CN109477054A - 液态培养基组合物的制造方法及用于该制造方法的制造装置 - Google Patents

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Abstract

该制造方法是将含有特定化合物的第1液体A1和含有连接物质的第2液体B1混合从而制造液态培养基组合物的方法，所述制造方法使用该制造装置来实施。该制造装置具有在壁部设置有至少2个开口部2、3的容器1，前述的2个开口部通过容器外的管道4被相互连接，该管道具备具有可作为泵管被安装于蠕动泵5的形状和柔软性的部分。该制造方法中，使蠕动泵运转，使第1液体和第2液体循环而进行混合，在容器内形成目标液态培养基组合物。

Description

液态培养基组合物的制造方法及用于该制造方法的制造装置
技术领域
本发明涉及液态培养基组合物的制造方法、及用于实施该制造方法的制造装置。更详细而言，本发明涉及下述制造方法及优选用于实施该制造方法的制造装置，所述制造方法中，将为了形成前述培养基组合物而应当混合的至少2种液体(含有特定的化合物的第1液体、及含有将该特定的化合物彼此结合而形成结构体的物质的第2液体)适当地混合，从而制造分散有前述结构体的培养基组合物。
背景技术
近年来，用于使在动物、植物体内发挥不同作用的各种器官、组织及细胞在生物体外增殖或维持的技术不断进展。使这些器官、组织在生物体外增殖或维持分别被称为器官培养、组织培养，使从器官、组织分离的细胞在生物体外增殖、分化或维持被称为细胞培养。
细胞培养是使分离的细胞在培养基中而在生物体外进行增殖、分化或维持的技术，其已成为对生物体内的各种器官、组织、细胞的功能及结构进行详细分析所不可缺少的技术。
另外，利用该技术培养的细胞及/或组织已在化学物质、医药品等的药效及毒性评价、酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大量生产、再生医疗(其修补由于疾病、缺损而丧失的器官、组织、细胞)、植物的品种改良、基因重组作物的制成等各种领域中得到利用。
作为用于培养细胞等(器官、组织、细胞)的培养基之一，可举出液体培养基，本申请的发明人已成功开发了能以悬浮状态培养细胞等的液态培养基组合物(专利文献1及2)。
对于专利文献1中记载的液态培养基组合物而言，特定的化合物(尤其是具有阴离子性官能团的高分子化合物)介由2价金属阳离子等发生聚集而形成不定形的结构体，该结构体分散于液体培养基中而成为悬浮的状态。下文中，将具有阴离子性官能团的高分子化合物等之类的上述特定的化合物亦称为“特定化合物”，将使该特定化合物彼此结合的2价金属阳离子等物质亦称为“连接物质”。
该培养基组合物成为能够在不伴有存在引起细胞等的受损、功能丧失的风险的操作(振荡、旋转等)的情况下以悬浮状态培养细胞等的理想液态培养基。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/017513号
专利文献2：美国专利申请公开第2014/0106348A1号说明书
发明内容
发明所要解决的课题
上述专利文献1中记载的液态培养基组合物的原本期待的理想状态为下述状态：通过特定化合物彼此介由2价金属阳离子等连接物质连接而形成的结构体均匀分散于液体培养基中。
然而，本申请的发明人对该液态培养基组合物的实际的制作工序进行了详细研究，结果发现，为了得到这样的理想状态，必须注意混合方法、混合条件，以使得结构体不会在培养基组合物中的局部集中地形成。
例如，特定化合物为脱酰基结冷胶的情况下，在该脱酰基结冷胶与液体培养基混合时，介由液体培养基中的连接物质(例如，钙离子)而形成不定形的结构体，其成为用于使细胞等悬浮的载体。
然而，在一边对包含连接物质的液体培养基进行搅拌、一边向其中注入包含特定化合物的液体这样的混合方法中，两种液体与外界气体接触，因此，有可能发生外界气体中的细菌混入至培养基中这样的问题。
另外发现，在将包含连接物质的液体培养基收容至容器内、向其中注入包含高浓度的特定化合物的液体这样的混合方法中，在两种液体合流的瞬间，特定化合物与连接物质接触而形成结构体，因此，该结构体在混合液中较长地连接成带状而成为悬浮的状态(或带状的结构体缠结成团块状的状态)，有时无法成为原本期待的均匀的分散状态。另外还发现，即使以较高速度进行搅拌，也会产生这样的状态。并且还发现，一旦在液体培养基中形成这样的带状的结构体，从分子链所形成的双螺旋彼此介由连接物质(例如，钙离子)形成牢固的三维网络这样的该结构体的性质考虑，不容易将其细碎地切断而分散于母材中。
因此，为了得到目标结构体良好分散的混合液，需要能高速地使两种液体接触的那样的特殊搅拌装置，但也已知在很多情况下，这样的特殊搅拌装置的搅拌作用通常仅限于对3L(L表示升)以下程度的少量的液体有效，而不适于大量(例如，20L以上等)制造上述的结构体良好分散的混合液。
本发明的目的在于解决上述的问题，提供一种制造方法及优选用于实施该制造方法的制造装置，所述制造方法能将包含2价金属阳离子等连接物质的任意液体、和包含特定化合物的液体无菌地混合，能大量地得到分散有微细的结构体的液态培养基组合物。
用于解决课题的手段
能达成前述目的的本发明的主要构成如下所述。
〔1〕液态培养基组合物的制造方法，所述方法中，将含有下述特定化合物(i)的第1液体、和含有下述连接物质(ii)的第2液体混合，从而制造液态培养基组合物，其特征在于，
使用在壁部设置有至少2个开口部的容器，其中，前述至少2个开口部通过容器外的管道(tube)被相互连接，该管道具备具有可作为泵管(pumping tube)被安装于蠕动泵的形状和柔软性的部分，
将前述管道安装于前述蠕动泵，使该蠕动泵运转，使前述第1液体和第2液体在前述管道与前述容器之间循环而进行混合，从而在容器内形成分散有前述特定化合物介由前述连接物质结合而成的结构体的液态培养基组合物，
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体。
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
〔2〕如前述〔1〕所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，前述特定化合物(i)为脱酰基结冷胶，第1液体为含有该脱酰基结冷胶的水溶液，
前述连接物质(ii)为钙离子及镁离子中的一方或两方，第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基的浓缩液。
〔3〕如前述〔2〕所述的培养基组合物的制造方法，其中，前述液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.001％(w/v)～1.0％(w/v)。
〔4〕如前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，第1液体与第2液体的体积混合比率为：相对于第1液体的体积100而言，第2液体的体积为50～200。
〔5〕如前述〔1〕～〔4〕中任一项所述的制造方法，其中，前述开口部中的一个开口部被设置于构成前述容器的底面的壁部或构成侧面的壁部的底部作为出口，
前述开口部中的另一个开口部被设置于构成前述容器的上面的壁部或构成侧面的壁部的上部作为入口，
使前述蠕动泵运转，针对第1液体和第2液体而使这些液体在管道内沿从前述出口向前述入口的方向移动，由此，使容器内的第1液体和第2液体沿从上方向下方的方向移动。
〔6〕如前述〔1〕～〔5〕中任一项所述的制造方法，其中，前述2个开口部作为出口和入口而成为1对，在前述容器上设置有多对前述2个开口部，各对中的2个开口部分别通过管道连接，
前述第2工序中，将各管道安装于分别独立的蠕动泵，使该蠕动泵运转，使前述第1液体和第2液体从各管道通过而进行循环。
〔7〕如前述〔1〕～〔6〕中任一项所述的制造方法，其中，前述容器由柔软的材料形成、以使得该容器的容积能根据被收容在该容器内部的液体的体积而改变，由此，能在确保该容器内的密闭性的同时，向该容器内注入液体并且向该容器外排出液体。
〔8〕如前述〔1〕～〔7〕中任一项所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，在前述容器上设置有用于进行液体向该容器内的进入和从该容器内的排出的出入口用的开口部，
预先将第1液体及第2液体中的任一种液体装入前述容器中，一边用前述蠕动泵使该液体循环，一边从前述出入口用的开口部向容器内注入另一种液体。
〔9〕制造装置，其用于实施前述〔1〕所述的液态培养基组合物的制造方法，
该制造装置具有用于收容在前述制造方法中混合的第1液体和第2液体的容器，
在该容器的壁部设置有至少2个开口部，这些开口部通过容器外的管道被相互连接，
前述管道具备下述部分，前述部分具有可作为泵管安装于以输送该管道内的液体的方式构成的蠕动泵并且可在该蠕动泵中作为泵管运转的形状和柔软性。
〔10〕如前述〔9〕所述的制造装置，其中，
前述开口部中的一个开口部被设置于构成前述容器的底面的壁部或构成侧面的壁部的底部，
前述开口部中的另一个开口部被设置于构成前述容器的上面的壁部或构成侧面的壁部的上部。
〔11〕如前述〔9〕或〔10〕所述的制造装置，其中，前述2个开口部作为出口和入口而成为1对，在前述容器上设置有多对前述2个开口部，各对中的2个开口部分别通过管道连接。
〔12〕如前述〔9〕～〔11〕中任一项所述的制造装置，前述制造装置还具有前述蠕动泵作为该制造装置的构成要素，该蠕动泵是安装前述管道并使该管道作为泵管运转的蠕动泵。
〔13〕如前述〔12〕所述的制造装置，其中，前述开口部中的一个开口部被设置于构成前述容器的底面的壁部或构成侧面的壁部的底部，
前述开口部中的另一个开口部被设置于构成前述容器的上面的壁部或构成侧面的壁部的上部，
前述制造装置构成为前述蠕动泵以使前述管道内的液体从下侧的开口部向上侧的开口部移动的方式运转，由此使得被收容在容器内的液体从上方向下方移动。
〔14〕如前述〔9〕～〔13〕中任一项所述的制造装置，其中，前述容器由柔软的材料形成、以使得该容器的容积能根据被收容在该容器内部的液体的体积而改变，由此，能在确保该容器内的密闭性的同时，向该容器内注入液体并且向该容器外排出液体。
〔15〕如前述〔9〕～〔14〕中任一项所述的制造装置，其中，在前述容器上还设置有用于进行液体向该容器内的进入和从该容器内的排出的出入口用的开口部。
发明的效果
根据本发明的制造方法(下文中，也称为该制造方法)，通过图1的蠕动泵5对管道4的作用，能使第1液体和第2液体在〔从容器排出至管道，从该管道通过而返回至原来的容器〕这样的封闭路径中循环。通过该封闭路径的循环，能在使两种液体不与外界气体等污染源接触、并且不与除容器和管道(包括用于将它们连接的接合器(connector)部件)以外的其他构件接触的情况下将这两种液体混合。
下文中，也将进行下述循环的移动表示为〔液体在容器与管道之间进行循环〕，也简单表示为〔液体进行循环〕，所述循环是：通过蠕动泵的运转，使得容器内的液体从一个开口部排出至管道内，从该管道通过，从另一个开口部再次返回至该容器内。
另外，通过该制造方法，能无菌且高效地制造两种液体总计达到100L这样大量的液态培养基组合物。
另外，对于本发明的制造装置(下文中，也简称为该制造装置)而言，通过具有容器和管道的构成，从而能实施该制造方法，能进行前述的无菌且大量的混合。尤其是，若使容器为由柔软的合成树脂等有机高分子材料形成的袋状物，则能由廉价的袋状物和管道构成装置整体，因此，可在每次混合后丢弃。由此，不需要进行容器内、管道内的洗涤，另外，容器内、管道内的无菌性进一步提高。
另外，虽然该制造装置是必须包含蠕动泵的装置，但管道只是被安装于蠕动泵的驱动部分而并非一体地连接。因此，具有容器和管道的循环路径的主要部分可在每次混合后丢弃，不需要进行容器内、管道内的洗涤。
附图说明
[图1]图1为概略地表示本发明的制造方法及制造装置的图。
[图2]图2为表示本发明的制造装置的结构例的图。
[图3]图3为表示本发明的制造装置的其他结构例的图。
[图4]图4为表示本发明的制造装置的其他结构例的图。图4(a)示出容器的一个端面。图4(b)示出容器的另一个端面。图4(c)为表示制造装置整体的连接结构的框图，用立体图示出容器。图4(c)中，用虚线表示遮挡的部分，用于对该遮挡的部分标注附图标记的引出线也使用了虚线。
[图5]图5为表示本发明的制造方法及制造装置中使用的蠕动泵的结构的一例的图。
[图6]图6为示出本发明的实施例中用于对制造的液态培养基组合物的混合状态进行评价的判定基准的示意图。
具体实施方式
下文中，对本发明的制造方法进行详细说明，并提及本发明的制造装置，也对该制造装置的结构进行详细说明。
本发明的制造方法是将含有下述特定化合物(i)的第1液体、和含有下述连接物质(ii)的第2液体混合从而制造液态培养基组合物的方法。这些特定化合物、连接物质、及包含它们的第1液体、第2液体的详细情况在后文中说明。
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体。
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
关于该制造方法，如图1所例示的那样，使用在壁部设置有至少2个开口部2、3的容器1。前述至少2个开口部2、3通过容器外的管道4被相互连接，该管道4具备具有可作为泵管被安装于蠕动泵5的形状和柔软性的部分作为该管道的一部分或全部。
图1中，虽然容器1内的液体未以明确地分离成第1液体A1和第2液体B1的方式绘制，但通过对容器内的液体标注附图标记A1、B1，从而表明是将第1液体A1和第2液体B1混合的中途。
在前述容器1的壁部设置有至少2个开口部2、3，上述至少2个开口部2、3通过位于容器1外侧的管道4被相互连接。该管道4具有可被安装于蠕动泵5从而作为泵管发挥功能的形状和柔软性。图1中，未图示蠕动泵5的详细的结构，用虚线来表明该蠕动泵的存在。该蠕动泵5可以作为本发明的制造装置的一部分被包含，另外，也可以是外部装置。
该制造方法中，如图1所示那样，将管道4安装于蠕动泵5。即，以该管道4成为蠕动泵5的泵管的方式，将该管道4卡合于该蠕动泵5。而后，使该蠕动泵4运转，使第1液体A1和第2液体B1在容器1与管道4之间循环，通过该循环，将两种液体搅拌、混合，形成液态培养基组合物。在两种液体经充分搅拌、混合而成的液态培养基组合物中，均匀分散有特定化合物介由连接物质结合而成的结构体，成为适于以悬浮状态培养细胞等的液态培养基组合物。
通过该制造方法，如上所述，能对两种液体总计达到1000L或更多的任意大量的第1液体A1和第2液体B1进行处理，而且，能在不接触外界气体等污染源的情况下，通过简单的操作将两种液体充分混合。
本发明的制造装置是用于实施上述的本发明的制造方法的装置。如图1所示那样，该制造装置具有用于收容在该制造方法中混合的第1液体A1和第2液体B1的容器1。在该容器1的壁部设置有至少2个开口部2、3，上述至少2个开口部通过容器外的管道4而被相互连接，由此，形成了下述的循环流路：被收容在容器1内的液体从一个开口部2排出，从该管道4通过，可从另一个开口部3返回至前述容器1内。该管道4具有作为可安装于以输送该管道内的液体的方式构成的蠕动泵5的泵管的特性。通过将该管道安装于蠕动泵，并使该蠕动泵运转，从而使得容器内的液体在不接触外界气体等污染源的情况下在容器1与管道4之间循环，将其充分混合，得到目标液态培养基组合物。
可用于本发明的制造方法及本发明的制造装置的上述容器1优选由可在不对第1液体及第2液体造成影响的情况下进行收容的材料形成。
该容器的容积没有特别限制，容积大时，能大量地混合两种液体这样的本发明的优点变得显著。该容器的优选的容积没有特别限制，根据要求适当确定即可，例如，为了大量生产用于常规细胞培养的液体培养基，作为优选的容积，可例举100L～1000L左右。
上述容器1的材料没有特别限制，可举出例如硬质或软质的有机高分子材料(尤其是合成树脂材料等)、玻璃、金属等。硬质或软质的有机高分子材料可以是板状物，也可以是膜。前述的板状物、膜可以是由单一的材料形成的物品(单层品)，也可以是如后文所述那样地包含由相互不同的材料形成的层的多层结构(2层以上)。
另外，容器1的形状也没有特别限制，例如可以是立方体、长方体、圆柱体、具有由软质的有机高分子材料制的膜形成的壁面的袋状物(例如，将2片膜的外周缘部相互接合而成的袋状物、具有底面和侧面的袋状物、具有上面、底面和侧面的袋状物等)等。
容器1为由软质的有机高分子材料制的膜等形成的柔软的袋状物时，能得到如下所示的(a)～(c)的理想作用。
(a)在最初将第1液体或第2液体注入至容器1之前，可预先使该容器收缩而将内部的空气排出。容器1能随着液体的注入而发生膨胀，因此，注入的液体不会与空气接触。
(b)能一边使该容器收缩、一边将通过使第1液体和第2液体循环而将其进行了充分混合而得到的混合物(液态培养基组合物)以不与空气接触的方式从该容器1取出至外部容器。
(c)容器1为由软质的有机高分子材料制的膜等形成的柔软的袋状物时，能廉价地得到该容器，因此，可在每次混合后将该容器和管道丢弃，不仅能省去对该制造装置内进行洗涤的人力物力，而且容器和管道内的无菌性进一步提高。
作为前述这样的由软质的有机高分子材料制的膜形成的柔软的袋状物，可举出与现有已知的细胞培养用袋同样的袋。作为构成这样的细胞培养用的柔软的袋的壁部的膜的材料，可举出例如乙烯·乙酸乙烯酯共聚树脂(EVA树脂)、聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氨酯系树脂、聚酯系树脂、聚酰胺系树脂、氯乙烯系树脂等。膜为多层结构时，各层的材料根据功能适当选择即可。例如，为3层结构时，可例举(聚对苯二甲酸乙二醇酯层(内层)/聚乙烯层(中间层)/尼龙层(外层))这样的组合。
该壁部的膜的厚度没有特别限制，通常为50μm～150μm左右，优选为100μm左右。
作为前述的柔软的袋状物的整体的形态，可例举：将2片膜的外周缘部相互接合而成的袋状物、具有底面和侧面的袋状物、具有上面、底面和侧面的袋状物、具有各种形状(长方体、六棱柱(如图4所示)、多角柱、圆柱等)的袋状物。
作为前述的柔软的袋状物，可以转用市售的细胞培养用袋，也可使用前述膜制作本发明专用的容器。在上述任意情况下，只要在容器的壁面形成至少2个开口部，并用管道将这些开口部彼此连接从而构成封闭的循环路径，则均可得到本发明的制造装置。
如图1所例示的那样，在容器1的壁部设置至少2个开口部2、3。至少2个开口部中的一个开口部(图的例子中，为下侧的开口部2)是用于使液体A1、B1从容器1内排出至管道(循环用管道)4内的出口，另一个开口部(图的例子中，为上侧的开口部3)是用于使液体从循环用管道4内进入至容器1内的入口。
对于上述至少2个开口部中的任意一方或两方而言，通过将循环用管道拆下，从而可作为用于向容器内注入第1液体和第2液体的开口部使用，或者可作为用于将两种液体的混合物从容器内取出的开口部使用。
为了不使被用于液体的循环的前述2个开口部2、3对外界开放，优选用循环用管道4无菌地连接。另一方面，用于向容器内注入液体的管道(注入用管道)与过滤灭菌前的液体接触。因此，将其与过滤灭菌后的管道部分进行隔离，若与循环路径连接而使用，则可能污染其中收容的液体。
从以上的方面考虑，用于向容器内注入第1液体及/或第2液体的开口部优选作为与循环用的2个开口部不同的开口部而仅设置所需个数。例如，可以如图3所示那样，仅设置1个作为专用的出入口的开口部6，从该开口部6依次向容器内注入第1液体和第2液体，也可如图4所示那样，设置2个以上的开口部，向容器内同时注入第1液体和第2液体。此处所谓“作为出入口的开口部”，也表示用于从外部向容器内注入液体的入口用的开口部、及用于将混合后的液体(液态培养基组合物)排出至容器外的出口用的开口部。例如，可以预先设置入口用的开口部，将第1液体和第2液体从该入口用的开口部向容器内注入，将混合后的液体从用于循环的开口部取出。另外，例如，可以预先设置出口用的开口部，将第1液体和第2液体从用于循环的开口部向容器内注入，将混合后的液体从出口专用的开口部取出。另外，也可在容器上分别设置入口用的开口部和出口用的开口部。
为了维持这些制造装置内的无菌性，优选在注入用管道的中途插入过滤器，将经过滤的液体注入至容器内。例如，可以是下述结构：在图3所示的管道4c的中途装配筒式(cartridge)过滤器从而插入路径中。
另外，在将容器、管道、灭菌过滤器、接合器连接时，可能被外界气体污染，因此，优选在将容器、管道、灭菌过滤器、接合器全部接合而构成封闭的制造装置后，实施γ射线照射灭菌。
图2为表示被设置于容器上的开口的位置的其他例子的图。该图中，省略了用于将容器与管道连接的接合器、连接器(coupling)的图示。本发明中，将管道4连接于被设置于容器的壁部的开口部2、3，通过蠕动泵的作用，使第1液体和第2液体循环，将两种液体混合。因此，作为出口的开口部2与作为入口的开口部3相互尽可能远离时，能高效地将两种液体混合。若出口与入口接近，则仅这些开口部附近的液体局部地进行循环，容器内的剩余的液体不参与循环流而被落下的可能性增高。
图2(a)的方式中，作为出口的开口部2被设置于构成容器下面的壁部，作为入口的开口部3被设置于构成上面的壁部，它们通过管道4而被连接。由此，在容器内产生如箭头所示那样的、从上方向下方的液流，能高效地将第1液体和第2液体混合。
图2(b)的方式中，作为出口的开口部2被设置于前述容器的1个壁部，另一个开口部3被设置于与前述壁部相对的壁部，它们通过管道4而被连接。由此，如箭头所示那样，在容器内产生水平地从容器内穿过的液流，能不残留地将第1液体和第2液体混合。
图2(c)的方式中，作为出口的多个开口部(图的例子中，为2a、2b这2个)被设置于前述容器的1个壁部(图的例子中，为构成容器底面的壁部)，作为入口的多个开口部(图的例子中，为3a、3b这2个)被设置于与前述壁部相对的壁部(图的例子中，为构成容器上面的壁部)，它们成为多对入口和出口，各对开口部(2a、3a)、(2b、3b)分别通过管道4a、4b而被连接，该管道4a、4b分别被安装于蠕动泵5a、5b。由此，在容器内，如箭头所示那样，在容器内产生从上方向下方的大范围的平行液流，容器内的液体加入循环流的可能性增高，能高效地将第1液体和第2液体混合。需要说明的是，如图2(c)的方式那样连接有多条管道的情况下，可以使液体在一条管道内移动的方向(例如，图2(c)中为上升方向)与液体在另一条管道内移动的方向(例如，图2(c)中为下降方向)呈相反方向，有意地使容器内的液流产生紊乱。
使蠕动泵运转时，如图1、图2(a)～(c)所示那样，从一个开口部向另一个开口部的液流的方向可以为竖直方向(下降方向、上升方向)、水平方向、倾斜方向等，此外，也可以是产生漩涡的那样的方向、产生紊流的那样的方向。第1液体为含有脱酰基结冷胶的水溶液时，可观察到脱酰基结冷胶在培养液中上浮的倾向，因此，如图1、图2(a)、图2(c)、图4所示那样的液体从容器的上方向下方下降的液流是抵抗这样的上浮、能更有效地进行混合的优选的液流。
图1、图2(a)～(c)所示的开口部的配置、数目是一个例子，它们可以改变方向，进行适当地组合。例如，在图1的方式中，在容器的垂直的壁部设置有2个开口部2、3，但对于这2个开口部而言，也可以在容器的上面(或底面)的壁部设置2个，也可改变图1的容器的姿态来使用。另外，在图1的方式中，仅在容器的右侧的壁部设置有2个开口部2、3，但也可在与该壁部相对的左侧的壁部也设置一对开口部，各对开口部可以分别通过管道而被连接。另外，可以是被设置于容器上面的开口部、与被设置于容器侧面的开口部成对并通过管道而被连接。
图2(a)～(c)的方式也同样，可以适当变更容器的姿态来使用。
对于被设置于容器上的开口部而言，并非必须2个开口部作为出口和入口而成为1对，也可通过使管道分支，使1个开口部(例如，出口)与多个开口部(例如，入口)对应(未图示)。
开口部的口径没有特别限制，优选与连接的管道的口径为同等程度。此处所谓开口部的口径，在安装用于将管道连接于该开口部的接合器、连接器的情况下，是该接合器、连接器的流路的内径。为了保持容器内的无菌性，优选所有的开口部通过塞子、开闭阀、接合器、连接器、密封构件等被闭合，直至使用时为止。接合器、连接器优选具有在与各自的对应的接合器、连接器连接之前将流路封闭的结构，并且具有通过与对应的接合器、连接器连接从而使流路无菌地连通的结构。
另外，也可代替前述的接合器、连接器，使开口部与短管道结合，该管道的外界侧出口通过前述的接合器、连接器而被闭合。
管道具备可作为泵管被安装于后述的蠕动泵、并且具有可作为泵管发挥功能·进行运转的形状和柔软性的部分。
所谓的可作为泵管被安装于蠕动泵、并且具有可作为泵管发挥功能·进行运转的形状和柔软性，至少表示：具有适合于所使用的蠕动泵的管道的内径、外形、及长度；以及，具有被蠕动泵的促动器(辊等)挤压而被压扁的柔软性、从基于该促动器的挤压被释放时能恢复原形的弹性。
管道可以是所有部分均可成为泵管的管道，也可以是仅被安装于蠕动泵的部分可成为泵管的管道。
通过将作为泵管的部分安装于蠕动泵并使该蠕动泵运转，从而使前述第1液体和第2液体在前述管道内移动。由此，能使两种液体进行循环而将它们混合，可在容器内形成均匀分散有特定化合物介由连接物质结合而成的结构体的液态培养基组合物。
对于管道的形态而言，除了成为泵管的部分以外，没有特别限制，可以是金属管等，优选为不对第1液体和第2液体造成影响、可应用于细胞培养、柔软且廉价的树脂制的管道。管道整体可作为泵管利用的形态是一个优选例。
成为泵管的部分的材料优选为不对第1液体和第2液体造成影响、可应用于细胞培养并且具有弹性和柔软性的树脂材料、尤其是合成树脂材料，可举出苯乙烯系热塑性弹性体、硅系树脂、氟系树脂、聚氯乙烯系树脂等。
成为泵管的部分的内径、壁厚、长度与使用的蠕动泵相对应即可，内径为5mm～50mm左右，管道的壁厚为2mm～6mm左右。若举出一例，实施例中使用的管道的内径为13mm，壁厚为3mm(外径19mm)。
管道整体的长度根据要连接的开口部彼此之间的距离、容器的大小适当确定即可，可举出例如1500mm～3000mm左右。
循环用的管道可以是从被连接于容器的一个开口的部分至被连接于另一个开口的部分一体地连续的一条管道，也可以是通过接合器、连接器适当地连接而形成一条管道的管道。为了提高连接于蠕动泵时的处理性(安装性)，可以是在成为泵管的部分的两端部设置有接合器、连接器、可从管道整体拆装的结构。关于这样的接合器、连接器，优选使用被称为无菌接合器等的、可无菌地连接的接合器。
图3为表示该制造装置的其他结构例的图。该图的例子中，与图2(c)的例子同样，作为出口的2个开口部(2a、2b)被设置于容器1的底面的壁部，作为入口的2个开口部(3a、3b)被设置于容器的上面的壁部，它们成为2对入口和出口，各对开口部(2a、3a)、(2b、3b)分别通过管道4a、4b而被连接，该管道4a、4b分别被安装于蠕动泵5a、5b。而且，在容器1的壁面(图的例子中为上面)上，进一步设置出入口用的开口部6，成为液体可从外部容器7通过管道4c注入至容器1内的结构。
通过图3所例示的结构，可进行一边用蠕动泵使一种液体循环、一边向其中注入另一种液体的这样的步骤。尤其是，如图3所示那样，可进行下述这样的混合步骤：预先收容第2液体B1，一边使其循环，一边以规定的流量从外部容器7向容器1内注入第1液体A1。
需要说明的是，使液体从外部容器7向容器1移动时，可以将管道4c安装于蠕动泵，利用该蠕动泵的输送能力；也可将外部容器7配置于容器1的上方，利用重力使外部容器7内的液体在管道内移动，使其落下至容器1内。
图4为表示该制造装置的优选的结构例的图。
如图4(c)所示那样，容器1的整体的形状是呈六棱柱的柔软的袋。图的例子中，该呈六棱柱的柔软的袋本身利用了市售的细胞培养袋。图4(a)示出容器1的一个端面1a，图4(b)示出容器1的另一个端面1b。这两个端面1a、1b作为六棱柱的端面而呈现六边形，以这两个端面成为垂直面的方式保持容器的姿态。
如图4(a)所示那样，在端面1a的上部，设置有用于向容器1内流入第1液体的开口部6a、和用于向容器1内流入第2液体的开口部6b。开口部6c被封闭，可被用于混合液的取出等。另一方面，如图4(b)所示那样，在端面1b的下部和上部，分别设置有循环用的开口部2、3。图的例子中，在所有的开口部，设置有用于将作为管路的管道连接的接合器。
图4(c)为表示该制造装置整体的连接结构的框图。在容器1的端面1a，收容有第1液体的外部容器7a介由管路(管道)41与开口部6a连接，收容有第2液体的外部容器7b介由管道42与开口部6b连接。这些外部容器7a、7b可作为该制造装置的要素被包含，也可视为外部的液体供给源。
连接于开口部6a的管道、与连接于外部容器7a的管道通过无菌接合器C1被连接成1个管道41。同样地，连接于开口部6b的管道、与连接于外部容器7b的管道通过无菌接合器C2被连接成1个管道42。另一方面，在容器1的端面1b，管道43与开口部2连接，该管道43通过无菌接合器C3与泵管44连接，该泵管44被安装于辊泵5并且从辊泵5穿过，通过无菌接合器C4与管道45连接，该管道45与开口部3连接。
图4(c)的例子中，首先，对于已抽出空气而处于收缩状态的容器1，向容器1中注入在外部容器7b中收容的第2液体。容器1与注入的第2液体的量对应地鼓起。接下来，使辊泵5运转，一边使第2液体循环，一边将在外部容器7a中收容的第1液体注入至容器1中，通过随后的循环来进行混合。辊泵5以液体从开口部2流向开口部3的方式使对泵管44的压缩点移动。由此，容器1内的液体以从上方向下方的方式移动。
对于可用于本发明的蠕动泵而言，如作为代表的管道泵(也被称为辊泵)那样，是具有通过使将具有弹性及柔软性的泵管压扁的位置沿输送方向移动从而使该管路内的液体移动的作用的泵。
图5是概略地示出蠕动泵的结构的一例的图。该图的例子中，在外壳11上设置有圆弧状、半圆状的外周壁面11a，泵管4沿该外周壁面11a被弯曲地安装。该外周壁面11a在外周侧支撑泵管4。在该泵管4的弯曲的内周侧，被臂12支撑的辊13以旋转轴14为中心，沿液体输送方向(箭头f的方向)旋转，由此，如同蠕动运动那样，泵管4沿液体输送方向被依次压缩，从而输送泵管内的液体。所谓将管道安装于蠕动泵，表示：如图5所例示的那样，为了使管道4作为蠕动泵的泵管发挥功能，将管道4插通设置于蠕动泵的输送驱动部分(对管道进行依次压缩的部分)。
在图5的例子中，在直线状的臂12的两端设置了2个辊13，但根据蠕动泵不同，还包括设置了更多数量的辊的情况、不具有臂的1个大的辊以偏心轴为中心进行旋转的情况等。蠕动泵可以是如图5那样路径弯曲的结构的蠕动泵，也可以是以直线排列的多个促动器局部地依次压缩泵管、从而向该泵管施加蠕动运动的结构的蠕动泵。作为蠕动泵的详细输送结构，可参考现有技术。
对于市售的蠕动泵的输送能力(在管道内移动的液体的每分钟的流量)而言，为从微小流量至大流量的宽范围，可例举0.01(mL/分钟)～10(L/分钟)左右。本发明中可利用的蠕动泵的输送能力没有特别限制，可根据容器的容积确定，容器的容积为20L～100L左右时，作为蠕动泵的输送能力的优选范围，可例举3～18(L/分钟)左右。
为了增大用于将第1、第2液体混合的这些液体的循环流量，可使用较大内径的泵管、和具有较大输送能力的蠕动泵，也可使用以平行方式排列的必要的套组数的具有小的输送能力的管道和蠕动泵的套组，使液体平行地循环。
相对于容器的容积而言基于蠕动泵的液体的流量过小时，混合需要长时间，另外，有时局部地产生混合不充分的状态。
蠕动泵的运转时间(即，使循环持续而进行混合的时间)根据蠕动泵的输送量、并且基于混合状态适当确定即可。若举出一例，容器的容积为50L～150L左右、蠕动泵的输送能力为10(L/分钟)左右时，作为优选的运转时间，可例举2～4小时左右。
蠕动泵可以是构成本发明的制造装置的一部分的部件，也可以是本发明的装置所应利用的外部装置。
利用蠕动泵使第1液体和第2液体循环而进行混合时，若预先将第1液体和第2液体中的任一种液体装入容器中，一边用蠕动泵使该一种液体循环，一边将另一种液体注入至容器内，则两者可通过随后的循环而良好地混合。
第1液体为含有该脱酰基结冷胶的水溶液、第2液体为含有作为2价金属阳离子的连接物质的液体(例如，含有钙离子及/或镁离子的液体培养基)这样的情况下，优选一边用蠕动泵使一种液体循环、一边将另一种液体注入至容器内这样的步骤，与预先以规定的比例将两种液体注入至容器内后开始循环的情况相比，能得到脱酰基结冷胶不易集中于培养液的局部这样的效果。尤其是，先将第2液体(前述液体培养基)收容在容器中，一边用蠕动泵使其循环，一边将第1液体(含有该脱酰基结冷胶的水溶液)注入至容器内的情况下，能观察到脱酰基结冷胶更良好地进行分散的倾向。
若举出混合时的一例，容器的容积为50L～150L左右、第1液体与第2液体的体积比率为1：1、蠕动泵的输送能力为10(L/分钟)左右时，优选先将一种液体收容在容器1中，一边运转蠕动泵而使液体循环，一边在0.5小时～1.0小时左右之间将全部量的另一种液体注入至容器1中，然后进一步继续进行2.0小时～4.0小时左右的混合液循环。
需要说明的是，一边用蠕动泵使一种液体循环、一边将另一种液体注入至容器内的这样的步骤中，如图3中示出的该制造装置的结构例那样，优选除了用于使液体循环的2个开口部之外，还另行设置后续用于向容器内注入液体的开口部6。该开口部6可以是出入口用的开口部。
对于蠕动泵而言，可以通过手动来进行运转和停止的控制，也可以在该制造装置中设置控制装置，通过该控制装置，以蠕动泵仅自动地运转预先规定的时间的方式来进行控制。
〔第1液体〕
第1液体含有能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体的、具有阴离子性的官能团的高分子化合物作为特定化合物。
作为阴离子性的官能团，可举出羧基、磺基、磷酸基及它们的盐，优选羧基或其盐。本发明中可使用的高分子化合物可以包含选自前述阴离子性的官能团的组中的1种或2种以上。
作为本发明中可使用的高分子化合物的优选的具体例，没有特别限制，可举出由10个以上的单糖类(例如，三碳糖、四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等)聚合而成的多糖类，更优选可举出具有阴离子性的官能团的酸性多糖类。此处所谓酸性多糖类，没有特别限制，只要在其结构中具有阴离子性的官能团即可，例如为具有糖醛酸(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖类、在结构中的一部分具有硫酸基或磷酸基的多糖类、或具有这两方的结构的多糖类，不仅包含天然来源的多糖类，还包含由微生物产生的多糖类、以基因工程方式产生的多糖类、或使用酶人工合成的多糖类。更具体而言，可例举由选自由透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶(下文中，有时也称为DAG)、鼠李聚糖胶(rhamsangum)、迪特胶(diutan gum)、黄原胶、角叉菜胶、汉生胶、己糖醛酸、岩藻多糖、果胶、果胶酸(pectin acid)、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸类肝素(heparitin sulfate)、硫酸角质(keratosulfate)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖及它们的盐组成的组中的1种或2种以上构成的多糖类。多糖类优选为透明质酸、DAG、迪特胶、黄原胶、角叉菜胶或它们的盐，更优选为DAG或其盐。关于DAG，也可使用经磷酸化的DAG。该磷酸化可利用已知的方法进行。
此处所谓盐，可举出例如锂、钠、钾之类的碱金属的盐、钙、钡、镁之类的碱土金属的盐或铝、锌、铜、铁、铵、有机碱及氨基酸等的盐。
这些高分子化合物(多糖类等)的重均分子量优选为10,000～50,000,000，更优选为100,000～20,000,000，进一步优选为1,000,000～10,000,000。例如，该分子量可利用基于凝胶渗透色谱法(GPC)的普鲁兰多糖换算来测定。
本发明中，可将上述具有阴离子性的官能团的多糖类组合多种(优选2种)而使用。也可以将具有阴离子性的官能团的多糖类与不具有阴离子性的官能团的多糖类组合。多糖类的组合的种类没有特别限制，能够通过介由2价金属阳离子结合从而在液体培养基中形成上述的结构体即可，优选该组合至少包含DAG或其盐。即，优选的多糖类的组合包含DAG或其盐、及DAG或其盐以外的多糖类(例如黄原胶、海藻酸、角叉菜胶、迪特胶、甲基纤维素、刺槐豆胶或它们的盐)。作为具体的多糖类的组合，可举出DAG和鼠李聚糖胶、DAG和迪特胶、DAG和黄原胶、DAG和角叉菜胶、DAG和汉生胶、DAG和刺槐豆胶、DAG和κ-角叉菜胶、DAG和海藻酸钠、DAG和甲基纤维素等，但不限于这些。
所谓脱酰基结冷胶，是以1-3连接的葡萄糖、1-4连接的葡萄糖醛酸、1-4连接的葡萄糖及1-4连接的鼠李糖这4分子的糖为结构单元的直链状的高分子多糖类，是R1、R2均为氢原子、n为2以上的整数的以下通式(I)表示的多糖类。其中，R1可包含甘油基，R2可包含乙酰基，乙酰基及甘油基的含量优选为10％以下，更优选为1％以下。
[化学式1]
特定化合物可以是利用化学合成法得到的化合物，但该特定化合物为天然物时，也可以是通过利用常用技术从含有该化合物的各种植物、各种动物、各种微生物中萃取及分离纯化而得到的化合物。例如，结冷胶可通过以下方式来制造：在发酵培养基中培养生产微生物，利用通常的纯化方法将在菌体外生产的粘膜物回收，进行干燥、粉碎等工序后，制成粉末状。另外，在脱酰基结冷胶的情况下，在将粘膜物回收时，实施碱处理，将键合于1-3连接的葡萄糖残基的甘油基和乙酰基进行脱酰基化后回收即可。作为结冷胶的生产微生物的例子，可举出少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)及对该微生物的基因进行修饰而得的微生物，但不限于此。
脱酰基结冷胶的情况下，可使用市售的脱酰基结冷胶，例如三晶株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)CG-LA”、三荣源F.F.I株式会社制“KELCOGEL(CPKelco公司的注册商标)”等。另外，作为天然型结冷胶，可使用三荣源F.F.I株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)HT”等。
第1液体通常为特定化合物的溶液。用于该溶液的溶剂没有特别限制，只要是能将特定化合物溶解的溶剂即可，通常为水或亲水性溶剂，优选为水。即，在优选的方式中，第1液体为特定化合物的水溶液。
第1液体中含有的特定化合物的浓度没有特别限制，只要能达到以下效果即可：在与第2液体混合时，在混合液中，特定化合物通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体，并且，该结构体在混合液中均匀分散，进而，最终得到的液态培养基组合物通过包含该结构体从而能对细胞或组织进行悬浮培养。由下文中详细说明的、能对细胞或组织进行悬浮培养的培养基组合物中的特定化合物的浓度、和第1液体的体积相对于最终产物中得到的培养基组合物的体积的比率，能算出第1液体中的特定化合物的浓度。例如，将体积V1的第1液体、与体积V2的第2液体混合，最终得到体积V1+V2的液态培养基组合物的情况下，为了使该液态培养基组合物中的特定化合物的浓度为C％(w/v)，使第1液体中的特定化合物的浓度为C×(V1+V2)/V1％(w/v)即可。
第1液体中的2价金属阳离子浓度需要低于第1液体中的特定化合物形成结构体的浓度。作为2价金属阳离子，可举出钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铁离子、铜离子等。尤其是，钙离子及镁离子中的一方或两方(下文中，也记载为“钙离子及/或镁离子”)有助于DAG等特定化合物的结构体形成。
第1液体中可包含除特定化合物、溶剂以外的因子。作为该因子，可举出生理上被允许的缓冲剂、盐、等渗剂，但不限于这些。
第1液体的制备可通过以下方式进行：将特定化合物添加至上述溶剂(例如水)中，于该特定化合物能溶解的温度(例如60℃以上、80℃以上、90℃以上)进行搅拌，将该特定化合物溶解，直至成为透明的状态。使用进行了脱2价金属阳离子处理的DAG时，由于不需要进行加热而溶解于水中，因而溶解操作容易进行。必要时，对得到的特定化合物的溶液进行脱2价金属阳离子处理，使溶液中的2价金属阳离子浓度低于结构体形成浓度。根据需要，可以在溶剂中预先添加特定化合物以外的因子，也可以在得到的特定化合物的溶液中添加特定化合物以外的因子。第1液体优选进行了灭菌处理。作为灭菌处理的方法，可举出高压釜、过滤灭菌等，但不限于这些。
〔第2液体〕
第2液体含有2价金属阳离子作为连接物质。作为2价金属阳离子，可举出钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铁离子、铜离子等。2价金属阳离子的种类没有特别限制，只要第1液体中包含的特定化合物能够通过介由该2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体即可，优选为钙离子。
第2液体通常为连接物质(即，2价金属阳离子)的溶液。用于该溶液的溶剂没有特别限制，只要是能将特定化合物溶解的溶剂即可，通常为水或亲水性溶剂，优选为水。即，在优选的方式中，第2液体为连接物质(即，2价金属阳离子)的水溶液。
第2液体中包含下述量的2价金属阳离子：将第1液体和第2液体混合，最终得到的液态培养基组合物中的2价金属阳离子浓度足以使第1液体中的特定化合物形成结构体。
第2液体中的2价金属阳离子浓度可由最终得到的液态培养基组合物中的2价金属阳离子浓度、和第1液体与第2液体的混合比率计算。
第2液体中，可以包含除连接物质(即，2价金属阳离子)、溶剂以外的因子。作为该因子，可举出适于培养拟培养的细胞的培养基构成成分。作为该培养基构成成分，可举出缓冲剂(碳酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、HEPES等)、无机盐(NaCl等)、各种氨基酸、各种维生素(胆碱、叶酸等)、糖类(葡萄糖等)、抗氧化剂(一硫代甘油等)、丙酮酸、脂肪酸、血清、抗生素、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、各种细胞因子、各种激素、各种生长因子、各种胞外基质等，但不限于这些。第2液体优选进行了灭菌处理。作为灭菌处理的方法，可举出高压釜、过滤灭菌等，但不限于这些。
优选的方式中，第2液体为含有结构体形成浓度的2价金属阳离子(优选钙离子及/或镁离子)的液体培养基的浓缩液。第2液体除了含有2价金属阳离子(优选钙离子及/或镁离子)及水之外，还含有适于培养拟培养的细胞的培养基构成成分。通常使用的细胞培养用液体培养基中的钙离子浓度的范围为0.1～2.0mM左右，镁离子浓度为0.1～1.0mM左右，因此，对于基于DAG等特定化合物的结构体形成而言是充分的。对于第2液体中的2价金属阳离子(优选钙离子及/或镁离子)的浓度而言，可以考虑到与第1液体的混合比而以最终得到的液态培养基组合物中的2价金属阳离子浓度成为结构体形成浓度的方式调节。对于其他连接物质而言也同样。另外，对于第2液体中的适于培养拟培养的细胞的培养基构成成分的浓度而言，可以考虑到与第1液体的混合比而以最终得到的液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度成为适于培养拟培养的细胞的浓度范围内的方式调节。例如，将体积V1的第1液体、与体积V2的第2液体混合，最终得到体积V1+V2的液态培养基组合物的情况下，为了使该液态培养基组合物中的2价金属阳离子的浓度为Ci，使第2液体中的2价金属阳离子的浓度为Ci×(V1+V2)/V2即可。对于其他连接物质而言也同样。同样地，将体积V1的第1液体、与体积V2的第2液体混合，最终得到体积V1+V2的液态培养基组合物的情况下，为了使该液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度为Cm，使第2液体中的培养基构成成分的浓度为Cm×(V1+V2)/V2即可。
本方式中，通过利用本发明的制造方法将第1液体和第2液体混合，能立即得到包含第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的连接物质结合而成的结构体的目标液态培养基组合物。
当然，第2液体中也可以不包含上述的细胞培养用培养基构成成分的一部分或全部。这种情况下，本发明的制造方法中，可以将第1液体和第2液体混合，得到包含第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的连接物质结合而成的结构体的混合液，通过向该混合液中添加上述细胞培养用液体培养基构成成分的一部分或全部，从而得到目标液态培养基组合物。
关于第1液体与第2液体的体积混合比率，相对于第1液体的体积100而言，第2液体的体积为50～200，优选为100。
优选的方式中，利用本发明的制造方法制造的液态培养基组合物中含有的特定化合物的90摩尔％以上(优选95摩尔％以上、更优选99％以上、最优选100％)来自第1液体，该培养基组合物中含有的2价金属阳离子的90摩尔％以上(优选95摩尔％以上、更优选99％以上、最优选100％)来自第2液体。
〔液态培养基组合物〕
可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物含有第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的连接物质(即，2价金属阳离子)结合而成的结构体，并且，该结构体被均匀分散于该培养基组合物中，因此，使用该培养基组合物时，能在维持悬浮状态的状态下培养细胞、组织。
作为培养对象的细胞、组织的来源生物的种类没有特别限制，不仅包括动物(昆虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、泛甲壳类、六足类、哺乳类等)，还包括植物。
一个方式中，作为培养对象的细胞为支持物依赖性的细胞。若使用可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物，则可在不使用作为支持物的载体的情况下，在维持悬浮状态的状态下培养支持物依赖性的细胞。
本发明中，所谓细胞及/或组织的悬浮，是指处于相对于培养容器而言细胞及/或组织可以接触底面但不附着于底面的状态(非粘附)。此外，本发明中，在使细胞及/或组织增殖、分化或维持时，将不伴有针对液体的培养基组合物的来自外部的压力、振动或该组合物中的振荡、旋转操作等，细胞及/或组织在该液态培养基组合物中均匀分散并且处于悬浮状态的状态称为“悬浮静置”，将在该状态下培养细胞及/或组织称为“悬浮静置培养”。另外，作为“悬浮静置”中能进行悬浮的时间，包括5分钟以上、1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上等，但不限于这些时间，只要保持悬浮状态即可。
对于可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物而言，能够在能维持、培养细胞、组织的温度范围(例如，0～40℃)的至少1个温度点，进行细胞及/或组织的悬浮静置。可通过本发明得到的液态培养基组合物优选能够在25～37℃的温度范围的至少1个温度点(最优选37℃)进行细胞及/或组织的悬浮静置。
是否能悬浮静置例如可通过以下方式来评价：以2×104个细胞/mL的浓度将作为培养对象的细胞均匀分散于作为评价对象的培养基组合物中，向15mL锥形管中注入10mL，在4℃左右的低温下静置至少5分钟以上(例如1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上)，观察是否能维持该细胞的悬浮状态。对于悬浮状态的评价而言，例如，全部细胞中的70％以上为悬浮状态时，可作出维持了悬浮状态的结论。也可用聚苯乙烯珠(尺寸为500-600μm，Polysciences Inc.制)代替细胞来进行评价。
优选的方式中，对于可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物而言，未由于包含上述结构体而导致其粘度实质提高。所谓“未实质提高液体的粘度”，是指液体的粘度不高于8mPa·s。此时的该液体的粘度(即，可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物的粘度)在37℃时为8mPa·s以下，优选为4mPa·s以下，更优选为2mPa·s以下。包含结构体的液体的粘度可在37℃条件下、使用E型粘度计(东机产业株式会社制，TV-22型粘度计，机型：TVE-22L，锥形转子：标准转子1°34’×R24，转速100rpm)进行测定。
可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物中的特定化合物的浓度取决于特定化合物的种类，可在特定化合物能在液态培养基组合物中形成上述的结构体从而(优选在不实质提高该液体培养基的粘度的情况下)使细胞及/或组织均匀悬浮(优选使其悬浮静置)的范围内适当设定。例如，在DAG的情况下，为0.001％～1.0％(w/v)，优选为0.003％～0.5％(w/v)，更优选为0.005％～0.3％(w/v)，进一步优选为0.01％～0.05％(w/v)，最优选为0.01％～0.03％(w/v)。在黄原胶的情况下，为0.001％～5.0％(w/v)，优选为0.01％～1.0％(w/v)，更优选为0.05％～0.5％(w/v)，最优选为0.1％～0.2％(w/v)。在κ-角叉菜胶及刺槐豆胶混合体系的情况下，以两种化合物的总和计，为0.001％～5.0％(w/v)，优选为0.005％～1.0％(w/v)，更优选为0.01％～0.1％(w/v)，最优选为0.03％～0.05％(w/v)。在天然型结冷胶的情况下，为0.05％～1.0％(w/v)，优选为0.05％～0.1％(w/v)。
组合使用多种(优选2种)上述多糖类作为特定化合物的情况下，该多糖类的浓度可在该多糖类的组合能在液态培养基组合物中形成上述的结构体从而(优选在不实质提高该液体培养基的粘度的情况下)使细胞及/或组织均匀悬浮(优选悬浮静置)的范围内适当设定。例如，使用DAG或其盐、与DAG或其盐以外的多糖类的组合的情况下，作为DAG或其盐的浓度，可例举0.005～0.02％(w/v)、优选0.01～0.02％(w/v)，作为DAG或其盐以外的多糖类的浓度，可例举0.0001～0.4％(w/v)、优选0.005～0.4％(w/v)、更优选0.1～0.4％(w/v)。作为具体的浓度范围的组合，可举出以下组合。
DAG或其盐：0.005～0.02％(优选0.01～0.02％)(w/v)
DAG以外的多糖类
黄原胶：0.1～0.4％(w/v)
海藻酸钠：0.0001～0.4％(w/v)(优选为0.1～0.4％(w/v))
天然结冷胶：0.0001～0.4％(w/v)
刺槐豆胶：0.1～0.4％(w/v)
甲基纤维素：0.1～0.4％(w/v)(优选0.2～0.4％(w/v))
角叉菜胶：0.05～0.1％(w/v)
迪特胶：0.05～0.1％(w/v)
需要说明的是，该浓度可利用下式计算。
浓度[％(w/v)]＝特定化合物的重量(g)/培养基组合物的体积(mL)×100
优选的方式中，使用DAG或其盐作为特定化合物，使用钙离子作为连接物质。第1液体为DAG或其盐的水溶液。第2液体为含有钙离子的液体培养基的浓缩液。对于第1液体与第2液体的体积混合比而言，如上所述，相对于第1液体的体积(V1)100而言，第2液体的体积(V2)为50～200，优选为100。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的DAG浓度优选为0.01％～0.05％(w/v)，最优选为0.01％～0.03％(w/v)。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的钙离子浓度为DAG形成结构体的浓度，通常为0.1～2.0mM左右。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度在适于培养拟培养的细胞(例如哺乳动物细胞)的浓度范围内。
第1液体中的DAG浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的DAG浓度乘以(V1+V2)/V1(即，150/100～300/100，优选为200/100)而得到的浓度。
第2液体中的钙离子浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的钙离子浓度乘以(V1+V2)/V2(即，150/50～300/200，优选为200/100)而得到的浓度。
第2液体中的培养基构成成分的浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度乘以(V1+V2)/V2(即，150/50～300/200，优选为200/100)而得到的浓度。
DAG介由钙离子结合而成的结构体均匀地分散而被包含在该液态培养基组合物中，由此，能在粘度不实质提高的情况下，使细胞及/或组织均匀悬浮(优选使其悬浮静置)。
若使用通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物，则能够在不伴有存在引起细胞、组织的受损、功能丧失的风险的操作(振荡、旋转等)的情况下，以悬浮状态培养细胞及/或组织。此外，若使用该培养基组合物，则在培养时，不仅能容易地更换培养基，而且还能容易地回收所培养的细胞及/或组织。若使用该培养基组合物，则能以悬浮状态培养以往需要在培养板上以单层进行培养、在粘附于细胞容器的状态下进行培养的细胞，因此，能在不损害其功能的情况下高效地大量制备粘附性的细胞。
第1液体与第2液体的混合液可以是作为制造目标的培养基组合物，也可以通过向该混合液中进一步加入添加物从而形成作为制造目标的培养基组合物。
实施例
通过使用本发明的制造装置来实施本发明的制造方法，从而将第1、第2液体混合，对得到的培养基组合物的混合状态(通过2种液体的混合而形成的结构体的分散状态)进行评价。
〔制造装置的各部分的说明〕
使用图4所示的容器(柔软的袋)1和各管道41～45、及作为蠕动泵的辊泵5，将第1、第2液体混合，制造液态培养基组合物。
第1液体是含有脱酰基结冷胶的水溶液(浓度：0.040％)，第2液体是含有钙离子的液体培养基(钙离子浓度：3.29mM)。
容器1是使用聚乙烯制的柔软的膜作为壁部的原材料的袋状物(袋)，容积为100L。
辊泵为古江Science(株)制的RP-KGI。被安装于辊泵的循环用管道的内径为13mm，外径为19mm。辊泵的输送量为约10L/分钟。基于辊泵5的液体的输送方向为液体从开口部2排出后经由辊泵5流向开口部3这样的方向。
〔液态培养基组合物的制造〕
对于已抽出空气而处于收缩状态的容器1，向容器1中注入在外部容器7b中收容的第2液体50L。接下来，使辊泵5运转，一边使第2液体循环，一边经0.5小时将在外部容器7a中收容的第1液体50L注入至容器1中。另外，在第1液体50L的注入完成的时间点之后，进一步持续进行3小时循环而完成混合，得到液态培养基组合物。
〔混合状态的评价〕
实施如下所示的性能评价试验方法(为了本发明而新规定的试验方法)，评价上文中得到的液态培养基组合物是否为经良好地混合的组合物、即通过第1及第2液体的混合而形成的结构体(第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的2价金属阳离子发生聚集而形成的结构体)是否成为在液态培养基组合物中良好地分散而悬浮的状态。
〔性能评价试验方法〕
(1)从充分确保结构体的形成时间方面考虑，在完成了培养基组合物的混合的时间点起的48小时后开始试验。
(2)将聚苯乙烯制的珠(直径600μm，Polysciences公司制)10mg装入容积为15mL的已灭菌的锥形管中，进一步向该锥形管内注入10mL待评价的培养基组合物，进行倒转混合。
(3)倒转混合结束后，立即通过目视确认了在直至锥形管内的培养基组合物的液面为止的范围内珠均匀分散。
(4)使锥形管成为直立状态，从防止培养基成分劣化方面考虑，使温度成为4℃，将前述(3)的状态的试样静置12小时以上，然后，通过目视来判断珠的分散状态(保持着分散状态、或者是存在沉降的倾向)。若结构体成为在培养基组合物中良好地分散而悬浮的状态，则如图6(a)示意性地示出的那样，受到该结构体的分散性的悬浮的影响，珠也成为在培养基组合物中分散而悬浮的状态。另一方面，在未良好混合、结构体在培养基组合物中成为较大的聚集体而悬浮的情况下，培养基组合物中的剩余的无结构体的部分也变大，因此，如图6(b)示意性地示出的那样，不受结构体的悬浮的影响而发生沉降的珠也增多。如上所述，若在培养基组合物混合珠，则能通过该珠来确认不易由目视确认的结构体的分散情形。
(5)珠的分散状态的判定基准
合格：珠在直至培养基组合物的液面为止的范围内均匀分散。本实施例中，作为向15mL的锥形管中注入10mL的培养基组合物的情况下的判定基准，如图6(a)示意性地示出的那样，珠在9mL的线以上分散，在管的底部完全未观察到因珠的沉降而导致的聚集。
不合格：珠未在直至培养基组合物的液面为止的范围内均匀分散。本实施例中，与前述的合格基准相反地，在向15mL的锥形管中注入10mL的培养基组合物的情况下，如图6(b)示意性地示出的那样，在9mL的线以上没有珠，在管的底部(尤其是，1.5mL线的下部)观察到因珠的沉降而导致的聚集。
〔评价结果〕
针对上文中得到的培养基组合物实施上述性能评价试验方法的结果显示，珠的分散状态为合格，可知本发明的制造方法及制造装置是能将第1及第2液体良好地混合的优异的方法及装置。
产业上的可利用性
通过本发明的制造方法及制造装置，能无菌且简单并且良好地将包含2价金属阳离子等连接物质的任意液体、与包含特定化合物的液体混合，能廉价且大量地得到分散有微细的结构体的液态培养基组合物。
本申请以在日本提出申请的日本特愿2016-144929(申请日：2016年7月22日)为基础，本说明书中包含其全部内容。
附图标记说明
1 容器
2、3 开口部
4 管道
5 蠕动泵

Claims (15)

1.液态培养基组合物的制造方法，所述方法中，将含有下述特定化合物(i)的第1液体、和含有下述连接物质(ii)的第2液体混合，从而制造液态培养基组合物，其特征在于，
使用在壁部设置有至少2个开口部的容器，其中，所述至少2个开口部通过容器外的管道被相互连接，所述管道具备具有可作为泵管被安装于蠕动泵的形状和柔软性的部分，
将所述管道安装于所述蠕动泵，使所述蠕动泵运转，使所述第1液体和第2液体在所述管道与所述容器之间循环而进行混合，从而在容器内形成分散有所述特定化合物介由所述连接物质结合而成的结构体的液态培养基组合物，
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体，
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
2.如权利要求1所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，所述特定化合物(i)为脱酰基结冷胶，第1液体为含有所述脱酰基结冷胶的水溶液，
所述连接物质(ii)为钙离子及镁离子中的一方或两方，第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基的浓缩液。
3.如权利要求2所述的培养基组合物的制造方法，其中，所述液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.001％(w/v)～1.0％(w/v)。
4.如权利要求1～3中任一项所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，第1液体与第2液体的体积混合比率为：相对于第1液体的体积100而言，第2液体的体积为50～200。
5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述开口部中的一个开口部被设置于构成所述容器的底面的壁部或构成侧面的壁部的底部作为出口，
所述开口部中的另一个开口部被设置于构成所述容器的上面的壁部或构成侧面的壁部的上部作为入口，
使所述蠕动泵运转，针对第1液体和第2液体而使这些液体在管道内沿从所述出口向所述入口的方向移动，由此，使容器内的第1液体和第2液体沿从上方向下方的方向移动。
6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，所述2个开口部作为出口和入口而成为1对，在所述容器上设置有多对所述2个开口部，各对中的2个开口部分别通过管道连接，
所述第2工序中，将各管道安装于分别独立的蠕动泵，使所述蠕动泵运转，使所述第1液体和第2液体从各管道通过而进行循环。
7.如权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，所述容器由柔软的材料形成、以使得所述容器的容积能根据被收容在所述容器内部的液体的体积而改变，由此，能在确保所述容器内的密闭性的同时，向所述容器内注入液体并且向所述容器外排出液体。
8.如权利要求1～7中任一项所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，在所述容器上设置有用于进行液体向所述容器内的进入和从所述容器内的排出的出入口用的开口部，
预先将第1液体及第2液体中的任一种液体装入所述容器中，一边用所述蠕动泵使所述液体循环，一边从所述出入口用的开口部向容器内注入另一种液体。
9.制造装置，其用于实施权利要求1所述的液态培养基组合物的制造方法，
所述制造装置具有用于收容在所述制造方法中混合的第1液体和第2液体的容器，
在所述容器的壁部设置有至少2个开口部，这些开口部通过容器外的管道被相互连接，
所述管道具备下述部分，所述部分具有可作为泵管安装于以输送所述管道内的液体的方式构成的蠕动泵并且可在所述蠕动泵中作为泵管运转的形状和柔软性。
10.如权利要求9所述的制造装置，其中，
所述开口部中的一个开口部被设置于构成所述容器的底面的壁部或构成侧面的壁部的底部，
所述开口部中的另一个开口部被设置于构成所述容器的上面的壁部或构成侧面的壁部的上部。
11.如权利要求9或10所述的制造装置，其中，所述2个开口部作为出口和入口而成为1对，在所述容器上设置有多对所述2个开口部，各对中的2个开口部分别通过管道连接。
12.如权利要求9～11中任一项所述的制造装置，所述制造装置还具有所述蠕动泵作为所述制造装置的构成要素，所述蠕动泵是安装所述管道并使所述管道作为泵管运转的蠕动泵。
13.如权利要求12所述的制造装置，其中，所述开口部中的一个开口部被设置于构成所述容器的底面的壁部或构成侧面的壁部的底部，
所述开口部中的另一个开口部被设置于构成所述容器的上面的壁部或构成侧面的壁部的上部，
所述制造装置构成为所述蠕动泵以使所述管道内的液体从下侧的开口部向上侧的开口部移动的方式运转，由此使得被收容在容器内的液体从上方向下方移动。
14.如权利要求9～13中任一项所述的制造装置，其中，所述容器由柔软的材料形成、以使得所述容器的容积能根据被收容在所述容器内部的液体的体积而改变，由此，能在确保所述容器内的密闭性的同时，向所述容器内注入液体并且向所述容器外排出液体。
15.如权利要求9～14中任一项所述的制造装置，其中，在所述容器上还设置有用于进行液体向所述容器内的进入和从所述容器内的排出的出入口用的开口部。
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