CN105713860A - 一株耐酸细菌纤维素高产菌株及用该菌株制备可食用细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
一株生产细菌纤维素的菌株，所述菌株的分类命名为木葡糖醋酸杆菌JX1a(Komagataeibacter xylinus JX1a)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015195，保藏日期为2015年4月6日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。该菌株具有高的pH适应能力，在pH2.5～3.0条件下能良好生长；该菌株在含有椰浆、牛奶、豆奶等乳品培养基中可以产生高品质可食用膳食纤维，也可以用该菌株生产细菌纤维素面膜以及医用材料。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，尤其是涉及一种细菌纤维素高产菌及用该菌株制备可食用细菌纤维素。
背景技术
细菌纤维素(Bacterialcellulose，BC)是由多种细菌新陈代谢的产物形成的不含木素、半纤维素以及其他抽提物的高结晶度的三维网状结构。这种结构使得BC有着一些特有的特性.如高纯度、高结晶度、较大的机械强度、高保水值、抗菌性、无毒性、生物相容性和生物降解性等，从而在多个领域有着广泛应用，如生物医药与组织工程、食品、电学、造纸、功能材料等。
细菌纤维素属于水不溶性膳食纤维，它可以改变食物的流变状态，可以生产低热量、低胆固醇的食物。现代研究人员对其作为食品配料的添加应用很多但是对其口感的研究很少。细菌纤维素作为纤维素食用时会有韧性、难切断、难咀嚼的特点，因此制备高咀嚼性、口感滑爽、脆嫩、细腻而有弹性的可食用细菌纤维素也是研究的难点。此外，现代众多研究者对细菌纤维素菌株筛选、原料选择、发酵工艺等方面做了大量研究，对于细菌纤维素高产菌的选育、发酵基质、发酵工艺的研究报道很少。本发明基于这一现状，筛选出一株适用于工业化生产的细菌纤维素产生菌株，并以此菌株为出发点研究可食用细菌纤维素的制备方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一株耐酸细菌纤维素高产菌株及用该菌株制备可食用细菌纤维素的方法。该菌株具有高的pH适应能力，在pH2.5～3.0条件下能良好生长；该菌株在含有椰浆、牛奶、豆奶等乳品培养基中可以产生高品质可食用膳食纤维，也可以用该菌株生产细菌纤维素面膜以及医用材料。
本发明的技术方案如下：
一株生产细菌纤维素的菌株，所述菌株的分类命名为木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015195，保藏日期为2015年4月6日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
一种所述的生产细菌纤维素的菌株的筛选方法，筛选基质为发酵椰浆，筛选培养基为：葡萄糖：2～4％；酵母膏：0.5～1.0％；K2HPO4：0.1～0.2％；MgSO4：0.15～0.25％；乙醇：2～4％；CaCO3：0.5～1％；琼脂：1.5～2％，pH自然。余量为水。
一种所述的菌株生产可食用细菌纤维素的方法，采用木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)作为发酵菌株，采用蔗糖、葡萄糖为碳源，采用冰醋酸为能源物质，采用椰浆、椰子粉、牛奶、奶粉、豆奶或豆粉为氮源。具体步骤为：
(1)初级种子培养：将木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)的斜面种子接到种子培养基，于28～35℃静置培养17～30h，得到初级种子液；
(2)发酵种子培养：将初级种子液按5％～10％的接种量接种到发酵种子培养基中，28～35℃，静置培养1～3d，得到发酵种子液；
(3)浅盘静置发酵：将发酵种子液按10％～30％的接种量接到发酵培养基中，装液高度1.5-2.5cm，28～35℃下静置培养6～8d。
步骤(1)所述种子培养基组成如下：葡萄糖：2～4％；酵母膏：0.5～1.0％；K2HPO4：0.1～0.2％；MgSO4：0.15～0.25％；乙醇：2～4％；
步骤(2)所述发酵种子培养基组成如下：葡萄糖40-80g/L、椰浆5～20g/L、冰醋酸5～20g/L、酵母膏0.01～1g/L、七水合硫酸镁0.2～0.5g/L、pH2.5～3.0；
步骤(3)所述发酵培养基组成如下：蔗糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、椰浆5～20g/L、冰醋酸5～20g/L、大豆蛋白胨0.01～0.5g/L、七水合硫酸镁0.2～0.5g/L。
所述木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)能够在pH2.5～3.0范围内生长，生产细菌纤维素的发酵产量达到湿重500～700g/L，厚度在10～15mm。
步骤(3)发酵得到的细菌纤维素在食用前需按以下方法处理后再食用：将步骤(3)发酵得到的细菌纤维素切成方块，常温水搅拌浸泡2～4次，每次20～30min；将样品在90～95℃下，用0.2～0.4％海藻酸钠溶液搅拌20-30min，常温下用0.2～0.4％乳酸钙静置浸泡20～30min。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提出了一株椰果的高产菌株，木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus)JX1a为一株的新菌株，该菌株可以在pH为2.5-3.0条件下生长。用该菌株经初级种子培养、发酵种子培养、浅盘静置发酵生产细菌纤维素，产量达到500～700g/L。该菌利用椰浆、牛奶等乳品为氮源生产的可食用细菌纤维素成本低、得率高、品质好，适合于大规模生产。本发明制备的产品可应用于饮料、焙烤制品以及乳制品中。
附图说明
图1为木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus)JX1a的16SrDNA序列表。
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例1：木葡萄糖酸醋杆菌JX1a的筛选、分离及鉴定
采集海南椰浆，使其自然发酵(即自然条件下自己发酵)15天，吸取1ml于10ml试管中，再加入9ml无菌水制成10-1浓度的菌悬液，依次进行稀释，分别从10-2、10-3浓度梯度稀释液中吸取200μl均匀涂布于平板，每个浓度梯度做三个对照，置于30℃培养箱观察培养情况，培养4天后，挑取其中菌落长势良好、分布均匀的、产透明圈的全部单菌落，接种于固体斜面培养基中，30℃恒温培养24～48h。待斜面长出丰厚的菌苔后，挑取一环斜面菌种接种于10ml发酵培养液中30℃恒温培养7d，筛选出产膜快且膜厚实的菌株，划线分离纯化，若为纯培养物，转入25％甘油，-20℃保藏，若不是纯培养物继续划线分离。分离培养基：葡萄糖2％(w/v)，酵母膏0.5％(w/v)，K2HPO40.1％(w/v)，MgSO40.15％(w/v)，乙醇2％，CaCO31％(w/v)，琼脂1.7％(w/v)，pH自然；斜面培养基：葡萄糖2％(w/v)，酵母膏0.5％(w/v)，K2HPO40.1％(w/v)，MgSO40.15％(w/v)，乙醇2％，CaCO31％(w/v)，琼脂1.7％(w/v)，pH自然。
木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus)JX1a在固体培养基(葡萄糖2％，酵母膏0.5％，K2HPO4：0.1％，MgSO4：0.15％，乙醇2％，CaCO3：1％，琼脂1.7％，pH自然)上生长24h，呈淡黄色圆隆状，质地较硬，不易挑取，革兰氏染色呈阴性。显微镜16×100倍观察呈短杆状、单细胞或成对。
木葡萄糖酸醋杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)菌株的遗传学特征：
提取新鲜培养菌体的基因作为模版，采用27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)为引物进行细菌的16SrDNA序列扩增。木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus)JX1a16SrDNA全长1355bp，与NCBIGenBank中的已知序列进行同源性比较，与Komagataeibacterxylinus同源性达99％，判定该菌为木葡糖醋酸杆菌，如图1所示。
木葡萄糖酸醋杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)菌株的理化性能见表1所示。
表1木葡萄糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus)JX1a生理生化特性
本菌株在培养时，其培养基的pH为2.5-3，证明本菌株的耐酸性良好；现有技术中生产细菌纤维素的菌株的pH耐受性在5.0左右。
实施例2：可食用细菌纤维素的制备方法
将斜面种子调一环接种到10mL试管中(种子培养基葡萄糖2％、酵母膏0.5％、K2HPO40.2％、MgSO40.15％、乙醇2％)，在30℃的恒温培养箱中静置培养24h，待表面长出纤维膜后，按10％的接种量将其转接到100mL的种子培养基中，在30℃恒温培养箱中静置培养3d，获得初级种子液。
发酵种子培养：将初级种子液按10％的接种量接种到发酵种子培养基中(葡萄糖80g/L、椰浆20g/L、冰醋酸13g/L、大豆蛋白胨0.01g/L、七水合硫酸镁0.2g/L、pH2.5)，在30℃培养箱中静置培养3d。
浅盘静置发酵：将发酵种子液按20％的接种量接到发酵培养基中(蔗糖20g/L、葡萄糖20g/L、椰浆20g/L、冰醋酸12g/L、大豆蛋白胨0.01g/L、七水合硫酸镁0.2g/L)，混合均匀后分装到浅盘中，装液量75％，在30℃发酵房中静置培养8d后收获细菌纤维素。细菌纤维素经刮膜处理后切成1cm3的颗粒，产量600g/L。目前现有技术中用只有的菌株来生产细菌纤维素的最高产量能达到600g/L，远低于本申请的发酵水平。
将生产获得的可食用细菌纤维素采用刮膜机去除表面椰油以及老皮，采用切粒机将其切成1cm×1cm的方块。采用常温水浸泡3次，搅拌速度100rpm，每次30min，直至浸泡水pH高于4.5。将处理后的样品在95℃下，用0.4％海藻酸钠溶液处理30min，搅拌速度100rpm。样品清洗一遍后用0.4％乳酸钙处理30min，得到可食用纤维素颗粒。
对可食用细菌纤维素进行感官评价，该颗粒Q弹爽口，易下咽，无残渣。
本文所描述的具体实施案例仅作为对本发明精神和部分实验做举例说明。本发明所述领域的技术人员可以对所描述的具体实施案例做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (6)
1.一株生产细菌纤维素的菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015195，保藏日期为2015年4月6日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.一种权利要求1所述的生产细菌纤维素的菌株的筛选方法，其特征在于筛选基质为发酵椰浆，筛选培养基为：葡萄糖：2～4％；酵母膏：0.5～1.0％；K2HPO4：0.1～0.2％；MgSO4：0.15～0.25％；乙醇：2～4％；CaCO3：0.5～1％；琼脂：1.5～2％，pH自然。
3.一种权利要求1所述的菌株生产可食用细菌纤维素的方法，其特征在于采用木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)作为发酵菌株，采用蔗糖、葡萄糖为碳源，采用冰醋酸为能源物质，采用椰浆、椰子粉、牛奶、奶粉、豆奶或豆粉为氮源。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)初级种子培养：将木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)的斜面种子接到种子培养基，于28～35℃静置培养17～30h，得到初级种子液；
(2)发酵种子培养：将初级种子液按5％～10％的接种量接种到发酵种子培养基中，28～35℃，静置培养1～3d，得到发酵种子液；
(3)浅盘静置发酵：将发酵种子液按10％～30％的接种量接到发酵培养基中，装液高度1.5-2.5cm，28～35℃下静置培养6～8d。
步骤(1)所述种子培养基组成如下：葡萄糖：2～4％；酵母膏：0.5～1.0％；K2HPO4：0.1～0.2％；MgSO4：0.15～0.25％；乙醇：2～4％；
步骤(2)所述发酵种子培养基组成如下：葡萄糖40-80g/L、椰浆5～20g/L、冰醋酸5～20g/L、酵母膏0.01～1g/L、七水合硫酸镁0.2～0.5g/L、pH2.5～3.0；
步骤(3)所述发酵培养基组成如下：蔗糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、椰浆5～20g/L、冰醋酸5～20g/L、大豆蛋白胨0.01～0.5g/L、七水合硫酸镁0.2～0.5g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述木葡糖醋酸杆菌JX1a(KomagataeibacterxylinusJX1a)能够在pH2.5～3.0范围内生长，生产细菌纤维素的发酵产量达到湿重500～700g/L，厚度在10～15mm。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(3)发酵得到的细菌纤维素在食用前需按以下方法处理后再食用：将步骤(3)发酵得到的细菌纤维素切成方块，常温水搅拌浸泡2～4次，每次20～30min；将样品在90～95℃下，用0.2～0.4％海藻酸钠溶液搅拌20-30min，常温下用0.2～0.4％乳酸钙静置浸泡20～30min。
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