CN114480529A - 一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体包括如下步骤：配制种子培养基，向种子培养基中接入汉氏驹形杆菌，培养获得液体发酵菌种，配制液体发酵培养基，将液体发酵菌种接入液体发酵培养基中，培养后结束发酵，将发酵液匀浆漂洗，再碱煮漂洗，烘干称重测定产量，计算发酵得率。其中，在使用通用式机械搅拌发酵罐动态发酵阶段，采用六平叶+BT6的优选搅拌桨组合可以有效地提高发酵罐KLa，提升发酵过程中的溶氧和氧传递效率，从而提高细菌纤维素产量与得率。

Description

一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由醋酸杆菌和驹形杆菌等细菌产生的纤维素。相比于植物纤维素，BC不含半纤维素、木质素，具有纯度高、持水性强、可生物降解、生物相容性好、高比表面积等特性，应用广泛。BC的制备有静态培养和动态培养两种方式，静态培养制备的BC已在食品、医疗领域应用，但是静态培养发酵周期长、占地面积大限制其进一步发展。动态培养方式发酵周期短，但发酵产量低等问题使发酵成本较高，阻碍了其工业化生产，因此动态培养制备BC目前仍处于实验室阶段。
三角瓶虽然操作简便，易获得结果，但是具有体系小、搅拌不均匀的缺点，进一步的研究需要通过发酵罐放大进行。通用式机械搅拌发酵罐是工业化发酵生产的常用设备，其所用的搅拌桨主要分为轴向流搅拌桨和径向流搅拌桨，轴向流搅拌桨传质效率高、剪切均匀，径向流搅拌桨转速大、剪切力大。杨雪霞等研究发现，在机械搅拌罐中培养时，用剪切力大的六叶平桨进行发酵，细菌纤维素的产量最低，而用剪切力较低的框式桨进行发酵，细菌纤维素的产量较高(杨雪霞,董超,陈琳,等.剪切力对木葡糖醋杆菌及细菌纤维素合成的影响[J].纤维素科学与技术,2013,21(2).)。
BC的产率与氧转移速率和氧传递系数KLa成正比。氧气传递与发酵罐中使用的搅拌器的叶轮密切相关。叶轮在发酵过程中保持均匀性和气体传递方面起着至关重要的作用。传统上，六直叶涡轮(RT-6)属于径向流动叶轮，特别适用于传质和气体分散，已广泛用于发酵工业。然而，RT-6有一些缺点，例如输入功率较高，发酵罐中轴向搅拌混合不良，剪切力很高，很容易伤害细胞。轴向流动叶轮能够增加BC产量。值得注意的是，大多数轴向和径向流动叶轮的叶片相对于圆盘平面对称，而以垂直不对称叶片为特征的抛物线型圆盘涡轮搅拌器(BT-6)可以分散比RT-6叶轮多五倍的空气。
发明内容
针对现有发酵条件生产细菌纤维素过程中由于发酵体系中溶氧不足造成细菌纤维素产量低的问题，本发明提供一种了一种可行的应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体的是提供了一种应用不同组合的搅拌桨来提高通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，该方法通过改变发酵罐搅拌桨组合提高发酵体系KLa，并使细菌纤维素产量和得率显著提高。
需要明确的是本发明所用通用式机械搅拌发酵罐为本领域技术人员公知的通用式机械搅拌发酵罐，但是所用通用式机械搅拌发酵罐采用不同组合的搅拌桨来提高发酵体系KLa，并使细菌纤维素产量和得率显著提高。
本发明采用不同组合的搅拌桨来提高BC产量，具体组合有径向流六平叶涡轮搅拌器和三种轴向流搅拌器组合，分别为六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，以及采用径向流六平叶涡轮搅拌器和非对称叶轮叶片为特征的BT-6搅拌器；且本发明提到的不同组合的搅拌桨用于BC发酵还未见报道。
本发明提供了一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，汉氏驹形杆菌在利用通用式机械搅拌发酵罐动态发酵生产细菌纤维素过程中，通过采用不同组合的搅拌桨提高发酵罐KLa，从而提高细菌纤维素产量与得率。
本发明所述汉氏驹形杆菌为汉氏驹形杆菌Komagataeibacter hansenii(Man-170518-hww)，保藏编号为CGMCC No.15468，于2018年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
所述方法具体包括如下步骤：
步骤1、不同发酵罐参数下KLa测定
所述的测定KLa方法为氮气排空法，按照实验条件所需装液量装配发酵罐，控制温度在30℃，打开搅拌桨，设定为200r/min，通气量设定为1vvm，通气15min。对发酵罐溶氧电极进行校正，首先将溶氧电极放入饱和无水亚硫酸钠溶液进行零点校正，然后将溶氧电极放入发酵罐中，通气15min后进行100％溶氧校正。使用软管将氮气充入发酵罐中，观察溶氧值下降至10％以下即可停止充入氮气。向发酵罐中通入空气，待溶氧数值开始上升时，使用秒表开始计时，当溶氧升高到10％时计第一个时间点为t0，然后每隔10％记录一个时间点，直至溶氧回升到70％。记录数据，然后按照公式ln((C*-C)/(C*-C0))＝-KLa(t-t0)计算得到KLa。
所述的发酵罐包括但不限于容积为3L，10L，50L，装液量为60％的发酵罐；
所述的搅拌桨组合包括但不限于六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6(抛物线型圆盘涡轮搅拌器)等；优选地，为六平叶+BT6。
所述的搅拌桨组合在搅拌轴上以任意一种排列方式组合，优选为等距排列。
步骤2、发酵菌体ATP，发酵液残糖浓度及发酵液可溶性多糖含量测定
所述发酵菌体ATP测定参照BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability试剂盒说明书配制ATP测定酶液。取1mL发酵液，3个平行，4000r/min离心5min，去上清液，使用无菌PBS溶液清洗，4000r/min离心5min，重复3次，去上清液，使用无菌PBS重悬得到菌悬液，取100μL菌悬液和100μLATP测定酶液放入多功能酶标仪测定发光值。参照BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability试剂盒说明书计算ATP含量。
所述发酵液残糖浓度测定包括蔗糖含量标准曲线绘制和发酵液中蔗糖、可溶性多糖含量测定。
所述蔗糖含量标准曲线绘制为：准确称取60℃过夜烘干的蔗糖1.0g，搅拌溶于蒸馏水并定容至100mL，即得10g/L蔗糖标准溶液，根据表1添加各试剂混匀后沸水浴10min，直流水降至室温后各管加入1-2滴0.1％酚酞溶液，滴加3mol/L的氢氧化钠溶液涡旋振荡至微红色，各管加入蒸馏水至10mL，涡旋混匀后取1mL加入1.5mLDNS溶液和1mL蒸馏水于干净25mL玻璃试管中，沸水浴5min，加蒸馏水定容至25mL，冷却至室温，测定各管A540，每组三个平行，计算蔗糖标准曲线。
所述发酵液中蔗糖含量测定为：离心发酵液，取上清液用蒸馏水稀释一定倍数，使糖浓度控制在1-10g/L范围内，取稀释后的样品按照表1的5号样品管浓度添加，按照蔗糖含量标准曲线的方法测定A540，所得吸光度数值代入蔗糖测定标准曲线方程中计算发酵液剩余蔗糖含量，每个样品3个平行。
所述发酵液中可溶性多糖含量测定为：发酵液9000r/min离心5min，取上清液加入3倍体积乙醇混匀进行沉淀，9000r/min离心5min，所得沉淀即为可溶性多糖，60℃烘干至恒重，测定干重。每个样品3个平行。
步骤3、配制种子培养基，配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，酵母蛋白胨5g/L，磷酸氢二钠2.7g/L，一水合柠檬酸1.15g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min。
进一步地，所述步骤3中，采用250ml圆底三角瓶装50ml种子培养基或15L种子罐装8.280L种子培养基。
进一步地，所述步骤3中用1M氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整pH。
步骤4、向种子培养基中接入汉氏驹形杆菌，培养获得液体发酵菌种；
所述汉氏驹形杆菌为CGMCC No.15468，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
所述发酵菌种培养方法为：用接种环刮取2环菌苔接入种子培养基中，30℃恒温培养箱中静置培养30h，使用装有无菌脱脂棉的一次性无菌注射器过滤，即得一级种子液，将一级种子液按照8％比例接入种子培养基中，30℃，120rpm动态培养24h，即得液体发酵菌种；
步骤5、配制液体发酵培养基，配方为：蔗糖40g/L，玉米浆干粉30g/L，硫酸铵3.3g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，pH 5.0，121℃灭菌20min。
进一步地，所述步骤5中用1M氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整pH。
步骤6、将步骤4获得的液体发酵菌种接入步骤5配制的液体发酵培养基中，培养后结束发酵；
所述菌种接入液体发酵培养基的方法为将步骤4所述液体发酵菌种混合均匀按8％比例接入含有步骤5配制的液体发酵培养基的通用式机械搅拌发酵罐中。
所述培养条件为30℃，通气量为1vvm，搅拌转速为200-400rpm，动态发酵96h；
所述接种方法为火焰接种，在发酵罐接种口四周点燃酒精棉，将种子液从接种口倒入；
进一步地，所述的发酵罐包括但不限于容积为3L，10L，50L，装液量为60％的发酵罐；优选容积为50L，装液量为60％的发酵罐。
进一步地，所述步骤6中发酵罐搅拌转速优选为前期200rpm，当溶氧降低至10％，转速逐渐增加并维持在400rpm。
进一步地，所述的搅拌桨组合包括但不限于六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6等；优选地，为六平叶+BT6。
进一步地，所用搅拌桨组合在搅拌轴上以任意一种排列方式组合，优选为等距排列。
步骤7、将发酵液匀浆漂洗，再碱煮漂洗即为细菌纤维素，烘干称重测定产量；
所述的发酵液匀浆漂洗方法为：取发酵液50ml，9000rpm离心5min去上清，加入蒸馏水搅拌均匀，9000rpm离心5min去上清，重复两次；
所述的碱煮漂洗方法为在匀浆漂洗物中加入100ml 0.4％氢氧化钠溶液，充分搅拌，100℃水浴煮沸20min，冷水浴降温，9000rpm离心5min去上清，加入150ml蒸馏水搅拌均匀，9000rpm离心5min去上清，重复至漂洗液为中性；
所述烘干条件为烘箱60℃烘干至恒重。
步骤8、通过公式得率＝细菌纤维素产量(g/L)/碳源消耗量(g/L)计算发酵得率，
所述碳源消耗量通过发酵培养基内蔗糖含量(g/L)-发酵结束后发酵液内蔗糖含量(g/L)计算获得。
所述发酵结束后发酵液内蔗糖含量通过DNS比色法测定，具体步骤包括蔗糖标曲绘制和发酵液中蔗糖含量测定，
所述蔗糖标曲绘制和发酵液中蔗糖含量测定同步骤2发酵液残糖浓度测定。
本发明还提供了含有不同组合的搅拌桨的发酵罐在提高发酵体系KLa中的应用。
所述的搅拌桨组合包括但不限于六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6等；优选地，为六平叶+BT6。
本发明还提供了含有不同组合的搅拌桨的发酵罐在提高细菌纤维素产量中的应用。
所述的搅拌桨组合包括但不限于六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6等；优选地，为六平叶+BT6。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提出的发酵罐搅拌桨组合可有效提高发酵罐KLa，氧的传递效率受到KLa影响，在发酵罐中提高KLa，可以提高氧的传递从而解决发酵生产细菌纤维素过程中供氧不足问题，并显著提高细菌纤维素的产量和得率。
(2)本发明提高细菌纤维素产量的方法适用于各种规格发酵罐，适用范围广，可以有效提高细菌纤维素动态发酵产量。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同搅拌桨组合转速与KLa关系；
图2为本发明实施例2中蔗糖测定标准曲线；
图3为本发明实施例3中不同搅拌桨组合对发酵产细菌纤维素产量和得率的影响；
图4为本发明实施例4中不同搅拌桨组合对发酵产细菌纤维素产量和得率的影响；
图5为本发明实施例5中发酵罐离线监测数据。
具体实施方法
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定
实施例1
一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，发酵罐KLa测定步骤如下：
1、3L通用式机械搅拌发酵罐装样量为2L，控制温度在30℃，打开搅拌桨，设定为200r/min，通气量设定为1vvm，通气15min。
2、首先将溶氧电极放入饱和无水亚硫酸钠溶液进行零点校正，然后将溶氧电极放入发酵罐中，通气15min后进行100％溶氧校正。
3、使用软管将氮气充入发酵罐中，观察溶氧值下降至10％以下即可停止充入氮气。
4、向发酵罐中通入空气，待溶氧数值开始上升时，使用秒表开始计时，当溶氧升高到10％时计第一个时间点为t0，然后每隔10％记录一个时间点，直至溶氧回升到70％。记录数据，然后按照公式ln((C*-C)/(C*-C0))＝-KLa(t-t0)计算得到KLa。
实验结果如图1，随着转速的提高，六平叶+BT6的搅拌桨组合KLa最高为144.48±3.25。当转速在200r/min时，4个搅拌桨组合(分别为：六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6)的KLa没有显著性差异，当转速提高到300r/min时，六平叶+BT6的搅拌桨组合和六平叶+三斜叶的搅拌桨组合无显著性差异。进一步提高转速为400r/min时，六平叶+BT6搅拌桨组合KLa最高。因此，六平叶+BT6搅拌桨组合为最优选。
实施例2
一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，发酵菌体ATP，发酵液残糖浓度测定步骤如下：
1、参照BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability试剂盒说明书配制ATP测定酶液。
2、取1mL本发明实施例1中使用六平叶+BT6搅拌桨组合发酵的发酵液，3个平行，4000r/min离心5min，去上清液，使用无菌PBS溶液清洗，4000r/min离心5min，重复3次，去上清液，使用无菌PBS重悬得到菌悬液，取100μL菌悬液和100μLATP测定酶液放入多功能酶标仪测定发光值。
3、参照BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability试剂盒说明书计算ATP含量。
4、准确称取60℃过夜烘干的蔗糖1.0g，搅拌溶于蒸馏水并定容至100mL，即得10g/L蔗糖标准溶液，根据表1添加各试剂混匀后沸水浴10min，直流水降至室温后各管加入1-2滴0.1％酚酞溶液，滴加3mol/L的氢氧化钠溶液涡旋振荡至微红色，各管加入蒸馏水至10mL，涡旋混匀后取1mL加入1.5mLDNS溶液和1mL蒸馏水于干净25mL玻璃试管中，沸水浴5min，加蒸馏水定容至25mL，冷却至室温，测定各管A540，每组三个平行，计算蔗糖标准曲线。
表1，蔗糖标准曲线绘制样品配制体系
Figure BDA0003495271080000071
实验结果如图2所示。
发酵液可溶性多糖含量测定步骤如下：
1.离心使用本发明实施例1中六平叶+BT6搅拌桨组合发酵的发酵液，取上清液用蒸馏水稀释一定倍数，使糖浓度控制在1-10g/L范围内，取稀释后的样品按照表1的5号样品管浓度添加，按照蔗糖含量标准曲线的方法测定A540，所得吸光度数值代入蔗糖测定标准曲线方程中计算发酵液剩余蔗糖含量，每个样品3个平行。
2.发酵液9000r/min离心5min，取上清液加入2-3倍体积乙醇混匀进行沉淀，9000r/min离心5min，所得沉淀即为可溶性多糖，60℃烘干至恒重，测定干重。每个样品3个平行。
实验结果如图5，通过使用六平叶+BT6的搅拌桨组合，保证了发酵菌体内ATP在24h内持续累积，保证了后续自身生长和产物合成的能量供应。
实施例3
一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体包括如下步骤：
1、种子培养基配制：按照葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，酵母蛋白胨5g/L，磷酸氢二钠2.7g/L，一水合柠檬酸1.15g/L配制培养基，调整pH为6.0，分装至250ml圆底三角瓶中，每瓶50ml，115℃灭菌20min。
2、液体发酵菌种培养：用接种环刮取2环汉氏驹形杆菌CGMCC No.15468菌苔接入种子培养基中，30℃恒温培养箱中静置培养30h，使用装有无菌脱脂棉的一次性无菌注射器过滤，得一级种子液，将一级种子液按照8％比例接入种子培养基中，30℃，120rpm动态培养24h，得液体发酵菌种；
3、液体发酵培养基配制：按照蔗糖40g/L，玉米浆干粉30g/L，硫酸铵3.3g/L，七水合硫酸镁0.25g/L配制培养基，调整pH为5.0，分装至3L通用式机械搅拌发酵罐中，每罐1.656L，121℃灭菌20min。
4、接种与发酵：采用火焰接种法，将液体发酵菌种混合均匀按8％比例接入3L通用式机械搅拌发酵罐中，设定发酵条件为30℃，通气量为1vvm，搅拌转速为200rpm，动态发酵96h，搅拌桨组合分别为六平叶+BT6，六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶等距排列。
5、细菌纤维素产量测定：取匀浆后发酵液50ml，9000rpm离心5min去上清，加入蒸馏水搅拌均匀，9000rpm离心5min去上清，重复两次；在匀浆漂洗物中加入100ml 0.4％氢氧化钠溶液，充分搅拌，100℃水浴煮沸20min，冷水浴降温，9000rpm离心5min去上清，加入150ml蒸馏水搅拌均匀，9000rpm离心5min去上清，重复至漂洗液为中性；将处理后细菌纤维素在烘箱中60℃烘干至恒重后称重。
6、发酵得率计算：通过公式得率＝细菌纤维素产量(g/L)/碳源消耗量(g/L)计算发酵得率，碳源消耗量通过发酵培养基内蔗糖含量(g/L)-发酵结束后发酵液内蔗糖含量(g/L)计算获得，发酵结束后发酵液内蔗糖含量测定方法同本发明实施例2发酵液残糖浓度测定。
实验结果如图3，使用六平叶+三斜叶和六平叶+BT6的搅拌桨组合的BC产量较高，分别为3.59±0.12g/L和3.55±0.30g/L，高于六平叶+四斜叶和六平叶+六斜叶，说明提高KLa可以提高BC产量，径向流较大的剪切力会影响BC的发酵。六平叶+BT6搅拌桨的得率更大，为0.180±0.0072，高于六平叶+三斜叶(0.165±0.0016)、六平叶+四斜叶(0.160±0.0023)和六平叶+六斜叶(0.162±0.0015)，结果表明在3L通用式机械搅拌发酵罐中，六平叶+BT6搅拌桨组合为最优选。
实施例4
一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体包括如下步骤：
1、种子培养基配制：同本发明实施例3
2、液体发酵菌种培养：同本发明实施例3
3、液体发酵培养基配制：按照蔗糖40g/L，玉米浆干粉30g/L，硫酸铵3.3g/L，七水合硫酸镁0.25g/L配制培养基，调整pH为5.0，分装至10L通用式机械搅拌发酵罐中，每罐5.520L，121℃灭菌20min。
4、接种与发酵：采用火焰接种法，将液体发酵菌种混合均匀按8％比例接入10L通用式机械搅拌发酵罐中，设定发酵条件为30℃，通气量为1vvm，搅拌转速为200rpm，动态发酵96h，搅拌桨组合分别为六平叶+BT6，六平叶+三斜叶，六平叶+六斜叶等距排列。
5、细菌纤维素产量测定：同本发明实施例3
6、发酵得率计算：同本发明实施例3
实验结果如图4，使用六平叶+BT6搅拌桨组合产量最高，为4.90±0.17g/L，大于六平叶+三斜叶组合的3.35±0.14g/L和六平叶+六斜叶组合的2.60±0.12g/L；六平叶+BT6搅拌桨组合得率也最大，为0.218±0.0028，大于六平叶+三斜叶组合的0.142±0.005和六平叶+六斜叶组合的0.113±0.0026。结果表明在10L通用式机械搅拌发酵罐中，六平叶+BT6搅拌桨组合为最优选。
实施例5
一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体包括如下步骤：
1、种子培养基配制：同本发明实施例3，4
2、液体发酵菌种培养：同本发明实施例3，4
3、液体发酵培养基配制：按照蔗糖40g/L，玉米浆干粉30g/L，硫酸铵3.3g/L，七水合硫酸镁0.25g/L配制培养基，调整pH为5.0，分装至50L通用式机械搅拌发酵罐中，每罐27.6L，121℃灭菌20min。
4、接种与发酵：采用火焰接种法，将液体发酵菌种混合均匀按8％比例接入50L通用式机械搅拌发酵罐中，设定发酵条件为30℃，通气量为1vvm，搅拌转速设定为前期200rpm，当溶氧降低至10％，转速逐渐增加并维持在400rpm。动态发酵96h，搅拌桨组合为六平叶+BT6等距排列。
5、细菌纤维素产量测定：同本发明实施例3，4
6、发酵得率测定：同本发明实施例3，4
7、发酵菌体ATP，发酵液残糖浓度及发酵液可溶性多糖含量测定：同实施例2
8、参照NDJ-5S旋转粘度计使用说明书测定发酵液粘度。
实验结果如图5，BC产量在72h达到最大值，为5.56±0.11g/L，高于本发明实施例3，4的发酵产量。实验结果表明，优选的六平叶+BT6搅拌桨组合适合在大规模生产中应用。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (10)

1.一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，其特征在于，汉氏驹形杆菌在利用通用式机械搅拌发酵罐动态发酵生产细菌纤维素过程中，通过采用不同组合的搅拌桨提高发酵罐KLa，从而提高细菌纤维素产量与得率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
步骤1、不同发酵罐参数下KLa测定；
步骤2、发酵菌体ATP，发酵液残糖浓度及发酵液可溶性多糖含量测定；
步骤3、配制种子培养基，配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，酵母蛋白胨5g/L，磷酸氢二钠2.7g/L，一水合柠檬酸1.15g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min；
步骤4、向所述步骤2配制的种子培养基中接入汉氏驹形杆菌，培养获得液体发酵菌种；
步骤5、配制液体发酵培养基，配方为：蔗糖40g/L，玉米浆干粉30g/L，硫酸铵3.3g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，pH 5.0，121℃灭菌20min；
步骤6、将所述步骤4获得的液体发酵菌种接入含有所述步骤5配制的液体发酵培养基的通用式机械搅拌发酵罐中，培养后结束发酵；
步骤7、将发酵液匀浆漂洗，再碱煮漂洗即为细菌纤维素，烘干称重测定产量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述汉氏驹形杆菌为汉氏驹形杆菌Komagataeibacter hansenii(Man-170518-hww)，保藏编号为CGMCC No.15468，于2018年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述通用式机械搅拌式发酵罐中的搅拌桨组合为六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6中任意一种。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述通用式机械搅拌式发酵罐中的搅拌桨组合为六平叶+BT6。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述通用式机械搅拌发酵罐中的搅拌桨组合在搅拌轴上以任意一种排列方式组合，优选为等距排列。
7.含有不同组合的搅拌桨的发酵罐在提高发酵体系KLa中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的搅拌桨包括于六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6。
9.含有不同组合的搅拌桨的发酵罐在提高细菌纤维素产量中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的搅拌桨包括六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6。
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