CN102250390B - 海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法。其分子结构式如下：
Description
技术领域
本发明涉及一种海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法，属于高分子生物医用材料。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)在体外培养时表现出多向分化潜能，同时具有体外易分离、培养，并且不表达共刺激抗原B7等特性[Brinchmann JE.Expanding autologous multipotentmesenchymal bone marrow stromal cells(自体多能骨髓间充质干细胞的扩增)Journal of theneurological sciences，2008，265：127-130]，因此是细胞治疗理想的细胞来源，已经广泛应用于再生医学和组织工程领域。但人体组织中MSCs数量极少，约占骨髓有核细胞的0.001％～0.01％，远远不能满足临床治疗的需要[Croft A，Przyborski S.Mesenchymal stemcells from the bone marrow stroma：basic biology and potential for cell therapy(骨髓间充质干细胞：基本的生物学性状和细胞治疗的潜力)Current Anaesthesia & Critical Care，2004，15：410-417]。因此，在保证其细胞功能的前提下，在体外大规模、规范化培养和扩增MSCs成为临床应用的关键。
近年来发展的微载体动态培养体系是规模化培养贴壁细胞的新措施，早期微载体多采用人工合成聚合物如聚甲基丙烯酸-2羟乙酯(PHEMA)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等制备。近年来，越来越多的研究者尝试用天然聚合物及其衍生物来制备微载体。天然聚合物来源丰富，在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。制备微载体常用的的天然聚合物有明胶、胶原、海藻酸盐、壳聚糖、纤维素、葡聚糖等[(a)过琴媛，王辉.微载体培养动物细胞技术的研究进展.微生物学免疫学进展，2007，35：73-75]。
目前常用的以海藻酸盐制备的微载体大多为以二价阳离子如Ca2+、Ba2+、Sr2+等为交联剂的离子交联型水凝胶。但离子交联水凝胶中的二价离子很容易与水凝胶周围介质中的离子(如Na+、K+等)发生交换，而且这一过程很难控制也无法避免，因而此类水凝胶在生理介质环境中因离子交换易解体而失去水凝胶特性。为了克服因发生离子交换反应而引起的微载体的过度溶胀或变形，经常以聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸包覆海藻酸盐微载体或通过自由基聚合和缩合反应在海藻酸盐水凝胶载体表面引入化学交联层对其进行表面修饰，海藻酸盐微载体稳定性显著提高[(a)Darrabie MD，Kendall Jr WF，Opara EC.Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules(聚-L-鸟氨酸涂层海藻酸盐微胶囊的特征)Biomaterials，2005，26：6846-6852；(b)Mazumder MAJ，Shen F，Burke NAD，Potter MA，Sto ver HDH.Self-cross-linking polyelectrolyte complexes for therapeutic cellencapsulation(用于治疗性细胞封装的自交联聚电解质复合物)Biomacromolecules，2008，9：2292-2300]。
将离子交联海藻酸盐水凝胶微载体用于扩增MSCs，由于微载体材料不能降解，需用胰酶将细胞消化下来。但有研究表明，酶解过程容易对干细胞染色体组型的稳定性造成不利影响[(a)Mitalipova MM，Rao RR，Hoyer DM，Johnson JA，Meisner LF，Jones KL，et al.Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells(保存人胚胎干细胞的遗传完整性)Nature Biotechnology，2005，23：19-20]。同时，MSCs作为细胞治疗或组织工程的种子细胞使用时，动物来源的消化酶成分的混入可能对其临床使用造成潜在的危险性[Zhang J，Skardal A，Prestwich GD.Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cellexpansion and easy cell recovery(可用于细胞增殖和细胞恢复的工程化细胞外基质)Biomaterials，2008，29：4521-4531]。而更重要的是，由于微载体多是大孔结构，经三维动态扩增后相当数量的细胞(有时甚至达到40％以上)存在于载体的内部孔隙中，因此很难通过常规的酶消化方式完全消化下来，从而使最终的细胞产量受到影响[Bancel S，HuWS.Confocal laser scanning microscopy examination of cell distribution in macroporousmicrocarriers(共聚焦激光扫描显微镜检测多孔微载体细胞分布)Biotechnology Progress，1996，12：398-402]。因此，有必要从模拟MSCs在体内生长的三维微环境角度出发，以分子水平设计和制备出细胞相容性良好的新型微载体材料，在温和的生理条件下通过非酶解途径降解载体材料，快速回收扩增后的MSCs。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海藻酸盐水凝胶微载体及其制备方法。所述的海藻酸盐水凝胶微载体具有优良的生物相容性和体外降解性的特点；其原料来源丰富，制备方法简单易行，成本较低。
本发明是通过以下技术方案实现的，一种海藻酸盐水凝胶微载体，其特征在于，该海藻酸盐水凝胶的分子结构式如式1所示，其上附着了壳聚糖、肝素和碱性成纤维细胞生长因子或壳聚糖和纤连蛋白。它的性质为：粒径为450μm～950μm，含水率高，柔软而富有弹性，具有多孔结构，海藻酸盐水凝胶1H-NMR谱图中，在化学位移D＝3.25和D＝2.85的两个振动峰分别对应于胱胺交联桥上-S-CH2-和-CH2-NH-中两个亚甲基的质子。
式1
其中：
为海藻酸盐。
上述海藻酸盐水凝胶微载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将海藻酸钠加入pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液中，配制质量浓度为2.0～8.0％的海藻酸钠溶液，并称重，按水溶性碳二亚胺与海藻酸钠质量比为(0.5～1.0)∶(0.2～0.8)向海藻酸钠溶液中加入水溶性碳二亚胺，室温搅拌，得到海藻酸钠混合溶液，然后按花生油质量、质量浓度为25％的吐温80水溶液质量与海藻酸钠溶液质量比为(1～10)∶(0.1～0.5)∶2依次向海藻酸钠混合溶液中加入花生油和吐温80水溶液，在室温下搅拌形成均匀的W/O型悬浮液，再按胱胺质量与海藻酸钠质量比为(0.2～1.5)∶(0.2～0.8)向悬浮液中加入胱胺交联剂，在40℃、500rpm的条件下恒温磁力搅拌1～3h。然后对产物进行抽滤和无水乙醇洗涤得到海藻酸盐水凝胶微载体。
2)将步骤1)得到的海藻酸盐水凝胶微载体加入相对分子质量为1～100k、质量浓度为0.1～1.0％的壳聚糖溶液中浸泡1～10h，接着在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10～24h，然后将海藻酸盐水凝胶微载体在-20～-80℃条件下预冻10～20h，再移入冻干机中在0～20℃下冷冻干燥2d得到具有多孔结构的海藻酸盐水凝胶微载体。
3)将步骤2)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.1～0.5％的肝素溶液中浸泡1～5h，接着在pH为7.4的磷酸盐溶液中浸泡10～24h，然后在质量浓度为0.0001～0.001％的碱性成纤维细胞生长因子溶液中浸泡1～3h，得到海藻酸盐水凝胶微载体；或者将步骤2)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.0001～0.001％的纤连蛋白溶液中浸泡1～3h，得到海藻酸盐水凝胶微载体。
本发明具有如下优点：本发明中的海藻酸盐水凝胶微载体具有良好的力学强度和细胞相容性，制备方法简单、原料来源丰富，海藻酸盐水凝胶微载体的各项理化性能、力学强度、降解速率以及表面特性在很大范围内可控，可用于扩增MSCs。将该海藻酸盐水凝胶微载体用于MSCs的体外扩增时，细胞培养后期加入半胱胺酸、N-乙酰基半胱氨酸、谷胱甘肽等还原剂成分，海藻酸盐水凝胶交联桥上的二硫键断开，即发生二硫键-巯基转化反应，可使水凝胶解体完全释放出微载体所载细胞，从而不需酶消化过程，避免了酶消化过程对MSCs造成的不利影响，同时可有效提高细胞产量。
附图说明
图1为海藻酸钠和实施例1中步骤1)制的海藻酸盐水凝胶1H-NMR谱图，
图2为实施例4中步骤1)制的海藻酸盐水凝胶微载体光镜照片，
图3为实施例4中步骤2)制的海藻酸盐水凝胶微载体扫描电镜照片，
图4为实施例1制的海藻酸盐水凝胶微载体XPS谱图。图中(a)为步骤1)制的海藻酸盐水凝胶微载体谱图，谱图中出现硫元素的峰，(b)为步骤2)制的海藻酸盐水凝胶微载体谱图，谱图中硫元素的峰消失，说明该微载体上附着壳聚糖，(c)为步骤3)制的海藻酸盐水凝胶微载体谱图，谱图中出现硫元素峰，说明微载体表面附着了肝素。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：
(1)称取0.45g海藻酸钠加入10mL的pH为5的磷酸盐缓冲溶液中，在室温条件下搅拌至海藻酸钠完全溶解。取2g海藻酸钠溶液，加入0.6g EDC，在4℃下搅拌30min。
(2)向上述溶液中加入5g花生油和质量浓度为25％的吐温80水溶液0.25g，室温下搅拌至形成均匀的悬浮液。然后加入1.5ml质量浓度为37％的胱胺水溶液，在40℃、500rpm条件下恒温磁力搅拌反应1h。抽滤产物，同时用无水乙醇洗涤，得到海藻酸盐水凝胶微载体。
(3)将步骤(2)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在相对分子质量为5k、质量浓度为0.3％的20ml壳聚糖溶液中浸泡5h，接着在pH为7.4的50ml磷酸盐缓冲溶液中浸泡24h，然后在-20℃下预冻10h后冷冻干燥2d，得到具有多孔结构的附着壳聚糖的海藻酸盐水凝胶微载体。
(4)将步骤(3)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.1％的20ml肝素溶液中浸泡3h，接着在pH为7.4的50ml磷酸盐缓冲溶液中浸泡24h，然后在质量浓度为0.0004％的1ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)溶液中浸泡1h，得到附着壳聚糖、肝素和BFGF的海藻酸盐水凝胶微载体。或者将步骤(3)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.0004％的1ml纤连蛋白溶液中浸泡1h，得到附着壳聚糖和纤连蛋白的海藻酸盐水凝胶微载体。
制得的0.1g海藻酸盐水凝胶微载体在37℃条件下，10ml、20mmol/L的半胱氨酸溶液中降解时间为18～20h。
实施例2：
原料、制备方法与实施例1相似，不同处在于海藻酸钠用量由4.5g变为0.6g，制得的0.1g海藻酸盐水凝胶微载体在37℃条件下，10ml、20mmol/L的半胱氨酸溶液中降解时间为25～28h。
实施例3：
原料、制备方法与实施例2相似，不同处在于加入吐温80水溶液的量由0.25g变为0.37g，制得的0.1g海藻酸盐水凝胶微载体在37℃条件下，10ml、20mmol/L的半胱氨酸溶液中降解时间为25～28h。
实施例4：
原料、制备方法与实施例3相似，不同处在于胱胺水溶液的质量浓度由37％变为80％，制得的0.1g海藻酸盐水凝胶微载体在37℃条件下，10ml、20mmol/L的半胱氨酸溶液中降解时间为30～32h。
实施例5：
原料、制备方法与实施例4相似，不同处在于壳聚糖分子量由5k变为50k，制得的0.1g海藻酸盐水凝胶微载体在37℃条件下，10ml、20mmol/L的半胱氨酸溶液中降解时间为30～32h。
Claims (2)
1.一种海藻酸盐水凝胶微载体，其特征在于，该海藻酸盐水凝胶的分子结构式如式1所示，其上附着了壳聚糖、肝素和碱性成纤维细胞生长因子或壳聚糖和纤连蛋白，它的性质为：粒径为450μm～950μm，含水率高，柔软而富有弹性，具有多孔结构，海藻酸盐水凝胶1H-NMR谱图中，在化学位移D＝3.25和D＝2.85的两个振动峰分别对应于胱胺交联桥上-S-CH2-和-CH2-NH-中两个亚甲基的质子，
式1
其中：
为海藻酸盐。
2.一种制备权利要求1所述海藻酸盐水凝胶微载体的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将海藻酸钠加入pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液中，配制质量浓度为2.0～8.0％的海藻酸钠溶液，并称重，按水溶性碳二亚胺与海藻酸钠质量比为(0.5～1.0)∶(0.2～0.8)向海藻酸钠溶液中加入水溶性碳二亚胺，室温搅拌，得到海藻酸钠混合溶液，然后按花生油质量、质量浓度为25％的吐温80水溶液质量与海藻酸钠溶液质量比为(1～10)∶(0.1～0.5)∶2依次向海藻酸钠混合溶液中加入花生油和吐温80水溶液，在室温下搅拌形成均匀的W/O型悬浮液，再按胱胺质量与海藻酸钠质量比为(0.2～1.5)∶(0.2～0.8)向悬浮液中加入胱胺交联剂，在40℃、500rpm的条件下恒温磁力搅拌1～3h，然后对产物进行抽滤和无水乙醇洗涤得到海藻酸盐水凝胶微载体；
2)将步骤1)得到的海藻酸盐水凝胶微载体加入相对分子质量为1～100k、质量浓度为0.1～1.0％的壳聚糖溶液中浸泡1～10h，接着在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10～24h，然后将海藻酸盐水凝胶微载体在-20～-80℃条件下预冻10～20h，再移入冻干机中在0～20℃下冷冻干燥2d得到具有多孔结构的海藻酸盐水凝胶微载体；
3)将步骤2)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.1～0.5％的肝素溶液中浸泡1～5h，接着在pH为7.4的磷酸盐溶液中浸泡10～24h，然后在质量浓度为0.0001～0.001％的碱性成纤维细胞生长因子溶液中浸泡1～3h，得到海藻酸盐水凝胶微载体；或者将步骤2)得到的海藻酸盐水凝胶微载体在质量浓度为0.0001～0.001％的纤连蛋白溶液中浸泡1～3h，得到海藻酸盐水凝胶微载体。
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