CN110038496A - 一种壳聚糖-氧化石墨烯微球的喷雾制备方法及其应用 - Google Patents
一种壳聚糖-氧化石墨烯微球的喷雾制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖‑氧化石墨烯微球的喷雾制备方法,包括以下步骤:(1)将氧化石墨烯加入到乙酸水溶液中,超声分散,形成质量浓度为0.5‑10%的氧化石墨烯分散液;(2)将壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液;(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液采用喷雾干燥技术制得微球;(4)收集微球,将微球浸泡于京尼平溶液中交联后,洗涤、干燥,即得。本发明的制备方法简单高效,能够实现壳聚糖‑氧化石墨烯微球的连续大批量制备;所制备的壳聚糖微球粒径均匀可控,分散性好,且具有良好的生物相容性,可用于干细胞的立体培养。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域,具体涉及一种壳聚糖-氧化石墨烯微球的喷雾制备方法及其在干细胞培养中的应用。
背景技术
干细胞是一种具有自我更新能力的多潜能细胞,可以分化为多种功能细胞。由于其可从成人体内提取、没有免疫原性等特点,在自身免疫性疾病、心血管疾病、神经系统疾病治疗以及组织工程等领域具有巨大的应用前景。然而,干细胞在人体,尤其是成年人体内的含量相对很少,比如成人骨髓内10,000个有核细胞中才有一个间充质干细胞。因此,在干细胞治疗等临床应用中,需要将提取、分离出来的干细胞进行快速体外扩增,同时保持其分化为多种细胞类型的能力,然后再将扩增后的干细胞植入体内用于疾病治疗或组织修复。
传统的干细胞体外扩增方法是将提取、分离的干细胞培养于细胞培养皿中,进行传代扩增。然而对于贴壁细胞来说,细胞只能在培养皿内单层生长,因此,需要进行多次消化、传代培养来扩增干细胞。这种方法不仅导致干细胞扩增效率较低,而且干细胞经过多次消化、传代会导致干细胞增殖能力下降且易引起干细胞的自然分化。基于这一问题,近年来,通过微载体立体培养干细胞实现干细胞的快速批量扩增,在干细胞治疗等领域受到越来越多的关注。微载体立体培养是将干细胞种植于微载体的内部或表面,并使其悬浮于培养基中进行培养、生长,可以克服传统培养皿培养细胞单层生长的限制,充分利用空间和营养,可以快速批量扩增干细胞。然而,如何大量制备支持干细胞立体培养的微球载体一直是相关领域的一个难题。
壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素和聚氨基葡萄糖,系甲壳素用浓碱处理后脱去乙酰基而得到的产物。壳聚糖具有优良的生物亲和性和低毒性,在人体内能被溶解酶溶解并代谢。壳聚糖微球是以壳聚糖为载体制成的球形或类球形微粒。壳聚糖微球粘附性好,微球表面有丰富的多糖链,能被特异性细胞或组织所识别,可靶向携带药物至病灶部位。另外,壳聚糖微球表面有丰富的功能基团,能以吸附或包裹方式灵活运载不同药物。
氧化石墨烯是一种性能优异的新型碳材料,与其它石墨烯功能化衍生物所不同的是,氧化石墨烯表面具有多种含氧基团,这些含氧基团的引入由于占据了一定空间,增加了片层间的距离,使得氧化石墨烯具有极大的比表面积和优异的亲水性,可以很好的分散到水中。
微球是指由天然或合成的高分子材料(如明胶、壳聚糖、聚乳酸等)制成,粒径在1-1000微米之间。微球的制备方法主要有乳化/溶剂挥发法、喷雾干燥法、超临界二氧化碳法以及微流控法等。制备方法的不同导致制备得到的微球的形貌、结构、性能等都存在差异。
现有的氧化石墨烯/壳聚糖复合微球主要是利用壳聚糖和氧化石墨烯优异的吸附性能,而广泛用于染料废水和重金属废水的处理。还未见有将氧化石墨烯/壳聚糖微球用于干细胞培养的报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种壳聚糖-氧化石墨烯微球的喷雾制备方法。本发明的制备方法简单高效,能够实现壳聚糖-氧化石墨烯微球的连续大批量制备;所制备的壳聚糖微球粒径均匀可控,分散性好,且具有良好的生物相容性,可用于干细胞的立体培养。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种壳聚糖-氧化石墨烯微球的喷雾制备方法,包括以下步骤:
(1)将氧化石墨烯加入到乙酸水溶液中,超声分散,形成质量浓度为0.1-10%的氧化石墨烯分散液;
(2)将壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液;
(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液采用喷雾干燥技术制得微球;
(4)收集微球,将微球浸泡于京尼平溶液中交联2-12h,将交联后的微球洗涤、干燥,即得。
优选的,步骤(1)中,所述乙酸水溶液的质量浓度为1-3%;更优选的,所述乙酸水溶液的质量浓度为2%。
优选的,步骤(2)中,所述壳聚糖/氧化石墨烯分散液中,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为1:5-40:1。
优选的,步骤(2)中,搅拌速度为50-300rpm。
优选的,步骤(3)中,喷雾干燥的进风温度为120-180℃,出风温度为50-80℃,进料速度为5-10mL/min。
优选的,步骤(4)中,所述京尼平溶液的浓度为0.1mg/mL。
本发明的第二方面,提供上述方法制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球。所述壳聚糖-氧化石墨烯微球的直径为5-50μm。
本发明的第三方面,提供上述壳聚糖-氧化石墨烯微球在如下1)-4)至少一项中的应用:
1)干细胞的立体培养;
2)作为干细胞立体培养的微球载体;
3)促进干细胞增殖、并维持干细胞干性;
4)制备促进干细胞增殖、并维持干细胞干性的培养基。
本发明的第四方面,提供一种干细胞立体培养的方法,包括以下步骤:将干细胞接种至上述壳聚糖-氧化石墨烯微球上,然后将壳聚糖-氧化石墨烯微球悬浮于培养基中进行扩增培养。
本发明的有益效果:
(1)本发明制备壳聚糖-氧化石墨烯微球的方法简单高效,易于批量生产。将壳聚糖-氧化石墨烯分散液配制好后,可直接使用喷雾干燥技术大批量制备壳聚糖-氧化石墨烯微球。一次性可以获得数十克壳聚糖-氧化石墨烯微球。
(2)本发明制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球具有优异的促进干细胞贴壁的能力,适用于微球载体立体培养干细胞。
(3)本发明制备的微球粒径均匀可控,分散性好,具有良好的生物相容性,可以直接用于干细胞培养。
附图说明
图1:本发明制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球的扫描电镜图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的,如何大量制备支持干细胞立体培养的微球载体一直是相关领域的一个难题。传统的微球一般是用于药物缓释、细胞支架和细胞注射等领域,特别是作为药物的载体。现有报道的氧化石墨烯/壳聚糖复合微球主要是利用壳聚糖和氧化石墨烯优异的吸附性能,而广泛用于染料废水和重金属废水的处理。还未见有将氧化石墨烯/壳聚糖微球用于干细胞培养的报道。
不同方法制备得到的微球的形貌、结构、性能等都会存在较大差异。本发明利用喷雾干燥结合交联处理的方法制备得到壳聚糖-氧化石墨烯微球,并意外的发现,本发明所制备的具有特定形貌和结构组成的壳聚糖-氧化石墨烯微球可以用于干细胞的立体培养、促进干细胞增殖,并维持干细胞的干性。
在本发明的一种实施方案中,给出了壳聚糖-氧化石墨烯微球的制备方法,包括以下步骤:
(1)将氧化石墨烯加入到浓度为1-3%的乙酸水溶液中,超声分散,形成质量浓度为0.1-10%的氧化石墨烯分散液;
(2)将壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液,所述壳聚糖/氧化石墨烯分散液中,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为1:5-40:1;
(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液通过喷雾干燥技术制得微球,喷雾干燥的进风温度为120-180℃,出风温度为50-80℃,进料速度为5-10mL/min;
(4)收集微球,将微球浸泡于浓度为0.1mg/mL的京尼平溶液中交联2-12h,将交联后的微球洗涤、干燥,即得。
本发明的上述制备方法中,各步骤相辅相成,是一个有机的整体。其中,氧化石墨烯很容易团聚,共混时难以实现粒子的均匀分散,因此,本发明制备壳聚糖-氧化石墨烯微球的关键之一是如何使壳聚糖和氧化石墨烯形成均匀稳定的分散液;氧化石墨烯与壳聚糖的重量配比,以及分散溶剂乙酸水溶液的浓度是影响壳聚糖/氧化石墨烯分散液稳定性的主要因素;经多次试验发现,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为1:5-4:1、乙酸水溶液的浓度为1-3%时,所制备的壳聚糖/氧化石墨烯分散液的稳定性较佳。
在制备得到稳定性好的壳聚糖/氧化石墨烯分散液后,本发明采用喷雾干燥的方法制备壳聚糖-氧化石墨烯微球。进风温度、出风温度和进料速度是影响喷雾干燥制备微球效果的主要因素,其中,适当的进风温度可以使所制备的微球外观美观而且所成微球数目众多。进风温度要根据溶剂和溶质的性质来确定,既要高于溶剂的沸点,使溶剂在干燥过程中能及时被干燥挥发,又不能温度过高,使球壁软化,破坏微球,所以进风温度对成球至关重要。
出风温度也是喷雾干燥过程中的一个重要参数,出风温度会影响制备的微球的外观及流动性。经多次试验发现,50-80℃时效果较好。
进料速度是影响喷雾干燥法制备微球的又一个重要参数,如果进料速度过快,物料在雾化室中来不及干燥即被收集,造成粘连甚至结块,从而影响微球质量;进料速度过慢既浪费时间又消耗过多的能量,因此,进料速度只有在合适的范围内才可以使物料得到充分的干燥,形成质量较好的微球。
经多次试验发现,喷雾干燥的进风温度为120-180℃、出风温度为50-80℃、进料速度为5-10mL/min时,成球效果好,微球数量多,表面光滑,球外杂乱物较少。
为进一步的提高制备的微球的机械强度,本发明将制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球采用特定浓度的京尼平进行交联处理,有效提高了微球的机械强度。
经试验验证,壳聚糖-氧化石墨烯微球的尺寸和形貌会影响对成体干细胞的增殖效果,只有采用本发明方法制备的具有特定结构组成和形貌的壳聚糖-氧化石墨烯微球才可以有效促进成体干细胞的增殖,并维持干细胞的干性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
实施例1:壳聚糖-氧化石墨烯微球的制备
(1)将0.5g氧化石墨烯加入到50mL浓度为2%的乙酸水溶液中,超声分散1h,形成质量浓度为1%的氧化石墨烯分散液。
(2)将2g壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液;壳聚糖/氧化石墨烯分散液中,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为4:1。
(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液通过喷雾干燥技术制得微球喷雾干燥条件为:进风温度150℃,出风温度为60℃,进料速度为8mL/min。
(4)收集微球,将微球浸泡于浓度为0.1mg/ml的京尼平溶液中交联6h,将交联后的微球洗涤、干燥,即得。
实施例2:壳聚糖-氧化石墨烯微球的制备
(1)将氧化石墨烯加入到质量浓度为1%的乙酸水溶液中,超声分散,形成质量浓度为0.5%的氧化石墨烯分散液。
(2)将壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液;壳聚糖/氧化石墨烯分散液中,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为40:1。
(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液通过喷雾干燥技术制得微球喷雾干燥条件为:进风温度180℃,出风温度为80℃,进料速度为10mL/min。
(4)收集微球,将微球浸泡于浓度为0.1mg/ml的京尼平溶液中交联12h,将交联后的微球洗涤、干燥,即得。
实施例3:壳聚糖-氧化石墨烯微球的制备
(1)将氧化石墨烯加入到质量浓度为3%的乙酸水溶液中,超声分散,形成质量浓度为10%的氧化石墨烯分散液。
(2)将壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液;壳聚糖/氧化石墨烯分散液中,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为1:5。
(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液通过喷雾干燥技术制得微球喷雾干燥条件为:进风温度120℃,出风温度为50℃,进料速度为5mL/min。
(4)收集微球,将微球浸泡于浓度为0.1mg/ml的京尼平溶液中交联2h,将交联后的微球洗涤、干燥,即得。
试验例1:
将人源脂肪间充质干细胞接种在实施例1-实施例3制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球上,分别培养1、3、5天后,检测细胞存活率。通过CCK8染色,发现与对照材料(培养皿)相比,在微球上生长的细胞存活率显著升高,而且随着培养时间的延长,细胞存活率逐渐升高,说明本发明制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球具有很好的生物相容性;钙黄素AM-PI染色表明在壳聚糖-氧化石墨烯微球上生长的细胞保持良好的生物活性,细胞存活率高达99%以上。在成骨和成脂诱导液的作用下,微球上收获的脂肪间充质干细胞能够分化为成骨和脂肪细胞。
结果表明,本发明制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球能够促进脂肪间充质干细胞的增殖,并能够维持细胞的干性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种壳聚糖-氧化石墨烯微球的喷雾制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将氧化石墨烯加入到乙酸水溶液中,超声分散,形成质量浓度为0.1-10%的氧化石墨烯分散液;
(2)将壳聚糖加入到氧化石墨烯分散液中,搅拌溶解,形成壳聚糖/氧化石墨烯分散液;
(3)将壳聚糖/氧化石墨烯分散液采用喷雾干燥技术制得微球;
(4)收集微球,将微球浸泡于京尼平溶液中交联2-12h,将交联后的微球洗涤、干燥,即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述乙酸水溶液的质量浓度为1-3%;优选的,所述乙酸水溶液的质量浓度为2%。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述壳聚糖/氧化石墨烯分散液中,壳聚糖和氧化石墨烯的质量比为1:5-40:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,搅拌速度为50-300rpm。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,喷雾干燥的进风温度为120-180℃,出风温度为50-80℃,进料速度为5-10mL/min。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述京尼平溶液的浓度为0.1mg/mL。
7.权利要求1-6任一项所述方法制备的壳聚糖-氧化石墨烯微球。
8.根据权利要求7所述的壳聚糖-氧化石墨烯微球,其特征在于,所述壳聚糖-氧化石墨烯微球的直径为5-50μm。
9.权利要求7或8所述的壳聚糖-氧化石墨烯微球在如下1)-4)至少一项中的应用:
1)干细胞的立体培养;
2)作为干细胞立体培养的微球载体;
3)促进干细胞增殖、并维持干细胞干性;
4)制备促进干细胞增殖、并维持干细胞干性的培养基。
10.一种干细胞立体培养的方法,其特征在于,包括以下步骤:将干细胞接种至权利要求7或8所述的壳聚糖-氧化石墨烯微球上,然后将壳聚糖-氧化石墨烯微球悬浮于培养基中进行扩增培养。
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CN111672432A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-09-18 | 西北大学 | 用于酶固定化的氧化石墨烯/壳聚糖复合气凝胶的制备方法 |
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