CN106676146A - 一种细菌纤维素的改进发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素的改进发酵方法，所述方法通过在木醋杆菌发酵过程中，加入不同的干扰因子对其发酵过程进行调控，改变其微观结构和持水量。在持水量方面，吐温‑80可以将细菌纤维素持水量从原有的90倍提高到105倍自身重量，二硫苏糖醇和乳化剂OP‑10会稍微降低细菌纤维素的持水量，氯霉素和纳米二氧化硅会将持水能力增至70倍自身重量。本发明能够根据实际应用需要，在细菌纤维素的发酵过程中，通过加入不同的干扰因子，在保证纤维素原有晶型的同时，调控最终产物细菌纤维素的微观结构以及持水量，拓宽细菌纤维素后期应用。

Description

一种细菌纤维素的改进发酵方法
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素的改进发酵方法，属于生物技术领域。
背景技术
细菌纤维素(BC)是细菌分泌物，由单纯的葡萄糖缩聚而成，其纤维含量和聚合度都较高。目前合成的生物纤维素结构较单一，孔隙尺寸相对较少，其应用受到限制，一般通过后期在纤维素表面负载具有特定化学性质的化合物对其进行改性，但存在复合程度不够，负载后容易脱附的问题。文献1(罗成成,纤维素的改性及应用研究进展.2015:767-773)总结了三大类对纤维素进行改性的方法，即物理改性、化学改性和生物改性，上述方法均为先获得纤维素成品，再对其进行后期改性，此类改性容易造成纤维素晶体形貌的改变，使其丧失纤维素原有的高结晶度、高强度等优良特性。文献2(Keshk S,etc..Influence oflignosulfonate on crystal structure and productivity of bacterial cellulosein a static culture,2006,40(1):4-8)报道了一种通过向发酵液中添加木素磺酸盐的方法对细菌纤维素进行改性，该方法在提高纤维素纤维之间结合力的同时会产生一定的纤维素断层现象，使得最终的改性产物尺寸受到影响，应用受到限制。文献3(赵艳锋.纤维素的改性技术及进展.2006,20(2):11-14)利用纤维素酶处理细菌纤维素，虽提高了纤维素间的结合力，但是纤维素酶会降解纤维素链。
综上所述，改性条件以及改性方法的选取对于纤维素的改性效果起到至关重要的影响，利用合理的改性方法在不破坏原有纤维的同时进行相关改性，对于纤维素的后期应用范围的拓宽具有深远影响。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种细菌纤维素的改进发酵方法，该方法通过在木醋杆菌发酵过程中，加入不同的干扰因子对其发酵过程进行调控，在保证纤维素原有晶型的同时，改变最终产物细菌纤维素的微观结构以及持水量。
本发明的技术方案如下：
一种细菌纤维素的改进发酵方法，具体步骤如下：
将木醋杆菌接种到发酵培养基中，动态培养，进入对数生长时期后，在发酵培养基中加入干扰因子，发酵结束后收集得到原位改性的细菌纤维素，所述的干扰因子选自二硫苏糖醇、氯霉素、吐温-80、乳化剂OP-10、石英砂或纳米二氧化硅。
所述的干扰因子为二硫苏糖醇时，添加量为0.1-0.2mg/mL发酵液。
所述的干扰因子为氯霉素时，添加量为0.05-0.15mg/mL发酵液。
所述的干扰因子为吐温-80时，添加量为4-6mg/mL发酵液。
所述的干扰因子为乳化剂OP-10时，添加量为4-6mg/mL发酵液。
所述的干扰因子为石英砂时，添加量为15-25mg/mL发酵液。
所述的干扰因子为纳米二氧化硅时，添加量为3-5mg/mL发酵液。
本发明方法简单，成本低，有效避免了现有的细菌纤维素后期改性的方法易引起的纤维断裂、结合程度低、改性效果不明显的问题。二硫苏糖醇干扰发酵得到的纤维素直径分布范围较大；氯霉素干扰发酵得到的纤维素更加容易结团；吐温-80会让原本均匀的纤维素变得粗细不一失去三维立体轮廓；乳化剂OP-10干扰之后略微增大了纤维素的尺寸；石英砂的加入让整个纤维素网络显得更加致密，同时纤维素尺寸增大；纳米二氧化硅和石英砂类似，都增加了整个发酵系统的扰动程度，干扰过后的纤维素都显得比较修长。此外，原始纤维素是一种非常好的持水材料，吐温-80干扰发酵得到的纤维素的持水量明显升高，乳化剂OP、二硫苏糖醇干扰发酵得到的纤维素的持水量较未加入干扰因子之前变化不大，氯霉素干扰发酵得到的纤维素的持水量大大降低。
综上，本发明能够根据实际应用需要，在细菌纤维素的发酵过程中，通过加入不同的干扰因子，在保证纤维素原有晶型的同时，调控最终产物细菌纤维素的微观结构以及持水量，满足实际需求。
附图说明
图1是实施例1发酵过程中，添加不同干扰剂进行发酵过程干扰之后，得到的产物和未添加干扰剂发酵获得产物的SEM图。
图2是实施例2发酵过程中，添加不同干扰剂进行发酵过程干扰之后，得到的产物和未添加干扰剂发酵获得产物的XRD图。
图3是实施例3发酵过程中，添加不同干扰剂进行发酵过程干扰之后，得到的产物和未添加干扰剂发酵获得产物的持水量对比图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明中种子液的制备以及参数监测可参考现有方法，其中种子液可通过以下步骤制得：
将4℃低温保藏的菌种于30℃条件下静置20min，用接种环挑取一环菌种划线于固体平板培养基中，将平板培养基于30℃培养箱中静置培养36h。将已活化种子用接种环挑取2～3环，接种到装有100mL种子液的500mL锥形瓶中，然后放入摇床中以120-160rpm往复摇晃培养48h。
固体培养基组成(g/100mL)：葡萄糖2.0，蔗糖1.0，硫酸镁0.04，柠檬酸0.11，磷酸二氢钠0.25，蛋白胨1.0，琼脂1.8，酵母浸粉0.1。pH＝6.0。121℃灭菌30min。
种子液组成(g/100mL)：葡萄糖2.0，硫酸铵0.6，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.04，蛋白胨0.3，酵母浸粉0.225，羧甲基纤维素钠0.04。121℃灭菌30min。
除干扰剂外，发酵液的基本组成(g/100mL)：葡萄糖2.25；蔗糖2.75；硫酸铵0.1；磷酸二氢钾0.5；硫酸镁0.07；乳酸钙0.02；蛋白胨1.0；酵母浸粉0.75；醋酸0.15；柠檬酸0.06；羧甲基纤维素钠0.04。121℃灭菌30min。
微观结构形态的表征：扫描电镜观察细菌纤维素的微观表面形态。将样品进行冷冻干燥，剪取一块5mm×5mm的样品，用导电胶将其固定于样品台，在真空的条件下对其进行喷金操作处理，将倍率调节至10000倍，进行微观结构的观察。
结晶状态表征：将原位修饰的细菌纤维素进行X射线衍射分析，得到改性材料的晶体结构。把冻干之后的细菌纤维素，贴上双面胶然后固定在样品台中央，利用铜靶发出的Kα射线，将波长设置为以0.05°/0.1s、40kV、40mA、2θ为10-40°条件下进行扫描。
纤维素结晶度可用下式求得：
Cr IXRD＝(Ⅰ(200)–Ⅰ(am))/Ⅰ(200)×100％
Cr I表示结晶指数，Ⅰ(200)：(200)晶面峰强，Ⅰ(am)：无定形区峰强。
持水量表征：为了去除不必要的水分，将含有较多水分的改性纤维素常温常压静置5分钟，然后再用滤纸将残余的水分全部吸收干净。滤纸吸收过后的纤维素重量记为Wwet。将称完的细菌纤维素利用冻干机进行冻干，得到绝干重量并记为Wdry。按照公式(1-1)计算即可得到纤维素持水量(water holding capacity)：
持水量(％)＝(Wwet-Wdry)/Wdry×100％
实施例1
把种子液接种到含有装有100mL发酵液的500mL锥形瓶中，160转每分钟，30℃条件下进行72h动态培养。发酵进行到20h，加入不同的干扰因子，对整个细菌纤维素的生产发酵过程进行干扰。不同干扰因子的量为：二硫苏糖醇10mg、氯霉素5mg、吐温-80 400mg、乳化剂OP-10 400mg、石英砂1500mg、纳米二氧化硅300mg，相应改性发酵得到的产物细菌纤维素为BC-A、BC-B、BC-C、BC-D、BC-E和BC-F。
图1为添加干扰因子改性过后的和未添加干扰因子的产物细菌纤维素的扫描电镜图，a为二硫苏糖醇，b为氯霉素，c为吐温-80，d为乳化剂OP-10，e为石英砂，f为纳米二氧化硅，g为未添加干扰因子发酵得到的细菌纤维素。由图1可以看出，不添加任何干扰因子的细菌纤维素网络结构清晰、相对较为疏松，纤维直径变化较为均匀。添加干扰因子的细菌纤维素相对未添加的微观结构上发生了较大的变化。其中二硫苏糖醇修饰的纤维直径区别较大；氯霉素干扰的纤维素更加容易结团；吐温-80会让原本均匀的纤维素变得粗细不一失去三维立体轮廓；乳化剂OP-10干扰之后略微增大了纤维素的尺寸；石英砂的加入让整个纤维素网络显得更加致密，并伴随着纤维素尺寸的增加；纳米二氧化硅和石英砂类似，都增加了整个发酵系统的扰动程度，因此干扰过后的纤维素都显得比较修长。
实施例2
把种子液接种到含有装有100mL发酵液的500mL锥形瓶中，160转每分钟，30℃条件下进行72h动态培养。发酵进行到35h，加入不同的干扰因子，对整个细菌纤维素的生产发酵过程进行干扰。不同干扰因子的量为：二硫苏糖醇15mg、氯霉素10mg、吐温-80 500mg、乳化剂OP-10 500mg、石英砂2000mg、纳米二氧化硅400mg，相应改性发酵得到的产物细菌纤维素为BC-A、BC-B、BC-C、BC-D、BC-E和BC-F。
图2为添加干扰因子改性过后的和未添加干扰因子的产物细菌纤维素的XRD图。通过图2，计算不同干扰因子干扰的纤维素的结晶指数，结果见表1。由表1可见，除了表面活性剂OP-10使得纤维素结晶度降低的明显之外，其余的几种干扰因子对于结晶度影响不大。
表1不同干扰因子干扰的纤维素的结晶指数
实施例3
把种子液接种到含有装有100mL发酵液的500mL锥形瓶中，160转每分钟，30℃条件下进行72h动态培养。发酵进行到50h，加入不同的干扰因子，对整个细菌纤维素的生产发酵过程进行干扰。不同干扰因子的量为：二硫苏糖醇20mg、氯霉素15mg、吐温-80 600mg、乳化剂OP-10 600mg、石英砂2500mg、纳米二氧化硅500mg，相应改性发酵得到的产物细菌纤维素为BC-A、BC-B、BC-C、BC-D、BC-E和BC-F。
对上述的干扰过后的纤维素进行持水量表征，得到结果如图3所示。原始纤维素是一种非常好的持水材料，改性之后，吐温-80可以将细菌纤维素持水量从原有的90倍提高到105倍自身重量，二硫苏糖醇和OP-10会稍微降低细菌纤维素的持水量，氯霉素和纳米二氧化硅会将持水能力将至70倍自身重量。

Claims (7)

1.一种细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，具体步骤如下：
将木醋杆菌接种到发酵培养基中，动态培养，进入对数生长时期后，在发酵培养基中加入干扰因子，发酵结束后收集得到原位改性的细菌纤维素，所述的干扰因子选自二硫苏糖醇、氯霉素、吐温-80、乳化剂OP-10、石英砂或纳米二氧化硅。
2.根据权利要求1所述的细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，所述的干扰因子为二硫苏糖醇时，添加量为0.1-0.2mg/mL发酵液。
3.根据权利要求1所述的细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，所述的干扰因子为氯霉素时，添加量为0.05-0.15mg/mL发酵液。
4.根据权利要求1所述的细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，所述的干扰因子为吐温-80时，添加量为4-6mg/mL发酵液。
5.根据权利要求1所述的细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，所述的干扰因子为乳化剂OP-10时，添加量为4-6mg/mL发酵液。
6.根据权利要求1所述的细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，所述的干扰因子为石英砂时，添加量为15-25mg/mL发酵液。
7.根据权利要求1所述的细菌纤维素的改进发酵方法，其特征在于，所述的干扰因子为纳米二氧化硅时，添加量为3-5mg/mL发酵液。
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