CN105316373A - 一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法。采用方法的要点是挑取固体斜面培养基上经活化的细菌菌落，接种于液体活化培养基，扩大培养得到种子液，将种子液按照一定接种量接种于液体发酵培养基中，添加水溶性高分子化合物，进行静态发酵，发酵结束倒出培养液，经纯化处理得到具有三维网络结构的细菌纤维素产品。该方法在细菌发酵过程中加入水溶性高分子化合物，破坏了原微细纤维聚集形成纤维过程，进而得到具有三维网络结构的细菌纤维素。该方法简单易行、生产成本低，对细菌纤维素产品的微观形态具有较好的调控作用，可拓展细菌纤维素的应用价值和领域，为制备多元化细菌纤维素基功能材料奠定了原料基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵制备细菌纤维素的方法，特别涉及一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术
纤维素是地球上含量最丰富的天然高分子化合物，自然界天然纤维素绝大部分由植物产生。除植物纤维素外，某些微生物也可合成纤维素，此类纤维素通称细菌纤维素，其化学结构与植物纤维素相似，均是由D-吡喃葡萄糖单体以β-1,4糖苷键连接而成的线性多糖。细菌纤维素是由生长在液态含糖基质中的细菌产生并分泌到基质中的纤维素成分，在培养液表面形成一层透明的凝胶状薄膜。其不是细菌细胞壁的结构成分，而是一种胞外产物。细菌纤维素作为一种新型生物材料，具有许多独特的性质：如纯度高，不含木素和其他细胞壁成分；吸水性强、结晶度高、聚合度高；有较高的生物适应性和良好的生物可降解性；生物合成性能可调控等。细菌纤维素是目前最具发展前景的生物基础材料和纳米生物材料之一，在食品、造纸、功能材料和生物医学等领域有广阔的应用前景。
然而当前，阻碍人们广泛、高效利用细菌纤维素的瓶颈，一是细菌纤维素的改性手段有限，二是发酵制备细菌纤维素工艺仍需进一步优化。细菌纤维素与水分子及其自身之间可形成大量氢键，构成巨大的氢键网络，从而导致致密晶体结构的出现，严重阻碍了化学试剂与细菌纤维素的有效接触与反应，极大限制了细菌纤维素的表面化学改性及应用。随着人们对细菌纤维素材料的深入研究，发现三维网络结构疏松、孔径均一、结晶度低且易溶解的细菌纤维素，作为一种基础生物材料，具有更为广泛的应用价值和前景。
在细菌纤维素发酵制备领域，中国专利(ZL201210333137.X)“一种控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法”以细菌纤维素产生菌--葡糖酸醋酸杆菌(GD-BC-1CCTCCM208149)作为发酵菌株，通过调整发酵培养基配方、培养方式、发酵时间等达到控制细菌纤维素聚合度的目的，使其平均聚合度在1361～2350范围内，且控制方法简单，可适应各种工业加工的需求，提高了细菌纤维素的产品品质；中国专利(ZL201310740132.3)“一种在发酵过程中降低细菌纤维素结晶度的方法”在细菌的发酵过程中加入荧光增白剂，降低了细菌纤维素纤维带的聚集状况，从而降低了其结晶度，方法简单快速，不会对细菌纤维素的分子量造成影响，成本较低，对细菌纤维素的结晶度具有很好的调控作用；中国专利(ZL201110063655.X)“一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法”将羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠添加到发酵培养基中，在发酵过程中改变其网状结构，降低其分子内和分子间的氢键作用，制备得到的细菌纤维素产品具有很好的复水性，扩大了其应用范围；美国专利(US20110286948A1)“Bacterialcellulosefilmandusesthereof”以木醋杆菌(23769)为生产细菌纤维素菌种，在添加了不同分子量PEO的HS培养基中搅拌培养，得到棉花状的纳米复合纤维素，冷冻干燥后形成多孔性物质，并且容易模塑成所需形状，相比于干燥后的纯纤维素，该纳米复合材料弹性性能得以大幅提高；美国专利(US6060289A)“Modifiedbacterialcellulose”以巴氏醋酸杆菌(FERMBP-4176)为产细菌纤维素菌种，在发酵培养基中加入细胞分裂抑制剂萘啶酸、氯霉素和有机还原剂二硫苏糖醇，发酵制备改性细菌纤维素，改变了带状纤维的宽度和厚度，提高了杨氏模量。截至目前，还未见到以醋酸杆菌(AJ12368)、木醋杆菌(ATCC23769)和木醋杆菌(CGMCC1.1812)为产细菌纤维素菌种，借助水溶性高分子化合物结构调控作用，发酵制备三维网络结构细菌纤维素的相关工艺技术出现。
随着人们对天然环境友好材料需求的不断提升，进一步明确细菌纤维素的生物合成及其结构性能调控机理，通过结构调控制备具有独特形貌性能的细菌纤维素具有重要意义。细菌纤维素是一种极具应用潜力的生物材料，改变其原有生物结构，在发酵过程中进行结构干预，赋予其新的性能，可极大拓宽细菌纤维素产品的应用价值和领域。
发明内容
为了克服目前发酵制备的细菌纤维素结构致密、结晶度高、难溶解和加工等问题，本发明借助水溶性高分子化合物的结构调控作用，以细菌发酵制备具有三维网络结构的细菌纤维素产品，提高其化学反应位点和活性，进而拓宽其应用价值和领域。本发明的目的是提供一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是采用以下步骤：
1)在无菌环境中，用接种环挑取在固体斜面培养基上经活化的细菌菌种，接种于90～110mL液体活化培养基中，在27～30℃、转数150～165r/min的摇床中培养24～36h，得到扩大培养的种子液；
2)将步骤1)中得到的种子液，按照体积比5～15％的接种量接种于50mL液体发酵培养基中，发酵前期在液体发酵培养基中加入2.5～10％的水溶性高分子化合物，培养液pH5～7，在25～35℃下静态发酵7～12d，得到未经纯化的细菌纤维素；
3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素多次冲洗，去除表面杂质及菌体，浸泡于0.1mol/LNaOH溶液中，在80～100℃下水浴1～2h，蒸馏水反复冲洗，去除残留NaOH至细菌纤维素表面pH为中性，最终得到三维网络结构的细菌纤维素产品。
所述的细菌菌种为：醋酸杆菌(AJ12368)、木醋杆菌(ATCC23769)、木醋杆菌(CGMCC1.1812)中的一种。
所述的水溶性高分子化合物为：羧甲基淀粉钠、羟乙基纤维素、羟丙基淀粉中的一种。
所述的液体活化培养基配方为：28～32g/L葡萄糖、5～7g/L酵母浸膏、9～11g/L蛋白胨、0.8～1.2g/L柠檬酸钠、1.8～2.1g/L硫酸镁、pH6～7，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
所述的液体发酵培养基配方为：68～72g/L蔗糖、10～12g/L酵母浸膏、27～29g/L胰蛋白胨、0.8～1.2g/L柠檬酸三钠、1.8～2.2g/L硫酸镁、2.5～2.8g/LNa2HPO4、1.8～2.2g/LKH2PO4、pH5～7，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：
本发明在发酵制备细菌纤维素的过程中引入醋酸杆菌(AJ12368)、木醋杆菌(ATCC23769)和木醋杆菌(CGMCC1.1812)等细菌菌种，在静态发酵初期加入水溶性高分子化合物，使细菌在分泌纤维素时，原微细纤维保持分离状态，破坏了原微细纤维聚集形成纤维的过程，使细菌纤维素具有较均一的三维网络结构，进而提升了其化学反应位点与活性。方法简单快速、成本低，对细菌纤维素的微观形态具有较明显的调控作用，进一步拓宽了细菌纤维素产品的应用价值和领域，为制备多元化细菌纤维素基功能材料奠定了原料基础。
附图说明
图1是由实施例1发酵制备的三维网络结构细菌纤维素的形态照片。其中，图1(a)是三维网络结构细菌纤维素的数码照片，图1(b)是三维网络结构细菌纤维素的场发射扫描电镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:
1)在无菌环境中，用接种环挑取在固体斜面培养基上经活化的醋酸杆菌(AJ12368)菌落，接种于100mL液体活化培养基中(液体活化培养基配方：28g/L葡萄糖、5g/L酵母浸膏、9g/L蛋白胨、0.8g/L柠檬酸钠、1.8g/L硫酸镁、pH6，121℃高压蒸汽灭菌20min)，在28℃、转数160r/min的摇床中培养36h，得到扩大培养的种子液；
2)将步骤1)中得到的种子液，按照体积比10％的接种量接种于50mL液体发酵培养基中(液体发酵培养基配方：68g/L蔗糖、10g/L酵母浸膏、27g/L胰蛋白胨、0.8g/L柠檬酸三钠、1.8g/L硫酸镁、2.5g/LNa2HPO4、1.8g/LKH2PO4，121℃下高压蒸汽灭菌20min)，发酵前期在液体发酵培养基中加入5％的羟乙基纤维素，培养液pH6，在25℃下静态发酵7d，得到未经纯化的细菌纤维素；
3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素多次冲洗，去除表面杂质及菌体，浸泡于0.1mol/LNaOH溶液中，在80℃下水浴1.5h，蒸馏水反复冲洗，去除残留NaOH至细菌纤维素表面pH为中性，最终得到三维网络结构的细菌纤维素产品(a)。
实施例2:
1)在无菌环境中，用接种环挑取在固体斜面培养基上经活化的木醋杆菌(ATCC23769)菌落，接种于90mL液体活化培养基中(液体活化培养基配方：30g/L葡萄糖、6g/L酵母浸膏、11g/L蛋白胨、1.0g/L柠檬酸钠、2.0g/L硫酸镁、pH6.8，121℃高压蒸汽灭菌20min)，在27℃、转数150r/min的摇床中培养24h，得到扩大培养的种子液；
2)将步骤1)中得到的种子液，按照体积比5％的接种量接种于50mL液体发酵培养基中(液体发酵培养基配方：70g/L蔗糖、11g/L酵母浸膏、28g/L胰蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁、2.6g/LNa2HPO4、2g/LKH2PO4，121℃下高压蒸汽灭菌20min)，发酵前期在液体发酵培养基中加入2.5％的羟丙基淀粉，培养液pH7，在30℃下静态发酵8d，得到未经纯化的细菌纤维素；
3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素多次冲洗，去除表面杂质及菌体，浸泡于0.1mol/LNaOH溶液中，在100℃下水浴1h，蒸馏水反复冲洗，去除残留NaOH至细菌纤维素表面pH为中性，最终得到三维网络结构的细菌纤维素产品(b)。
实施例3:
1)在无菌环境中，用接种环挑取在固体斜面培养基上经活化的木醋杆菌(CGMCC1.1812)菌落，接种于110mL液体活化培养基中(液体活化培养基配方：32g/L葡萄糖、5g/L酵母浸膏、10g/L蛋白胨、1.2g/L柠檬酸钠、2.1g/L硫酸镁、pH7，121℃高压蒸汽灭菌20min)，在30℃、转数165r/min的摇床中培养30h，得到扩大培养的种子液；
2)将步骤1)中得到的种子液，按照体积比15％的接种量接种于50mL液体发酵培养基中(液体发酵培养基配方：72g/L蔗糖、12g/L酵母浸膏、29g/L胰蛋白胨、1.2g/L柠檬酸三钠、2.2g/L硫酸镁、2.7g/LNa2HPO4、2.1g/LKH2PO4，121℃下高压蒸汽灭菌20min)，发酵前期在液体发酵培养基中加入10％的羧甲基淀粉钠，培养液pH5，在30℃下静态发酵10d，得到未经纯化的细菌纤维素；
3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素多次冲洗，去除表面杂质及菌体，浸泡于0.1mol/LNaOH溶液中，在90℃下水浴2h，蒸馏水反复冲洗，去除残留NaOH至细菌纤维素表面pH为中性，最终得到三维网络结构的细菌纤维素产品(c)。
实施例4:
1)在无菌环境中，用接种环挑取在固体斜面培养基上经活化的醋酸杆菌(AJ12368)菌落，接种于95mL液体活化培养基中(液体活化培养基配方：30g/L葡萄糖、7g/L酵母浸膏、9g/L蛋白胨、1.2g/L柠檬酸钠、2g/L硫酸镁、pH6.5，121℃高压蒸汽灭菌20min)，在29℃、转数155r/min的摇床中培养24h，得到扩大培养的种子液；
2)将步骤1)中得到的种子液，按照体积比10％的接种量接种于50mL液体发酵培养基中(液体发酵培养基配方：68g/L蔗糖、12g/L酵母浸膏、28g/L胰蛋白胨、1g/L柠檬酸三钠、2g/L硫酸镁、2.6g/LNa2HPO4、2g/LKH2PO4，121℃下高压蒸汽灭菌20min)，发酵前期在液体发酵培养基中加入7.5％羟丙基淀粉，培养液pH7，在35℃下静态发酵12d，得到未经纯化的细菌纤维素；
3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素多次冲洗，去除表面杂质及菌体，浸泡于0.1mol/LNaOH溶液中，在100℃下水浴1.5h，蒸馏水反复冲洗，去除残留NaOH至细菌纤维素表面pH为中性，最终得到三维网络结构的细菌纤维素产品(d)。
测定实施例1、2、3、4制备得到的4种三维网络结构细菌纤维素的产量和复水率。表1为由实施例1、2、3、4制备的三维网络结构细菌纤维素产量(以干重表示)和复水率的表征结果。由表1中数据可知，采用本发明所述的发酵制备方法获得的三维网络结构细菌纤维素(a)、(b)、(c)、(d)产量分布在1.2～3.2g/L，复水率分布在93.12～94.55％，均具有较高的生产效率和较好的水溶解与吸附性能。
如图1(a)，从实施例1制备的三维网络结构细菌纤维素数码照片可看出，其呈乳白色的水凝胶状，符合一般细菌纤维素的表观形貌特征；如图1(b)，从实施例1制备的三维网络结构细菌纤维素场发射扫描电镜照片可以看出，其三维网络结构较为疏松、孔径较大、形态分散、具有较高的比表面积，有利于进一步的化学改性与利用。
表1
以上列举的仅是本发明的具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在无菌环境中，用接种环挑取在固体斜面培养基上经活化的细菌菌种，接种于90～110mL液体活化培养基中，在27～30℃、转数150～165r/min的摇床中培养24～36h，得到扩大培养的种子液；
2)将步骤1)中得到的种子液，按照体积比5～15％的接种量接种于50mL液体发酵培养基中，发酵前期在液体发酵培养基中加入2.5～10％的水溶性高分子化合物，培养液pH5～7，在25～35℃下静态发酵7～12d，得到未经纯化的细菌纤维素；
3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素多次冲洗，去除表面杂质及菌体，浸泡于0.1mol/LNaOH溶液中，在80～100℃下水浴1～2h，蒸馏水反复冲洗，去除残留NaOH至细菌纤维素表面pH为中性，最终得到三维网络结构的细菌纤维素产品。
2.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法，其特征在于：所述的细菌菌种为：醋酸杆菌(AJ12368)、木醋杆菌(ATCC23769)、木醋杆菌(CGMCC1.1812)中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法，其特征在于：所述的水溶性高分子化合物为：羧甲基淀粉钠、羟乙基纤维素、羟丙基淀粉中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法，其特征在于：所述的液体活化培养基配方为：28～32g/L葡萄糖、5～7g/L酵母浸膏、9～11g/L蛋白胨、0.8～1.2g/L柠檬酸钠、1.8～2.1g/L硫酸镁、pH6～7，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵制备三维网络结构细菌纤维素的方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基配方为：68～72g/L蔗糖、10～12g/L酵母浸膏、27～29g/L胰蛋白胨、0.8～1.2g/L柠檬酸三钠、1.8～2.2g/L硫酸镁、2.5～2.8g/LNa2HPO4、1.8～2.2g/LKH2PO4、pH5～7，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
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