CN106222158A - 一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，所述制备步骤如下：（1）对乳酸杆菌LZ95菌株进行扩大培养及LZ95菌泥准备；（2）乳酸杆菌LZ95菌泥的包埋；（3）喷雾干燥法制高产维生素B12的乳酸杆菌制剂。本发明制备操作简单，以海藻酸钠为壁材喷雾干燥制得的乳酸杆菌包埋体包埋率、存活率及储藏活菌率最高，经正交实验，确定接种量2%、发酵温度37℃、培养时间24 h，最终维生素B12产量为3.42 μg/mL；本发明制得的微胶囊人工肠液处理溶出度最高，有利于肠道定植；所制得微胶囊无黏连，成球性好，表面圆整，在人工模拟胃液下缓慢释放，在人工模拟肠液下可快速释放大量乳酸杆菌。

Description

一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法。
背景技术
乳酸杆菌是一群能够利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称。乳酸杆菌多呈杆状或球状，没有芽孢，大多不运动，可在厌氧或兼性厌氧条件下生长，过氧化氢酶呈阴性。具有不产色素、可分解蛋白质、脂肪分解能力弱等特点。乳酸杆菌发酵对于营养要求较为严格，需要氨基酸、B族维生素等营养因子，可以分解乳糖，但对于结构复杂的大分子碳水化合物不能利用，分为异型发酵和同型发酵两种形式，发酵的终产物有多种拮抗物质，如乳酸、丁二酮、细菌素(bacteriocin)和过氧化氢等。
乳酸杆菌的数量庞大，种类繁多，根据细菌基因型分析可以分为23个属，包括乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、气球菌属(Aerococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和芽孢杆菌属(Bacillus)等。
乳酸杆菌在广泛分布于动植物表层、发酵植物食品、乳制品和动物及人体的肠道中，具有丰富的物种多样性，是常见的益生菌，对于维护人体的健康起着重要积极的作用。早在百年以前乳酸杆菌就被人类发现并应用于轻工业、医药、食品及饲料等领域。其发酵产品更是不胜枚举，如发酵植物食品(泡菜、酸菜)、乳制品(酸奶、奶酪等)、豆乳制品、酒和果醋等，与人类的生活与健康有着息息相关的联系。此外，乳酸杆菌在维持人体胃肠环境稳态、助于消化吸收、降低血清胆固醇，控制内毒素、抑制肠道腐败菌生长、分解大分子物质以提高食品营养等方面起着重要的作用。随着人们追求营养、健康的认知加深，越来越关注于疾病的预防，乳酸杆菌的潜在作用将会得到更加深入、广泛的应用。
乳酸杆菌发酵可以产生氨基酸、有机酸、B族维生素及生物素等营养因子，为宿主提供营养。乳酸杆菌可以合成各种消化酶(如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶等)，以帮助宿主分解消化大分子物质，从而提高营养物质的摄入。它还可以分解乳糖为葡萄糖和半乳糖，有利于乳糖不耐症患者对于牛乳的消化吸收。此外，乳酸杆菌还在促进钙、镁的吸收，促进脂类的吸收等方面发挥积极的作用。
作为益生菌的一员，乳酸杆菌具有免疫调节和免疫刺激能力。前者主要通过提高抗炎症 细胞因子水平、增强细胞杀伤力、激活巨噬细胞和免疫球蛋白活性等方式产生，多具有抗过敏与抗炎症效果；免疫刺激通过提高机体免疫蛋白浓度和巨噬细胞活性来激发机体体液免疫和细胞免疫。已有研究证明乳酸杆菌抗过敏是通过下调宿主Th2细胞反应和诱导Thl免疫应答起作用的；而抗炎症是通过调节功能抑制Thl和Th2的免疫紊乱达到目的。
人体肠道内寄宿着数量庞大的细菌，这些细菌在其中相互共存、相互制约共同维持肠道内的稳态平衡。乳酸杆菌作为其中常驻的益生菌，通过黏附作用定植于小肠上皮细胞，通过竞争作用抑制肠道腐败菌的生长，同时部分乳酸杆菌可以分泌细菌素等抗菌物质，杀灭肠道病原菌，以维持肠道健康。
乳酸杆菌可以分泌各种酶(如胆酸水解酶)来通降低血清中的胆固醇，并且通过调节糖代谢以稳定血压，从而维持宿主心血管健康。
肠道健康的关键在于维持肠道菌群的平衡，大量的乳酸杆菌寄宿于宿主肠道，对于维持肠道的菌群稳态有着重要意义，主要体现在以下方面：
一般而言，致病菌与宿主肠道黏膜表面受体结合后黏附于肠道黏膜，定植在宿主肠道，产生毒素，感染宿主。而乳酸杆菌可与肠道黏膜上皮细胞结合，黏附于微绒毛的刷状缘，通过占据致病菌在肠道上皮细胞结合位点，与致病菌竞争从而限制致病菌群的生长繁殖，起到屏障作用。已有研究发现，乳酸杆菌可通过与致病菌竞争肠上皮微绒毛上脂质和蛋白质上的相同复合糖受体来达到阻止致病菌的定植。
另外，乳酸杆菌能竞争性发酵肠道内容物，产生有益于肠道黏膜保护的代谢物质。现有研究已证明乳酸杆菌可以降低禽类肠道内病原性大肠杆菌和沙门氏菌的黏附，从而抑制盲肠内大肠杆菌。
肠道微生物的菌群平衡有利于机体抵御各种病原菌的侵袭，维持机体健康。若肠内菌群失调，乳酸杆菌等益生菌及部分厌氧菌数量显著减少，肠道内的粪球菌、肠球菌等则显著增长，从而增大了各种病毒、病原菌大量繁殖的几率，进而引起或加重各种疾病。乳酸杆菌可以有效维持宿主肠道菌群平衡，提高肠道对病原菌的抵抗能力，同时预防及早期治疗一些由特定病原菌感染引起的疾病，从而提高畜禽的日粮消化率，促进对营养物质的吸收。
微胶囊包埋技术是当今研究者研究的热门，是一种用成膜材料把某种物质包覆并使之形成微小粒子的技术。用这种技术包埋得到的粒径仅为微米的小粒子被称为微胶囊，由芯材和壁材两部分构成，有保护芯材免受环境影响、降低毒性、屏蔽气味等作用。当壁材受到破坏时，芯材即会被释放出来以达到其应用的目的。微胶囊技术包埋乳酸杆菌，能增强菌体对外界环境因素的抵抗能力，显著提高菌体在高温制造期和低温保存期中以及到达肠道后的存活率。
目前，乳酸杆菌常用的微胶囊包埋方法有两种：挤压法和乳化法。挤压法的原理是利用亲水胶体制备微胶囊，操作简单，成本低，菌体存活率高；而乳化法则是用乳化作用将细胞与载体分散，从而制备固定化细胞和微胶囊。
本发明中包埋的乳酸杆菌LZ95(分类命名：植物乳杆菌，拉丁文学名Lactobacillus plantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年11月03日，保藏编号CGMCC No.11570。)，为从婴儿粪便中分离出来的高产维生素B12的菌株，LZ95在模拟消化环境中抗性强，在模拟胃液和模拟肠液活菌数分别为2.4×108CFU/mL和1.3×108CFU/mL，经驯化其总维生素B12产量达786.5ng/mL，并且，可定植于人结肠癌细胞Caco-2。
发明内容
本发明提供一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，通过双层包埋技术对乳酸杆菌进行保护，在一定范围内延长高产维生素B12的乳酸杆菌的保质期。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，所述制备步骤如下：
(1)对乳酸杆菌LZ95菌株进行扩大培养及LZ95菌泥准备；
(2)乳酸杆菌LZ95菌泥的包埋；
(3)喷雾干燥法制高产维生素B12的乳酸杆菌制剂。
所述步骤(1)具体为：将产维生素B12的乳酸杆菌LZ95菌株按2％的接种量，接入灭好菌的500mLMRS液体培养基后，置于37℃恒温培养箱中培养24h，4500rpm离心10min，后用0.9％的生理盐水清洗菌体3次，收集LZ95菌泥。
所述步骤(2)中包埋的具体步骤为：
(1)配制pH6.8质量分数为2％的海藻酸钠溶液，90℃水浴30min，121℃灭菌，制得第一层包埋材料，在37℃条件下，30-60rpm搅拌1.5h对乳酸杆菌LZ95菌泥进行第一次包埋，使海藻酸钠能够充分与乳酸杆菌菌体贴合形成保护层，冷却至25℃，即可形成固态凝胶微芯；
(2)然后用pH6.8质量分数为2％的麦芽糊精或明胶，90℃水浴30min，121℃灭菌15min后，在37℃条件下，30-60rpm搅拌1.5h对乳酸杆菌LZ95菌泥进行二次包埋，形成包埋乳酸杆菌的固化多芯微胶囊。
所述步骤(3)中喷雾干燥的具体步骤为：将上述制得的样品进行喷雾干燥，控制进风口温度为125℃，出风口为75℃，喷雾干燥30min，收集喷雾干燥得到的乳酸杆菌粉末，完成乳酸杆菌微胶囊的制备。
所述步骤(1)中乳酸杆菌LZ95菌泥浓度约108CFU/mL。
本发明中涉及的植物乳杆菌LZ95已于2015年11月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名：植物乳杆菌，拉丁文学名Lactobacillusplantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年11月03日，保藏编号CGMCC No.11570。
本发明制备操作简单，以海藻酸钠为壁材喷雾干燥制得的乳酸杆菌包埋体包埋率、存活率及储藏活菌率最高，经正交实验，确定接种量2％、发酵温度37℃、培养时间24h，最终维生素B12产量为3.42μg/mL；本发明制得的微胶囊人工肠液处理溶出度最高，有利于肠道定植；所制得微胶囊无黏连，成球性好，表面圆整，在人工模拟胃液下缓慢释放，在人工模拟肠液下可快速释放大量乳酸杆菌。
附图说明
图1为不同壁材的产量及产率示意图；
图2为不同壁材的包埋率及存活率示意图；
图3为模拟胃肠液溶出度监测图。
具体实施方式
实施例1
1.高产维生素B12的最优乳酸杆菌菌株包埋
(1)单层包埋：本研究分别以麦芽糊精(Maltodextrin)、海藻酸钠(Sodium algaacid)和明胶(Gelatin)作为包埋壁材进行单层包埋的方法探究及包埋效果比较。
①样品准备：分别称取适量以上三种壁材溶解于500mL纯净水中(控制糖度计测得的可溶性固形物含量为15％，即质量分数约2％),搅拌均匀，90℃水浴30min，121℃灭菌15min，备用。
②在上述配置好的壁材中加入等量的乳酸杆菌LZ95的菌泥，37℃水浴低速搅拌15min使之混合均匀，以待喷雾干燥。
③不同壁材的产量结果如图1所示。
④三种包埋材料的包埋率和存活率，结果如图2所示：
(2)双层包埋：基于单层包埋的基础上，综合现有研究的报道，本实验采用双层包埋法对产维生素B12的乳酸杆菌进行包埋，并进行配方优化。
①参照单层包埋的方法,以海藻酸钠为第一层包埋材料对乳酸杆菌LZ95进行第一次包埋，37℃下低速搅拌1.5h，使海藻酸钠能够充分与乳酸杆菌菌体贴合形成保护层，而后用麦芽糊精或明胶进行二次包埋(控制可溶性固形物含量为15％)。具体配方如表1：
表1.双层包埋方法
2.喷雾干燥法制高产维生素B12的乳酸杆菌制剂
用喷雾干燥机将上述制得的样品进行喷雾干燥，控制进风口温度为125℃，出风口为75℃，喷雾干燥30min，收集喷雾干燥得到的乳酸杆菌粉末，进行产品质量检测(包括包埋率、存活率、模拟肠胃液释放性、维生素B12含量)。
3.测定方法
植物乳杆菌LZ95活菌数计数：采用菌落总数平板计数法。
4.植物乳杆菌的破壁：取适量制备的微胶囊置于0.06mol/L的柠檬酸钠解囊液中，37℃、180rpm震荡40min至其完全崩解，以供计数。
5.喷雾干燥产率的测定：喷雾干燥产率(％)＝产物沉淀质量/壁材质量×100％
6.喷雾干燥存活率的测定：
包埋率(％)＝微胶囊包埋后OD600/微胶囊包埋前OD600×100％
喷雾干燥存活率(％)＝喷雾干燥后的活菌数/喷雾干燥前理论活菌数×100％
7.人工胃肠液中的溶出度
配置人工胃液和肠液，称取0.1g微胶囊溶于10mL人工胃液中，37℃，在人工胃液中处理3h，每隔1h取一次样测活菌数。称取0.1g微胶囊溶于10mL人工肠液中，在人工肠液中处理6h，每隔1h取一次样测活菌数，计算活菌率，结果如图3所示。
人工肠液溶出活菌率(％)＝人工肠液处理后活菌数/处理前活菌数×100％；
人工胃液溶出活菌率(％)＝人工胃液处理后活菌数/处理前活菌数×100％。
8.微胶囊稳定性实验
喷雾干燥后的微胶囊置于4℃密封避光储存30天测活菌数。
储存存活率(％)＝储存30天微胶囊的活菌数/储存0天微胶囊的活菌数×100％。
9.对维生素B12产量的影响
(1)植物乳杆菌的破壁：取适量制备的微胶囊置于0.06mol/L的柠檬酸钠解囊液中，37℃、 180rpm震荡40min至其完全崩解，以供计数。
(2)测定维生素B12：测定总维生素B12样品准备：a.将无水硫酸氢二钠1.3g，无水偏重亚硫酸钠1.0g，柠檬酸1.2g用100mL蒸馏水溶解，取待测菌培养液用上述溶液混合(比例1:2)。b.再用蒸馏水定容至10倍混合液的体积，80℃水浴20min，快速冷却后调pH值至4.5，再用蒸馏水按比例稀释1000倍，即制成待测样品。
测定胞外维生素B12样品准备：将步骤a中待测菌培养液换成待测菌离心后上清液(6000rpm，5min)，其余方法步骤同上。
测定胞内维生素B12样品准备：将步骤a中的待测菌培养液离心(6000rpm，5min)后弃上清液，用生理盐水洗3次后再加入步骤a所配制的溶液(离心前待测菌培养液3倍体积)，混匀后参照上述方法b制成待测样品。
(3)维生素B12标准液的配制：方法参照国标GB 5413.14—2010。
(4)绘制标准曲线：方法参照国标GB 5413.14—2010。
(5)测定乳酸杆菌中的维生素B12的产量(总量、胞内量、胞外量)：方法及计算公式参照国标GB 5413.14—2010。
注：以上操作均为避光操作
10.结论：本研究以海藻酸钠为第一层保护剂进行包埋后，分别用麦芽糊精和明胶作为外部(第二层)包埋材料进行喷雾干燥，结果如表2。
由表2可知，两种保护剂喷雾干燥得到的乳酸杆菌制剂存活率、储存率以及在人工胃肠液中的存活率均比单一保护剂喷雾干燥的乳酸杆菌微胶囊的高，从而证明两种保护剂构成的双层包埋效果要优于单层包埋。其中，由于2％海藻酸钠和2％的明胶包埋组合不能完全溶解，粘稠度太大所以不能进行喷雾干燥。此外，以2％的海藻酸钠为第一层保护剂，2％的麦芽糊精为第二层保护剂的配方进行包埋，在喷雾干燥后得到的乳酸杆菌微制剂产率、包埋率、存活率及储藏活菌率最高，总维生素B12的含量也高达2μg/mL以上，在人工胃肠液处理中乳酸杆菌的存活率较高，证明为实验最优组合。
表2两种保护剂双层包埋对乳酸杆菌制剂的影响

Claims (5)

1.一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，其特征在于：所述制备步骤如下：
（1）对乳酸杆菌LZ95菌株进行扩大培养及LZ95菌泥准备；
（2）乳酸杆菌LZ95菌泥的包埋；
（3）喷雾干燥法制高产维生素B12的乳酸杆菌制剂。
2.如权利要求1所述的包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，其特征在于：所述步骤（1）具体为：将产维生素B12的乳酸杆菌LZ95菌株按2%的接种量，接入灭好菌的500mLMRS液体培养基后，置于37℃恒温培养箱中培养24h，4500rpm离心10min，后用0.9%的生理盐水清洗菌体3次，收集LZ95菌泥。
3.如权利要求1所述的包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中包埋的具体步骤为：
（1）配制pH6.8质量分数为2%的海藻酸钠溶液，90℃水浴30min，121℃灭菌，制得第一层包埋材料，在37℃条件下， 30-60rpm搅拌1.5h对乳酸杆菌LZ95菌泥进行第一次包埋，使海藻酸钠能够充分与乳酸杆菌菌体贴合形成保护层，冷却至25℃，即可形成固态凝胶微芯；
（2）然后用pH6.8质量分数为2%的麦芽糊精或明胶，90℃水浴30min，121℃灭菌15min后，在37℃条件下， 30-60rpm搅拌1.5h对乳酸杆菌LZ95菌泥进行二次包埋，形成包埋乳酸杆菌的固化多芯微胶囊。
4.如权利要求1所述的包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中喷雾干燥的具体步骤为：将上述制得的样品进行喷雾干燥，控制进风口温度为125℃，出风口为75℃，喷雾干燥30min，收集喷雾干燥得到的乳酸杆菌粉末，完成乳酸杆菌微胶囊的制备。
5.如权利要求3所述的包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中乳酸杆菌LZ95菌泥浓度约108CFU/mL。
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