纤维素没有植物来源纤维素中的木质素和半纤维素等杂质，在工业生产中提取过程相对简单，纯度可以达到95％。细菌纤维素的直径在0.1-0.01μm(植物纤维素为10μm)，这种纤维组成的三维网状结构，存在有许多间隙空间，具有良好的透气和吸水性，远优于植物纤维素的性能。由于纯度较高，细菌纤维素在纤维素酶或酸性条件下较容易降解，是生态环境友好产品。由于以上这些特性，细菌纤维素有望广泛用于食品、医药、化妆品、造纸、纺织和化工等领域。
目前生产过程中，大部分菌株生长速度较慢，而且产量偏低，这种状况极大的限制了细菌纤维素的广泛使用。因此，获得生长速度相对较快并且稳定高产菌株对细菌纤维素的实际应用有重要意义。为了降低生产成本，获得纤维素高产量和遗传代谢稳定的菌株是一个重要方法。
发明内容
本发明的目的是提供一株产细菌纤维素菌株及其分离鉴定及产量分析。
本发明提供的木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11，已于2019年08月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号CGMCCNo.18442。
本发明保护所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11在生产纤维素中的应用。
本发明还保护菌剂，含有所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11。
本发明还保护所述菌剂在生产纤维素中的应用。
本发明还保护一种生产纤维素的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11，从培养物中得到纤维素。
所述培养物是将所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11接种于发酵培养基进行发酵培养得到的培养物；所述发酵培养基中的溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨4-6g/L、酵母粉4-6g/L、磷酸氢二钠2-3g/L、一水合柠檬酸1-2g/L。
所述发酵培养基中的溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸氢二钠2.7g/L、一水合柠檬酸1.15g/L。
所述发酵培养基的溶剂为水。
所述发酵培养基的pH为5.0
所述发酵培养条件如下：温度为30℃,搅拌速度为600-900rpm，通气量为0.1-2VVM，溶氧＝30％，全过程流加葡萄糖80g/L，pH为5.0。
所述培养时间具体可为3天。
所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11可以通过种子液的形式接种于发酵培养基中。所述接种比例具体可为10％(体积百分含量)。
所述种子液的OD600可为3-5。
所述种子液的制备方法包括如下步骤：将所述木驹形杆菌(komagataeibacterxylinus)BJ11接种于前文所述的发酵培养基中，30℃、200rpm振荡培养1天。
所述从培养物中得到纤维素的方法包括如下步骤：(A)将培养物离心收集沉淀，将沉淀用清水浸泡(具体可为10min)除去膜表面培养基及杂质；(B)完成步骤(A)后，将沉淀转移至0.1％(质量百分含量)的NaOH水溶液中浸泡(80℃浸泡2小时)，除去菌体和残留的培养基；(C)完成步骤(B)后，将沉淀用1％(质量百分含量)乙酸水溶液及蒸馏水洗2-3次至中性；(D)完成步骤(C)后，将沉淀在纱布中拧干后放在80℃的烘箱中烘干24h。
本发明还保护用于生产纤维素的产品，包括所述木驹形杆菌(komagataeibacterxylinus)BJ11和前文所述的发酵培养基。
以上任一所述纤维素为细菌纤维素。
本发明提供了一株能够稳定生产细菌纤维素的木驹形杆菌，该菌能够在发酵罐条件下生产细菌纤维素，发酵时间短(仅需约3天)，生产效率较高，产物在发酵罐中聚集成絮状，方便分离提取，具有进行工业化生产的潜力。
附图说明
图1为三角瓶中发酵产物。
图2为分离培养基平板上菌落形态。
图3为发酵罐中发酵产物。
图4为在显微镜下观察(4×10倍)纤维丝被染成红色。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、细菌纤维素生产菌株的分离筛选
一、细菌纤维素生产菌株的分离筛选
1、取腐烂苹果约1克，用无菌水浸润后涂布至接种于液体分离培养基中，30℃静态培养4-5天。
液体分离培养基配方(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨5.0,酵母粉5.0，磷酸氢二钠2.7，一水合柠檬酸1.15；溶剂为水；调节pH至5.0。
2、完成步骤1后，挑选有白色絮状物质出现的试管，将培养液进行系列稀释，涂布在固体分离培养基上，30℃静态培养3-5天。
固体分离培养基配方(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨5.0,酵母粉5.0，磷酸氢二钠2.7，一水合柠檬酸1.15，琼脂粉15；溶剂为水；调节pH至5.0。
3、完成步骤2后，选择菌落明显较大的单菌落，划线转接到同样的固体分离培养基，30℃静态培养3天。
4、完成步骤3后，挑取单菌落，接种液体分离培养基试管中，30℃静态培养3天，挑选出约100株最早出现白色絮状物质的菌株。
5、将步骤4筛选的菌株接种至含液体分离培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养3天，选择10株最早出现白色絮状物质的菌株。
6、将步骤5筛选的菌株接种于液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养至出现大量白色絮状物质(约3-4天)。
液体培养基配方(g/L)：葡萄糖30.0，蛋白胨2.0,酵母粉1.0，磷酸氢二钠2.7，一水合柠檬酸1.15；溶剂为水；调节pH至5.0。
根据絮状物质的湿重，选取最优菌株BJ11(见图1)。
二、菌株BJ11的形态学和分子鉴定
1、菌株BJ11形态特征：革兰氏阴性，好氧，菌落呈白色(图2)，延长时间培养呈浅粉褐色，表面光滑。
2、将菌株BJ11的16S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列1所示。使用BLAST将该序列和GenBank中已经录入的细菌进行同源性对比，结果表明该菌与komagataeibacter xylinus ATCC 53524的16S rDNA序列同源性达99.78％。
经过鉴定，可以确定菌株BJ11属于木驹形杆菌，因此重新将其命名为木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11。
三、木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11的保藏
本发明提供的木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11，已于2019年08月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号CGMCCNo.18442。木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11简称为木驹形杆菌BJ11。
实施例2、木驹形杆菌BJ11生产细菌纤维素
1、将木驹形杆菌BJ11接种于含有发酵培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养1天，得到种子液OD600约为3-5。
发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨5.0,酵母粉5.0，磷酸氢二钠2.7，一水合柠檬酸1.15；溶剂为水；调节pH至5.0。
2、完成步骤1后，将种子液以10％(体积百分含量)接种量接种至含2L发酵培养基的发酵罐进行发酵培养3天。
培养条件：温度为30℃，搅拌速度为600-900rpm，通气量为0.1-2VVM，溶氧＝30％，全过程流加葡萄糖80g/L，利用稀硫酸和氨水控制pH至5.0。
3、完成步骤2后，转移发酵液至烧杯中(图3)，5000rpm离心10min,收集沉淀(纤维素聚集体)，将沉淀用清水浸泡10min，除去膜表面培养基及杂质。
4、完成步骤3后，将沉淀转移至0.1％(质量百分含量)的NaOH水溶液中,在80℃条件下浸泡2小时，除去菌体和残留的培养基。
5、完成步骤4后，将沉淀用1％(质量百分含量)乙酸水溶液及蒸馏水洗2-3次至中性。
6、完成步骤5后，取约1mg沉淀进行刚果红染色，刚果红能特异把纤维素染成红色复合物，是鉴定纤维素产生和降解的常用方法。在显微镜下观察(4×10倍)，分离的沉淀被染成红色，初步表明发酵产物是纤维素(图4)。
7、完成步骤6后，将纤维素在纱布中拧干后放在80℃的烘箱中烘干24h，称重。烘干后检测纤维素产量是5g/L，纤维素的转化率为5g/100g＝5％。
上述结果表明，本发明提供的木驹形杆菌BJ11可以在3天时间内完成发酵生产纤维素，因为发酵时间短，所以生产效率较高。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株产细菌纤维素菌株及其分离鉴定及产量分析
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)
<400> 1
gcccgtaacg acgtggtcgg ctgcgtcctt gcggttcgct caccggctta aggtcaaacc 60
aactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 120
ctgatccgcg attactagcg attccacctt catgcactcg agttgcagag tgcaatccga 180
actgagacgg ctttttgaga tcggctcggt gtcaccacct ggcttcccac tgtcaccgcc 240
attgtagcac gtgtgtagcc caggacataa gggccatgag gacttgacgt catccccacc 300
ttcctccggc ttgtcaccgg cagttccttt agagtgccca cccagacgtg ctggcaacta 360
aaggcgaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
cagccatgca gcacctgtgc tggaggtctc ttgcgagaaa tgcccatctc tggacacggc 480
ctcccgcatg tcaagccctg gtaaggttct gcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540
caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggc cgtactcccc 600
aggcggtgtg cttatcgcgt taactacgac actgaatgac aaagtcaccc aacatccagc 660
acacatcgtt tacagcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 720
gcgcctcagc gtcagtcatg agccaggttg ccgccttcgc caccggtgtt cttcccaata 780
tctacgaatt tcacctctac actgggaatt ccacaaccct ctctcacact ctagtcgcca 840
cgtatcaaat gcagccccca ggttaagccc aggaatttca catctgactg tgtcaaccgc 900
ctacgcgccc tttacgccca gtcattccga gcaacgcttg cccccttcgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gaagttagcc ggggcttctt ctgcgggtac cgtcatcatc gtccccgctg 1020
aaagtgcttt acaatccgaa aaccttcttc acacacgcgg cattgctgga tcaggcttgc 1080
gcccattgtc caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc 1140
ccagtgtggc tgatcatcct ctcagaccag ctatcgatca tcgccttggt aggcctttac 1200
cccaccaact agctaatcga acgcaggttc ctccacaggc gacttgcgcc tttgaccctc 1260
aggtgtcatg cggtattagc ttcagtttcc caaagttatc ccccacccat ggacagatcc 1320
ctacgcgtta ctcacccgtc cgccactaac cccgaaaggt tcgtgcgact tgccatggtg 1380
tc 1382
Claims (11)
1.木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11，其保藏编号为CGMCC No.18442。
2.权利要求1所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11在生产纤维素中的应用。
3.菌剂，含有权利要求1所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11。
4.权利要求3所述菌剂在生产纤维素中的应用。
5.一种生产纤维素的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11，从培养物中得到纤维素。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述培养物是将权利要求1所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11接种于发酵培养基进行发酵培养得到的培养物；所述发酵培养基中的溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨4-6g/L、酵母粉4-6g/L、磷酸氢二钠2-3g/L、一水合柠檬酸1-2g/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述发酵培养基中的溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸氢二钠2.7g/L、一水合柠檬酸1.15g/L。
8.如权利要求6至7任一所述的方法，其特征在于：
所述发酵培养的条件如下：温度为30℃,搅拌速度为600-900rpm，通气量为0.1-2VVM，溶氧＝30％，全过程流加葡萄糖80g/L，pH为5.0。
9.如权利要求5至7任一所述的方法，其特征在于：
所述培养天数为3天。
10.用于生产纤维素的产品，包括权利要求1所述木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)BJ11和发酵培养基；
所述发酵培养基中的溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨4-6g/L、酵母粉4-6g/L、磷酸氢二钠2-3g/L、一水合柠檬酸1-2g/L。
11.如权利要求10所述的产品，其特征在于：所述发酵培养基中的溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸氢二钠2.7g/L、一水合柠檬酸1.15g/L。
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| GR01 | Patent grant | ||
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