TW201923071A - 成為米色及白色脂肪細胞之分化誘導及生產方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種單胞性脂肪細胞之製造方法，其包含：將具有分化為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有經由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、具陰離子性官能基之高分子化合物之可懸浮培養細胞或組織的液狀培養基組成物中，進行懸浮培養，並且誘導其分化為單胞性脂肪細胞，其中，該高分子化合物，可為多醣類、較佳為含有葡萄糖醛酸部位之多醣類、更佳為去醯化結蘭膠、迪特膠(diutan gum)、三仙膠或該多醣類之鹽。

Description

成為米色及白色脂肪細胞之分化誘導及生產方法
本發明係關於一種由間葉系細胞誘導成為白色脂肪細胞及米色脂肪細胞之分化的方法。
近年來，於生命科學領域，培養iPS細胞或ES細胞等多能性幹細胞或間葉系幹細胞等，以進行成為目的之臟器細胞的分化誘導，而移植所得細胞的研究正盛行中。而也研究著脂肪細胞的移植。脂肪細胞的移植，例如，被探討著乳癌治療後之乳房再形成或用於美容之除皺等多種應用。又，最近對於基因突變患者，也開始探討將可產生正常基因產物之基因載體導入前驅脂肪細胞，作為基因治療的移植方法。以此為背景，脂肪細胞的移植，與iPS細胞或ES細胞等多能性幹細胞相比，具有脂肪細胞本身由於增殖能力低而不易癌化、且用以移植至皮下等之移植手術容易等優點。因此，推測脂肪細胞之移植的難度與其他細胞治療相比為低。
另一方面，脂肪細胞不僅含有多量之三酸甘油脂等脂質，亦具有作為對於生物體為重要之內分泌臟器的功能，而受到注目。例如，作為脂肪細胞所分泌的因子，可舉例如抑制食欲的瘦素或具有抗糖尿病作用之脂聯素、或者支配炎症的TNF-alpha等。因此，脂肪細胞多使用於對於 代謝症候群的研究、對於糖尿病或脂質等之新藥開發研究、健康食品的開發等。最近，不僅囤積脂質的白色脂肪細胞，藉由脂肪細胞本身產生熱而有效率地將體內過剩營養轉變為熱之米色脂肪細胞的研究也受到注目。米色脂肪細胞，可考量為來自白色脂肪細胞的變化、或來自前驅脂肪細胞的分化而存在於生物體內者。該米色脂肪細胞的研究，最近特別受到矚目，促進成為米色脂肪細胞之分化誘導之醫藥或健康食品的研究正盛行中。又，並探討藉由工業生產該米色脂肪細胞而使用於移植治療，嘗試治療糖尿病或肥胖等代謝性疾病。
如此之中，目前為止實驗中所使用的脂肪細胞，係將人類前驅脂肪細胞或3T3-L1細胞於培養皿或盤中單層地培養，將培養基更換為分化誘導培養基進一步地培養，藉此使其分化成類脂肪細胞的方法來製作。以此方法所分化的細胞，係接著於培養皿或盤的狀態，顯示紡錘體的形狀。且顯示多數之小脂肪滴蓄積於細胞內的多胞性形狀。另一方面，由生物體所分離之脂肪細胞係呈球狀，於一個細胞內含有一個大脂肪滴的單胞性，並且具有懸浮於培養基中的性質。因此，於生物體外所分化之脂肪細胞與來自生物體的脂肪細胞很明顯地有各種不同點，於發展上述的研究上成為很大的障礙。
再者，由於該單層培養的限制，不僅於如生物體之白色脂肪細胞的調製，於米色脂肪細胞的調製、研究及生產上亦早成阻礙。
本發明人等，成功地開發一種培養基組成物(專利文獻1、2)，其可不實質地提高液體培養基中之黏度，而於維持為懸浮狀態下，培養細胞或組織。又，提出使用該培養基組成物之紅血球之製造方法(專利文獻3)、血管平滑肌細胞之培養方法(專利文獻4)、荷瘤哺乳動物模型之製造方法(專利文獻5)、癌細胞與癌周圍細胞共培養之方法(專利文 獻6)等的報告。再者，並提出細胞回收性經改善之培養基組成物的報告(專利文獻7)。
專利文獻1：國際公開第2014/017513號
專利文獻2：美國專利申請公開第2014/0106348號說明書
專利文獻3：美國專利申請公開第2016/0060601號說明書
專利文獻4：國際公開第2016/121896號
專利文獻5：國際公開第2016/125884號
專利文獻6：國際公開第2017/057599號
專利文獻7：國際公開第2017/154952號
本發明之目的在於提供一種分化誘導方法，其可於生物體外分化誘導成與由生物體所分離之脂肪細胞具有同樣性質的白色脂肪細胞。又，本發明之目的亦在於提供一種分化誘導方法，其可於生物體外分化誘導米色脂肪細胞。
本發明人等為了達成上述課題而努力研究的結果發現，將前驅脂肪細胞、間葉系幹細胞等具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有具去醯化結蘭膠等之具有陰離子性官能基、藉由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體之高分子化合物的脂肪細胞分化誘導培養基中懸浮培養，該間葉系細胞，分化成與由生物體所分離之脂肪細胞同樣地呈球狀、於一個細胞內含有一個大脂肪滴之單胞性的脂肪細胞 (白色脂肪細胞)。該脂肪細胞，由於細胞內脂肪滴，可於培養基中獨自地懸浮，因此，藉由緩緩降低去醯化結蘭膠的濃度，可容易地單離懸浮之白色脂肪細胞。若進一步長時間地培養該白色脂肪細胞，藉由促進熱產生，掌管能量消耗之米色脂肪細胞標記UCP-1的表現亢進，呈現米色脂肪細胞的性質。本發明人等基於以上的發現，進一步加以探討，而完成本發明。
亦即，本發明係關於以下所述。
[1]一種單胞性脂肪細胞之製造方法，其包含有：將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有經由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、具陰離子性官能基之高分子化合物之可懸浮培養細胞或組織的液狀培養基組成物中，進行懸浮培養，並且誘導分化成為單胞性脂肪細胞。
[2]如[1]所記載之方法，其中，該間葉系細胞為前驅脂肪細胞、間葉系幹細胞或纖維母細胞。
[3]如[1]或[2]所記載之方法，其中，該高分子化合物為多醣類。
[4]如[3]所記載之方法，其中，該多醣類含有葡萄糖醛酸部位。
[5]如[4]所記載之方法，其中，該多醣類為去醯化結蘭膠、迪特膠、三仙膠或該多醣類之鹽。
[6]如[5]所記載之方法，其中，該多醣類為去醯化結蘭膠或其鹽，該培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度為0.01~0.05%(w/v)。
[7]如[5]所記載之方法，其中，該多醣類為迪特膠或三仙膠或該多醣類之鹽，該培養基組成物中之迪特膠或三仙膠或該多醣類之鹽的濃度為0.01~0.05%(w/v)。
[8]如[1]至[7]中任一項所記載之方法，其中，該培養基組成物含有二價金屬陽離子。
[9]如[8]所記載之方法，其中，二價金屬陽離子為鈣離子。
[10]如[1]至[9]中任一項所記載之方法，其中，該培養基組成物含有脂肪細胞分化誘導因子。
[11]如[10]所記載之方法，其中，脂肪細胞分化誘導因子，為選自胰島素、糖皮質素受體促效劑、cAMP磷酸二酯酶抑制劑、環氧化酶抑制劑、前列腺素、長鏈脂肪酸、三碘甲狀腺胺酸、及PPARγ促效劑所構成之群中的至少一因子。
[12]如[11]所記載之方法，其中，脂肪細胞分化誘導因子，包含胰島素、糖皮質素受體促效劑、及環氧化酶抑制劑。
[13]如[12]所記載之方法，其中，糖皮質素受體促效劑為地塞米松。
[14]如[12]或[13]所記載之方法，其中，環氧化酶抑制劑為吲哚美辛。
[15]如[11]所記載之方法，其中，脂肪細胞分化誘導因子，包含胰島素、糖皮質素受體促效劑、及cAMP磷酸二酯酶抑制劑。
[16]如[15]所記載之方法，其中，糖皮質素受體促效劑為地塞米松。
[17]如[15]或[16]所記載之方法，其中，cAMP磷酸二酯酶抑制劑為3-異丁基-1-甲基黃嘌呤。
[18]如[1]至[17]中任一項所記載之方法，其中，單胞性脂肪細胞為UCP-1陽性。
[19]如[1]至[18]中任一項所記載之方法，其進一步使懸浮培養所得之細胞懸浮液中之該高分子化合物濃度，降低至間葉系細胞無法懸浮的濃度，而回收維持為懸浮狀態的單胞性脂肪細胞。
藉由本發明，可於生物體外製造與由生物體所分離之脂肪細胞同樣地於一個細胞內含有一個大脂肪滴之單胞性的白色脂肪細胞。又，藉由本發明，亦可於生物體外製造不僅於新藥開發研究、於藉由移植對糖尿病或肥胖之治療用途可期待的類米色脂肪細胞。
第1圖係顯示開始培養後第12天之各細胞的形態。
第2圖係顯示開始培養後第30天之分化脂肪細胞的oil Red染色影像。
第3圖係顯示開始培養後第36天之分化脂肪細胞的oil Red染色影像。
第4圖係顯示開始培養後第39天之細胞的形態。
第5圖係顯示開始培養後第30天之細胞的形態。
(I)本發明所使用之培養基組成物
可使用於本發明之培養基組成物，係可懸浮培養細胞或組織的液狀培養基組成物。該培養基組成物，可於維持為懸浮狀態下，將培養對象之細胞(亦即，具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞)培養。該培養基組成物，可依據WO2014/017513 A1及US2014/0106348 A1之記載來調製。以下，將該培養基組成物稱為培養基組成物I。
本發明中所謂細胞或組織的懸浮，係指對於培養容器，細胞或組織為不貼附的狀態(非貼附)。本發明中，培養細胞或組織之際，對 於液狀之培養基組成物，不伴隨來自外部的壓力及振動，亦不進行該培養基組成物中之振動、旋轉操作等，使細胞或組織於該培養基組成物中均勻地分散且懸浮的狀態，稱為「懸浮靜置」，而以該狀態培養細胞或組織稱為「懸浮靜置培養」。又，於「懸浮靜置」中可懸浮之期間，包含5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7天以上等，但保持懸浮狀態並不限於該等期間。
培養基組成物I，於可培養細胞或組織之溫度範圍(例如，0~40℃)之至少一點，可進行細胞或組織之懸浮靜置。本發明所使用之培養基組成物，較佳為25~37℃的溫度範圍之至少一點、最佳為37℃，可進行細胞或組織之懸浮靜置。
是否可進行懸浮靜置，例如，可藉由將培養對象之細胞(亦即，具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞)，以2×104cells/ml的濃度，均勻地分散於評價對象的培養基組成物，注入10ml至15ml錐形試管中，於37℃至少靜置5分鐘以上(例如，1小時以上、24小時以上、48小時以上、7天以上)，觀察該細胞是否維持為懸浮狀態，藉此可進行評價。本說明書中，當總細胞中之70%為懸浮狀態時，定義為維持為懸浮狀態。亦可以聚苯乙烯珠(Size 500-600μm，Polyscience Inc.製)代替細胞進行評價。
培養基組成物I，含有可經由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、具陰離子性官能基之高分子化合物或其鹽。本發明所使用之培養基組成物中，該高分子化合物經由二價金屬陽離子之結合，形成於水中分散之三維網狀(不定型之結構體)。若於含有該三維網狀之液體培養基中培養細胞，則該三維網狀發揮使細胞懸浮之載體的功能，培養基中之細胞，被該三維網狀捕捉而不沉下，不需要振動、旋轉操 作等，即可使細胞以懸浮狀態均勻地分散，進行培養(懸浮靜置培養)。
於一態樣中，培養基組成物I之黏度，於37℃為8mPa．s以下、較佳為4mPa．s以下、更佳為2mPa．s以下。培養基組成物之黏度，例如，可於37℃條件下使用E型黏度計(東機產業股份有限公司製，TV-22型黏度計，機種：TVE-22L，圓錐轉子：標準轉子1°34’×R24，轉數100rpm)進行測訂。培養基組成物I，由於可於如此低黏度，實施細胞或組織的懸浮培養(較佳為，懸浮靜置培養)，於繼代等之操作性優異。
作為陰離子性官能基，可舉例如羧基、磺酸基、磷酸基及該等之鹽，較佳為羧基或其鹽。
本發明所使用之高分子化合物，可使用具有由前述陰離子性官能基之群所選擇之1種或2種以上者。
本發明所使用之高分子化合物之較佳具體例，並無特別限制，可舉例如，單糖類(例如，三碳糖、四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等)聚合10個以上的多醣類，更佳可舉例如具有陰離子性官能基的酸性多醣類。此處所謂之酸性多醣類，只要於其構造中具有陰離子性的官能基即可，並無特別限制，例如，具有醣醛酸(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)之多醣類、於結構中之一部分具有硫酸基或磷酸基之多醣類、或具有該兩者之構造的多醣類，不僅由天然所得之多醣類，亦包含由微生物所產生之多醣類、基因工程所產生之多醣類、或使用酵素人工合成的多醣類。更具體而言，可例示如選自玻尿酸、結蘭膠、去醯化結蘭膠(以下，亦稱為DAG)、拉姆贊膠、迪特膠、三仙膠、鹿角菜膠、己糖醛酸、褐藻醣膠、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙醯肝素、肝素、硫酸類肝素、硫酸角質、硫酸軟骨膠、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)、藻酸及該等之鹽所構成之群中之1種或2種以上所構成者。多醣 類，較佳為含有葡萄糖醛酸部位者(例如，玻尿酸、DAG、迪特膠、三仙膠或該等之鹽等)。於其他較佳實施態樣中，多醣類可為鹿角菜膠、藻酸或該等之鹽。更佳為，多醣類為DAG、迪特膠、三仙膠或該等之鹽，若考量於低濃素之使用下即可使細胞或組織懸浮，則最佳為DAG。
此處所謂之鹽，可舉例如鋰、鈉、鉀等鹼金屬之鹽，鈣、鋇、鎂等鹼土金屬之鹽或鋁、鉛、銅、鐵、銨、有機鹼及胺基酸等之鹽。
該等高分子化合物(多醣類等)之重量平均分子量，較佳為10,000至50,000,000、更佳為100,000至20,000,000、再更佳為1,000,000至10,000,000。該分子量，例如，可藉凝膠滲透層析(GPC)之聚三葡萄糖換算來測定。
再者，DAG亦可使用經磷酸化者。該磷酸化可以周知之方法進行。
本發明中，亦可組合複數種(較佳為2種)上述多醣類來使用。多醣類之組合的種類，只要可於液體培養基形成上述結構體，並可使細胞或組織均勻地懸浮(較佳為懸浮靜置)者即可，並無特別限定，較佳為，該組合至少包含DAG或其鹽。亦即，於較佳之多醣類的組合，包含有DAG或其鹽、及DAG或其之外之多醣類(例如，三仙膠、藻酸、鹿角菜膠、迪特膠、甲基纖維素、刺槐豆膠或該等之鹽)。具體之多醣類的組合，可舉例如DAG與拉姆贊膠、DAG與迪特膠、DAG與三仙膠、DAG與鹿角菜膠、DAG與刺槐豆膠、DAG與κ-鹿角菜膠、DAG與藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，但並不限於該等。
去醯化結蘭膠，係以1-3鍵結之葡萄糖、1-4鍵結之葡萄糖醛酸、1-4鍵結之葡萄糖及1-4鍵結之鼠李糖之四分子的糖作為構成單位之直鏈狀高分子多醣類，於以下一般式(I)，R1、R2皆為氫原子，n為2以上 之整數所表示的多醣類。惟，R1亦可含有甘油基、R2亦可含有乙醯基，乙醯基及甘油基之含量，較佳為10%以下、更佳為1%以下。
培養基中之上述高分子化合物的濃度，係依存於高分子化合物的種類，於高分子化合物可於液體培養基中形成上述之結構體，並使細胞或組織均勻地懸浮(較佳為懸浮靜置)的範圍內，可適當地設定，但通常可為0.0005%至1.0%(w/v)、較佳為0.001%至0.4%(w/v)、更佳為0.005%至0.1%(w/v)、再更佳為0.005%至0.05%(w/v)。例如，當為去醯化結蘭膠時，可以0.001%至1.0%(w/v)、較佳為0.003%至0.5%(w/v)、更佳為0.005%至0.3%(w/v)、再更佳為0.01%至0.05%(w/v)、最佳為0.01%至0.03%(w/v)添加至培養基中。當為迪特膠及三仙膠時，可為0.001%至5.0%(w/v)、較佳為0.01%至1.0%(w/v)、更佳為0.01%至0.5%(w/v)、最佳為0.02%至0.2%(w/v)添加至培養基中。當為κ-鹿角菜膠時及刺槐豆膠混合系時，可為0.001%至5.0%(w/v)、較佳為0.005%至1.0%(w/v)、更佳為0.01%至0.1%(w/v)、最佳為0.03%至0.05%(w/v)添加至培養基中。當為天然型結蘭膠時，可為0.05%至1.0%(w/v)、較佳為0.05%至0.1%(w/v)添加至培養基中。
當組合複數種(較佳為兩種)之上述多醣類使用時，該多醣類之濃度，可將該多醣類之組合適當設定為可於液體培養基中形成上述之結構體、且可使細胞或組織均勻地懸浮(較佳為懸浮靜置)的範圍內。例如，當使用DAG或其鹽、與DAG或其鹽以外之多醣類的組合時，DAG 或其鹽的濃度，可例示如0.005~0.02%(w/v)、較佳為0.01~0.02%(w/v)，DAG或其鹽以外之多醣類的濃度，可例示如0.0001~0.4%(w/v)、較佳為0.005~0.4%(w/v)、更佳為0.01~0.4%(w/v)。具體之濃度範圍的組合，可例示如以下。
DAG或其鹽：0.005~0.02%(較佳為0.01~0.02%)(w/v)
DAG以外之多醣類
三仙膠：0.01~0.4%(w/v)
藻酸鈉：0.0001~0.4%(w/v)(較佳為0.1~0.4%(w/v))
天然型結蘭膠：0.0001~0.4%(w/v)
刺槐豆膠：0.1~0.4%(w/v)
甲基纖維素：0.1~0.4%(w/v)(較佳為0.2~0.4%(w/v))
鹿角菜膠：0.05~0.1%(w/v)
迪特膠：0.01~0.1%(w/v)
於一態樣中，係組合DAG或其鹽、藻酸或其鹽(例如，藻酸鈉)使用。本態樣之培養基組成物，具有維持細胞或組織之懸浮狀態的效果，同時藉由視需要添加螯合劑，藉由移液或過濾器過濾等施加剪切力，而具有使該效果加速喪失的特性(WO2017/154952 A1)。
本態樣之培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，例如為0.002~0.01(w/v)%、較佳為0.002~0.009(w/v)%、更佳為0.003~0.009(w/v)%。本態樣之培養基組成物中之藻酸或其鹽的濃度，例如為0.004~0.1(w/v)%、較佳為0.004~0.002(w/v)%、更佳為0.004~0.015(w/v)%、又更佳為0.005~0.015(w/v)%。
本態樣之培養基組成物中所含之去醯化結蘭膠或其鹽、與藻酸或其鹽的質量比，相對於去醯化結蘭膠或其鹽的1質量份，藻酸或其鹽為1質量 份以上、較佳為2質量份以上。於一態樣中，相對於去醯化結蘭膠或其鹽的1質量份，藻酸或其鹽例如為1~4質量份、較佳為1~3質量份、更佳為1~2質量份。
又，該濃度可藉由以下之式算出。
濃度[%(w/v)]=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之容量(ml)×100
培養基組成物I含有二價金屬陽離子。二價金屬陽離子，可舉例如鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。二價金屬陽離子的種類，只要上述高分子化合物，可經由該二價金屬離子鍵結而形成可使細胞或組織懸浮的結構體即可，並無特別限定，較佳為培養基組成物I含有鈣離子及鎂離子中之至少一者、更佳為含有鈣離子。培養基組成物I中之二價金屬陽離子濃度，可適當地設定於上述高分子化合物可於液體培養基中形成上述結構體、並使細胞或組織均勻地懸浮(較佳為懸浮靜置)的範圍內。例如，培養基組成物中之鈣離子濃度，為0.1mM至300mM、較佳為0.5mM至100mM，但並不限定於該等。於哺乳動物培養所使用之一般的液體培養基，含有充分濃度的鈣離子以使上述高分子化合物形成上述結構體。
培養基組成物I，可藉由將培養細胞及/或組織之際所使用之基礎培養基，與上述高分子化合物混合而調製。當細胞或組織來自哺乳動物時，只要為哺乳動物細胞之培養所使用之基礎培養基皆可使用。如此之基礎培養基，可舉例如杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、漢姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、馬可5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾MEM(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM (Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、依斯可夫改良達魯貝可培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E、IPL41培養基、費雪培養基、StemPro34(Invitrogen公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(Stem Sell Technology公司製)、StemSpanSFEM(Stem Sell Technology公司製)、StemLineII(Sigma-Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製)、Essential8(註冊商標)培養基(Gibco公司製)、mTeSR1或2培養基(Stem Sell Technology公司製)、ReproFF或ReproFF2(ReproCELL公司製)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Biosciences公司製)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製)、MesenPRO RS培養基(Gibco公司製)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份有限公司製)、Sf-900II(Invitrogen公司製)、Opti-Pro(Invitrogen公司製)、人類脂肪細胞分化培養基(東洋紡股份有限公司製)、人類前驅脂肪細胞增殖培養基(東洋紡股份有限公司製)等。
於培養基組成物I，所屬技術領域者亦可視目的自由地添加鈉、鉀、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生素、血清(或其替代物)、脂肪酸、糖等。於培養來自哺乳動物之細胞或組織時，所屬技術領域者亦可視目的組合一種以上之其他化學成分或生物體成分來添加。
可添加於來自哺乳動物之細胞(或組織)之培養基的成分，可舉例如胎牛血清、人類血清、馬血清、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、洋菜、洋菜糖、膠原蛋白、甲基纖 維素、各種細胞介素、各種賀爾蒙、各種增殖因子、各種細胞外基質或各種細胞接著分子等。
培養基組成物I，可依據WO2014/017513 A1、US2014/0106348 A1、WO 2017/154952 A1等之記載來調製。
於較佳態樣，培養基組成物I含有去醯化結蘭膠或其鹽。於一態樣中，培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，為0.001%至0.1%(w/v)、較佳為0.003%至0.5%(w/v)、更佳為0.005%至0.3%(w/v)、再更佳為0.01%至0.05%(w/v)、最佳為0.01%至0.03%(w/v)。該培養基組成物，可含有去醯化結蘭膠或其鹽以外的多醣類。該培養基組成物，含有充分濃度的鈣離子以使去醯化結蘭膠形成可懸浮培養細胞或組織的結構體。該濃度例如為0.1mM至300mM、較佳為0.5mM至100mM。該培養基組成物之黏度，於37℃，為8m．Pa以下、較佳為4mPa．s以下、更佳為2mPa．s以下。
於其他之較佳態樣，培養基組成物I，組合含有去醯化結蘭膠或其鹽、及藻酸或其鹽(例如，藻酸鈉)。於一態樣中，培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，例如為0.002至0.01%(w/v)、較佳為0.002至0.009%(w/v)、更佳為0.003至0.009%(w/v)。本態樣之培養基組成物中之藻酸或其鹽的濃度，例如為0.004至0.1%(w/v)、較佳為0.004至0.02%(w/v)、更佳為0.004至0.015%(w/v)、再更佳為0.005至0.015%(w/v)。本態樣之培養基組成物中所含之去醯化結蘭膠或其鹽、與藻酸或其鹽的質量比，相對於去醯化結蘭膠或其鹽1質量份，藻酸或其鹽為1質量份以上，例如為1~4質量份、較佳為1~3質量份、更佳為1~2質量份。該培養基組成物，含有充分濃度的鈣離子，以使去醯化結蘭膠或其鹽及藻酸或其鹽形成可懸浮培養細胞或組織的結構體。該濃度 例如為0.1mM至300mM、較佳為0.5mM至100mM。該培養基組成物之黏度，於37℃，為8m．Pa以下、較佳為4mPa．s以下、更佳為2mPa．s以下。
(II)單胞性脂肪細胞之製造方法
本發明提供一種單胞性脂肪細胞之製造方法(以下，稱為本發明之製造方法1)，包含：將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於上述培養基組成物I中懸浮培養，並誘導其成為單胞性脂肪細胞的分化。
本發明所使用之間葉系細胞，係由哺乳動物之生物體所分離之初代細胞，將該初生細胞繼代培養所建立之細胞株、或腫瘤細胞。哺乳動物，可舉例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等齧齒類，兔子等兔目，豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄目，狗、貓等貓目，人、猴子、恆河獼猴、食蟹獼猴、絨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等靈長類。哺乳動物較佳為齧齒類(小鼠等)或靈長類，更佳為人。
間葉系細胞，係指構成骨、軟骨、脂肪、骨骼肌、韌帶、肌腱等的結締組織的細胞、或其幹細胞或前驅細胞之意，於胚胎學中為來自中胚層的細胞。具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，可舉例如前驅脂肪細胞、間葉系幹細胞、纖維母細胞、去分化脂肪細胞等，但並不限於該等。本發明所使用之具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，較佳為前驅脂肪細胞或間葉系幹細胞。於一態樣中，具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於細胞內不含有脂肪滴的蓄積。
所謂前驅脂肪細胞，係指具有分化成為脂肪細胞之能力之來自脂肪組織的細胞。與成熟的脂肪細胞不同，前驅脂肪細胞於細胞內未見脂肪滴的蓄積，為具有增殖性之類纖維母細胞的細胞。一般而言，於前驅脂肪細胞中，至少一部分之脂肪細胞標記基因的表現量，與成熟之脂肪細 胞相比，為極低。例如，前驅脂肪細胞中之FABP4 mRNA表現量，可為成熟之脂肪細胞的1/10以下、較佳為1/100以下。前驅脂肪細胞中之PPAR gamma mRNA表現量，可為成熟之脂肪細胞的1/10以下。前驅脂肪細胞中之脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表現量，可為成熟之脂肪細胞的1/10以下、較佳為1/100以下。前驅脂肪細胞，可將由哺乳動物取出之脂肪組織(皮下脂肪組織、內臟脂肪組織等)，以膠原酶等組織分解性酵素消化而得細胞懸浮液，將所得之細胞懸浮液依據Int J Obes Relat Metab Disord.1996 Mar；20 Suppl 3：S77-83等所記載之方法，例如藉由離心而區分，回收沉澱作為富含前驅脂肪細胞的區分，藉此可單離。亦可使用市售之前驅脂肪細胞。又，亦可使用已建立細胞系之前驅脂肪細胞(例如，3T3-L1)。
所謂間葉系幹細胞，係以具有分化成為脂肪細胞、成骨細胞、及軟骨細胞之能力的體幹細胞，且可進一步分化成為血小板或肝臟等。間葉系幹細胞，主要是來自脂肪組織、來自骨髓、或來自齒髓的細胞。與成熟的脂肪細胞不同，間葉系幹細胞係於細胞內未見脂肪滴的蓄積，具有增殖性之類纖維母細胞的細胞。一般而言，間葉系幹細胞中，與前述之前驅脂肪細胞同樣地，至少一部分之脂肪細胞標記基因的表現量，與成熟之脂肪細胞相比，為極低。例如，來自脂肪細胞之間葉系幹細胞，與前驅脂肪細胞同樣地，可將由哺乳動物取出之脂肪組織(皮下脂肪組織、內臟脂肪組織等)，以膠原酶等組織分解性酵素消化而得細胞懸浮液，將所得之細胞懸浮液依據Int J Obes Relat Metab Disord.1996 Mar；20 Suppl 3：S77-83等所記載之方法，例如藉由離心而區分，回收沉澱作為富含前驅脂肪細胞的區分，藉此可單離。亦可使用市售之間葉系幹細胞。
所謂單胞性脂肪細胞，係一個細胞內僅含有一個大脂肪滴的脂肪細胞，亦稱為白色脂肪細胞。該等細胞，與前驅脂肪細胞、間葉系幹 細胞、來自其他臟器的細胞不同，唯一具有於培養基或生理食鹽水等浮起的性質。該懸浮的性質，與形成生物體內之脂肪組織的脂肪細胞相同。單胞性脂肪細胞，可為FABP4陽性、PPAR gamma陽性、且LPL陽性。
為了誘導自具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，分化成為單胞性脂肪細胞，懸浮培養所使用之培養基組成物I，含有脂肪細胞分化誘導因子。脂肪細胞分化誘導因子，可使用周知者，例如，可選自胰島素、糖皮質素受體促效劑、cAMP磷酸二酯酶抑制劑、環氧化酶抑制劑、前列腺素、長鏈脂肪酸、三碘甲狀腺胺酸、及PPARγ促效劑所構成之群中的至少一因子，較佳為，組合選自前述群中之兩種以上之因子使用。作為糖皮質素受體促效劑，並無特別限定，可舉例如，地塞米松、皮質醇、潑尼松隆、倍他米松、安西諾隆、乙酸安西諾隆、乙酸氟新諾隆等，較佳為地塞米松。作為cAMP磷酸二酯酶抑制劑，並無特別限定，可舉例如3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等甲基黃嘌呤類。作為環氧化酶抑制劑，並無特別限定，可舉例如吲哚美辛、阿斯匹靈等，較佳為吲哚美辛。作為前列腺素，並無特別限定，可舉例如PGD2、PGF2a、PGI2、PGJ2等，較佳為PGJ2。長鏈脂肪酸，係碳數11以上之脂肪酸的總稱，具體而言，較佳可使用油酸、亞麻油酸、棕櫚酸、花生油酸等。作為PPARγ促效劑，並無特別限定，可舉例如吡格列酮、曲格列酮(Troglitazone)、羅格列酮等四氫噻唑衍生物。作為較佳之脂肪細胞分化誘導因子的組合，可舉例如．胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、及環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)；．胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、及cAMP磷酸二酯酶抑制劑(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等)； ．胰島素、糖皮質素受體促效劑(皮質醇等)、及三碘甲狀腺胺酸(T3)(DIABETES,45,1435-1438,1996)；．胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)、及三碘甲狀腺胺酸(T3)等，但並不限定於該等。
添加於培養基組成物I之脂肪細胞分化誘導因子的濃度，係誘導自具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞分化成為單胞性脂肪細胞(包含白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)的濃度，該技術領域中誘導脂肪細胞分化時一般所使用的濃度，亦可適用於本發明。
胰島素，例如以1~100μg/ml的濃度添加。
糖皮質素受體促效劑(地塞米松)，雖視種類而異，例如以0.1~100μM的濃度添加。
cAMP磷酸二酯酶抑制劑(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，雖視種類而異，例如以0.1~10mM的濃度添加。
環氧化酶抑制劑(例如吲哚美辛)，雖視種類而異，例如以0.01~1000μM的濃度添加。
前列腺素(例如PGJ2)，雖視種類而異，例如以1~100μM的濃度添加。
長鏈脂肪酸(例如，花生油酸)，雖視種類而異，例如以0.5~500μM的濃度添加。
PPARγ促效劑(例如，吡格列酮)，雖視種類而異，例如以1~100μM的濃度添加。
為了促進自具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，分化成為單胞性脂肪細胞(包含白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)，培養基組成物I亦可含有表皮生長因子(EGF)。EGF例如可以0.1~10ng/ml的濃度 添加。
為了促進自具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，分化成為單胞性脂肪細胞(包含白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)，培養基組成物I亦可含有運鐵蛋白。運鐵蛋白，亦包含血清運鐵蛋白及卵運鐵蛋白。運鐵蛋白例如可以1~100μg/ml的濃度添加。
為了促進自具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，分化成為單胞性脂肪細胞(包含白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)，培養基組成物I亦可含有三碘甲狀腺胺酸(T3)。T3例如可以0.01~100nM的濃度添加。
為了促進自具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，分化成為單胞性脂肪細胞(包含白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)，培養基組成物I亦可含有血清(例如，胎牛血清、人類血清)或其替代物。血清或其替代物，例如可以0.1~20%(v/v)的濃度添加。
於較佳之一態樣中，培養基組成物I，含有胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)、及EGF。於較佳之一態樣中，培養基組成物I，含有胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)、EGF、及運鐵蛋白、及三碘甲狀腺胺酸。
於較佳之一態樣中，培養基組成物I，含有胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、及cAMP磷酸二酯酶抑制劑(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等)。
於本發明之製造方法1中，係將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有上述脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I中進行懸浮培養(較佳為，靜置懸浮培養)。
於將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞進行懸浮培養時，可使用於細胞培養一般所使用的燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、皿、培養皿、組織培養用皿、多皿、微量盤、微孔盤、多盤、多孔盤、細胞培養玻片、細胞培養燒瓶、旋蓋搖瓶、試管、托盤、培養袋、滾瓶等培養容器進行培養。該等培養容器，較佳為細胞低貼附性。作為細胞非貼附性之培養容器，可使用培養容器之表面未施以用以提升與細胞之貼附性為目的的人工處理(例如，經由細胞外基質等的包覆處理)者，或者培養容器之表面經用以減低與細胞之貼附性為目的的人工處理者。
於機械性的調控下，亦可於密閉環境下自動地實行細胞播種、培養基交換、細胞影像取得、培養細胞回收，可於調控pH、溫度、氧濃度等之下，藉由可高密度培養之生物反應器或自動培養裝置來進行。
培養具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞之形態或狀態，所屬技術領域者可任意地選擇。其之較佳具體例，並無特別限制，可舉例如，具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，以單一細胞的狀態分散於培養基組成物I中的狀態；具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，貼附於載體表面上的狀態；具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，包埋於載體內部的狀態；集合複數個前驅脂肪細胞而形成細胞凝集塊(球(球狀體))的狀態等。具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，較佳為，以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中的狀態、或以集合複數個細胞而形成細胞凝集塊(球(球狀體))的狀態，懸浮培養於培養基組成物I中(較佳為懸浮靜置培養)。亦即，較佳為不使用用以貼附或包埋具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的載體。
於本發明之製造方法1中，培養具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞時，對於含有上述脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物 I，亦可添加另外調製之具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，以均勻分散的方式懸浮。懸浮方法並無特別限制，可舉例如，以分液器等的手動懸浮，使用攪拌器、振盪混合器、微量盤混合器、振動機等儀器的懸浮。將所得之具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的懸浮液，播種於培養容器，進行懸浮培養。懸浮培養，可於靜置進行、亦可視需要伴隨培養液的旋轉、振動或攪拌。其旋轉數或頻率，可視目的適當地設定。較佳為，進行懸浮靜置培養。於培養途中，當需要更換培養基組成物時，可藉離心或過濾處理等分離細胞與培養基，使細胞再懸浮於新鮮之含有脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I，進行懸浮培養。或者，可藉由進行離心或過濾處理將細胞適當濃縮後，將新鮮之含有脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I添加於該濃縮液，再度進行懸浮培養。
於一態樣中，由維持培養(例如，單層培養、懸浮培養)回收具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞，將其分散為單一細胞、或近似於其的狀態。具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的分散，可使用適當的細胞解離液進行。作為細胞解離液，例如，可單獨或適當地使用EDTA；胰蛋白酶、膠原蛋白酶IV、金屬蛋白酶等蛋白分解酵素等。使分散後之具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞，懸浮於含有脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I中，對其進行懸浮培養(較佳為，懸浮靜置培養)。培養物中，具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，可以單一細胞的狀態、或球體之形態獲得。於培養中，較佳為使用細胞非貼附性培養器，但並不限於其。
培養開始時之具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的濃度，根據本發明之方法，以誘導成為單胞性脂肪細胞的分化為限，無特別限定，通常為1.0×102~1.0×107個/mL、較佳為1.0×103~1.0×106個/mL、 更佳為1.0×104~1.0×105個/mL(例如，3.0×104~9.0×104個/mL)。
培養具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞時的溫度，通常為25至39℃、較佳為37℃。CO2濃度，於培養的環境氣氛中，通常為4至10體積%、較佳為5體積%。氧濃度，於培養的環境氣氛中，為15~50體積%、較佳為20體積%。
藉由將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有脂肪細胞分化誘導分子的培養基組成物I中懸浮培養，以誘導成為單胞性脂肪細胞的分化。於以往方法，係於貼附於盤上狀態的前驅脂肪細胞，藉由使脂肪細胞分化誘導因子作用，藉此貼附於盤上，但僅能得到如紡錘體形狀之於細胞內蓄積多數之小脂肪滴的多胞性脂肪細胞。相對於此，以本發明之方法，藉由將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I中懸浮培養，可得懸浮於培養基中、呈球狀之於一個細胞內含有一個大脂肪滴之生理狀態更相近的單胞性脂肪細胞。誘導成為單胞性脂肪細胞的分化，可藉由光學顯微鏡之觀察，以於細胞質內僅含有一個大脂肪滴之細胞的出現來確認。又，細胞質內之脂肪滴之有無的確認，例如可使用油紅0染色法等來進行。或者，誘導成為單胞性脂肪細胞的分化，亦可藉由檢測脂肪細胞標記蛋白質或編碼其之mRNA的表現來確認。脂肪細胞標記蛋白質的表現，可藉由使用對於該標記之抗體的免疫學方法(例如，流式細胞術、免疫組織化學等)來實施。編碼脂肪細胞標記之mRNA的表現，可藉由RT-PCR等周知之基因工程方法來實施。作為脂肪細胞標記，可舉例如FABP4、PPAR gamma、LPL等，但並不限定於該等。於一態樣中，本發明之製造方法1，係包含確認於培養物中出現單胞性脂肪細胞的步驟。於一態樣中，至培養物中出現單胞性脂肪細胞出現為止，進行具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞之以 含有脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I中，進行懸浮培養。
具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞之分化誘導所需要的培養期間，係視脂肪細胞分化誘導因子的種類而定，但由前驅脂肪細胞之懸浮培養開始，通常為8天以上、較佳為10天以上、更佳為18天以上、更佳為21天以上、再更佳為30天以上。
於一態樣中，根據本發明之製造方法1所得之單胞性脂肪細胞，為UCP-1陽性。UCP-1係藉由促進熱產生而掌管能量消耗之米色脂肪細胞的標記。藉此，UCP-1陽性單胞性脂肪細胞，可為具有米色脂肪細胞之形質的脂肪細胞(如米色之脂肪細胞)。米色脂肪細胞，由於可活躍地產生熱量而消耗能量，故根據本發明之製造方法1所得之UCP-1陽性單胞性脂肪細胞，藉由移植至糖尿病、肥胖等代謝性疾病患者，可期待對於該代謝性疾病的預防及/或治療效果。誘導成為陽性單胞性脂肪細胞的分化，可藉由檢測UCP-1蛋白質或編碼其之mRNA的表現來確認。UCP-1蛋白質的表現，可藉由使用對於UCP-1之抗體的免疫學方法(例如，流式細胞術、免疫組織化學等)來實施。UCP-1mRNA的表現，可藉由RT-PCR等周知之基因工程方法來實施。於一態樣中，本發明之製造方法1，包含確認於培養物中出現UCP-1陽性單胞性脂肪細胞的步驟。於一態樣中，至培養物中出現UCP-1陽性單胞性脂肪細胞出現為止，繼續具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞之於脂肪細胞分化誘導因子的培養基組成物I中的懸浮培養，而得UCP-1陽性單胞性脂肪細胞。
UCP-1陽性單胞性脂肪細胞之分化誘導所需要的培養期間，係視脂肪細胞分化誘導因子的種類而定，但由具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系幹細胞的懸浮培養開始，通常為21天以上、較佳為30天以上、更佳為36天以上。
單胞性脂肪細胞，由於細胞質內含有大的脂肪滴，故於液狀之培養基組成物中，即使不含有可藉由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、且具有陰離子性官能基的高分子化合物，於該液狀之培養基組成物中亦可獨自地懸浮。因此，於培養物中確認到單胞性脂肪細胞的出現後，當持續懸浮培養所得之單胞性脂肪細胞，並誘導成為更成熟的單胞性脂肪細胞的分化時，即使該培養基組成物I中之該高分子化合物濃度降低，亦可繼續進行目的之懸浮培養。例如，於確認到單胞性脂肪細胞出現的階段(例如，自具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的懸浮培養開始後，例如經過8~30天、較佳為18~30天的階段)，由懸浮培養所得之細胞懸浮液中的該高分子化合物濃度，亦可降低至無法使具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞懸浮的濃度。例如，當單獨地使用去醯化結蘭膠或其鹽，作為藉由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、且具有陰離子性官能基的高分子化合物時，於培養物中確認到單胞性脂肪細胞出現的階段(例如，自具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的懸浮培養開始後，例如經過8~30天、較佳為18~30天的階段)，使培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，例如為0.0075%(w/v)以下、較佳為0.00375%(w/v)以下。當使用迪特膠或三仙膠或其鹽，作為該高分子化合物時，於培養物中確認到單胞性脂肪細胞出現的階段，其濃度，例如可為0.015%(w/v)以下、較佳為0.0075%(w/v)以下。亦可使培養基組成物中之該高分子化合物濃度階段性地降低。例如，當使用去醯化結蘭膠或其鹽，作為該高分子化合物時，例如，於具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的懸浮培養開始後經過18~20天的階段，使培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，為0.0075%(w/v)以下，再者，於具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞的懸浮培養開 始後經過30~36天的階段，使該濃度為0.00375%(w/v)以下。
經誘導之單胞性脂肪細胞的回收，可藉周知之方法進行。單胞性脂肪細胞，由於細胞質內含有大的脂肪滴，故於液狀之培養基組成物中，即使不含有可藉由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、且具有陰離子性官能基的高分子化合物，於該液狀之培養基組成物中亦可獨自地懸浮。又，單胞性脂肪細胞，即使離心亦不沉降，可維持懸浮於液狀培養基組成物中的狀態。因此，將藉由懸浮培養所得之細胞懸浮液，進行以不含上述高分子化合物之液狀培養基組成物的稀釋及/或離心，回收維持懸浮狀態之單胞性脂肪細胞，藉此可單離經誘導之單胞性脂肪細胞。
於一態樣中，使藉懸浮培養所得之細胞懸浮液中之該高分子化合物濃度，降低至具有成為脂肪細胞之分化能力之間葉系細胞無法懸浮的濃度，回收維持懸浮狀態的單胞性脂肪細胞。例如，當單獨地使用去醯化結蘭膠或其鹽，作為藉由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、且具有陰離子性官能基的高分子化合物時，使培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，例如為0.0075%(w/v)以下、較佳為0.00375%(w/v)以下。降低該高分子化合物濃度後，亦可對細胞懸浮液進行離心。藉由進行如此之操作，於懸浮培養後所殘存之具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞、或於細胞內不含脂肪滴之脂肪細胞以外的細胞沉降，成功地分化之單胞性脂肪細胞則不沉降而維持懸浮狀態，因此，可由殘存之具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞、或於細胞內不含脂肪滴之脂肪細胞以外的細胞，容易地分離出經分化的單胞性脂肪細胞。
(III)培養調製物
本發明係提供含有下述(1)及(2)之培養調製物， (1)具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞及/或單胞性脂肪細胞(白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)、(2)培養基組成物I，於本發明之培養調製物中，具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞及/或單胞性脂肪細胞(白色脂肪細胞或米色脂肪細胞)，可以懸浮於培養基組成物I中的狀態存在。
具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，較佳為前驅脂肪細胞或間葉系幹細胞。
單胞性脂肪細胞，可為UCP-1陽性。
於較佳態樣中，培養基組成物I，含有去醯化結蘭膠或其鹽。於一態樣中，培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，為0.001%至1.0%(w/v)、較佳為0.003%至0.5%(w/v)、更佳為0.005%至0.3%(w/v)、再更佳為0.01%至0.05%(w/v)、最佳為0.01%至0.03%(w/v)。該培養基組成物，可含有去醯化結蘭膠或其鹽以外的多醣類。該培養基組成物，含有充分濃度的鈣離子以使去醯化結蘭膠形成可懸浮培養細胞或組織的結構體。該濃度例如為0.1mM至300mM、較佳為0.5mM至100mM。該培養基組成物之黏度，於37℃，可為8m．Pa以下、較佳為4mPa．s以下、更佳為2mPa．s以下。
於另一較佳態樣中，培養基組成物I，組合含有去醯化結蘭膠或其鹽、及藻酸或其鹽(例如，藻酸鈉)。於一態樣中，培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度，例如為0.002至0.01%(w/v)、較佳為0.002至0.009%(w/v)、更佳為0.003至0.009%(w/v)。本態樣之培養基組成物中之藻酸或其鹽的濃度，例如為0.004至0.1%(w/v)、較佳為0.004至0.02%(w/v)、更佳為0.004至0.015%(w/v)、再更佳為 0.005至0.015%(w/v)。本態樣之培養基組成物中所含之去醯化結蘭膠或其鹽、與藻酸或其鹽的質量比，相對於去醯化結蘭膠或其鹽1質量份，藻酸或其鹽為1質量份以上，例如為1~4質量份、較佳為1~3質量份、更佳為1~2質量份。該培養基組成物，含有充分濃度的鈣離子，以使去醯化結蘭膠或其鹽及藻酸或其鹽形成可懸浮培養細胞或組織的結構體。該濃度例如為0.1mM至300mM、較佳為0.5mM至100mM。該培養基組成物之黏度，於37℃，為8m．Pa以下、較佳為4mPa．s以下、更佳為2mPa．s以下。
於較佳態樣中，培養基組成物I含有脂肪細胞分化誘導因子。
脂肪細胞分化誘導因子，可為選自胰島素、糖皮質素受體促效劑(例如，地塞米松)、cAMP磷酸二酯酶抑制劑(例如，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、環氧化酶抑制劑(例如，吲哚美辛)、前列腺素(例如，PGJ2)、長鏈脂肪酸(例如，花生油酸)、三碘甲狀腺胺酸及PPARγ促效劑(例如，吡格列酮)所構成之群中的至少一種因子。
較佳為，脂肪細胞分化誘導因子，包含以下之任一組合：．胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、及環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)；．胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、及cAMP磷酸二酯酶抑制劑(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等)；．胰島素、糖皮質素受體促效劑(皮質醇等)、及三碘甲狀腺胺酸；．胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)、及三碘甲狀腺胺酸。
除脂肪細胞分化誘導因子之外，培養基組成物I亦可含有表 皮生長因子(EGF)。
培養基組成物I亦可含有運鐵蛋白。
培養基組成物I亦可含有三碘甲狀腺胺酸。
培養基組成物I亦可含有血清或其替代物。
於較佳之一態樣中，培養基組成物I含有胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)、及EGF。於較佳之一態樣中，培養基組成物I含有胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、環氧化酶抑制劑(吲哚美辛等)、EGF、運鐵蛋白、及三碘甲狀腺胺酸。
於較佳之一態樣中，培養基組成物I含有胰島素、糖皮質素受體促效劑(地塞米松等)、及cAMP磷酸二酯酶抑制劑(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等)。
(III)項中各用語的定義，除特別說明之外，與上述(I)項及(II)項中所記載者相同。
此處所述之包含專利或專利申請說明書之所有刊物所記載的內容，於此援用，與其所有揭示之同程度地包含於本說明書中。
以下藉由具體地記述本發明之製造方法及本發明之評價方法的實施例，以進一步說明本發明，但本發明並不限定於該等。
實施例
(試驗例1：使用去醯化結蘭膠之3D培養所致之人類前驅脂肪細胞之成為脂肪細胞的分化誘導)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液， 以使終濃度為0.10%或0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物，或調製成不含去醯化結蘭膠的培養基組成物。作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為33333細胞/mL的方式，分別接種於添加或未添加上述去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基組成物(未添加、0.010%、0.015%)之後，以使每1孔為150μL的方式分注於96孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3474)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續12天。作為使用一般前驅脂肪細胞可貼附之盤的單層培養法，係以使成為5000細胞/mL的方式，分別接種於人類脂肪細胞分化培養基或人類前驅脂肪細胞增殖培養基(#CAS11K500，東洋紡公司製)後，以使每1孔為150μL的方式分注於96孔平底微量盤(Corning公司製，#3585)的孔中。將人類脂肪細胞分化培養基所接種之細胞，於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續12天。另一方面，將人類前驅脂肪細胞增殖培養基所接種之細胞，於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續4天後，將培養基更換成人類脂肪細胞分化培養基，再繼續培養12天。於培養結束後分別實施照片攝影。
其結果，若以單層培養進行分化誘導，則呈如紡錘狀的形態，確認到貼附於盤底面之小脂肪滴所構成之多胞性的脂肪細胞。另一方面，於以3D條件培養的條件下，於未添加去醯化結蘭膠的條件，於細胞彼此之凝集確認到更大的凝集塊。另一方面，添加有去醯化結蘭膠的3D條件，細胞彼此的凝集受到抑制，且確認到含有脂肪滴之如單胞性之細胞的存在。各培養條件的細胞形態示於第1圖。
(試驗例2：使用去醯化結蘭膠之3D培養所致之成為脂肪細胞的分化誘導)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為30000細胞/mL的方式，接種於上述添加有去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基(0.015%)後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續8天。除了使用於mRNA分析的孔之外，將殘餘之孔中的細胞懸浮液分別移至15mL試管，進行離心操作(400g，3分鐘)，分成上澄部分2.5mL與沉降部分2.5mL，分別添加不含去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基組成物2.5mL，分別再接種於各孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第18天為止，亦即再播種後持續10天。令上澄部分繼續培養的樣品名為sup(1018)，令沉降部分繼續培養的樣品名為bottom(1018)。於培養開始後的第18天，除了使用於mRNA分析的孔之外，將殘餘之孔中的細胞懸浮液分別移至15mL試管，進行離心操作(400g，3分鐘)，分成上澄部分2.5mL與沉降部分2.5mL，分別添加不含去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基組成物2.5mL，分別再接種於各孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第26天為止，亦即再次再播種後 持續8天。令已存在於上澄部分之類脂肪細胞．sup(1018)繼續以懸浮狀態培養的樣品名為sup(1026)；令培養bottom(1018)樣品，以離心分離取出上澄部分並繼續培養的樣品名為sup(1826)，令分離取出沉降部分並繼續培養的樣品名為bottom(1026)。
於mRNA分析中，關於沉降部分及bottom(1018)及bottom(1026)的樣品，回收培養物，以離心分離(400g，3分鐘)回收細胞。使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)由細胞抽出總RNA。關於上澄部分及sup(1018)、sup(1026)、sup(1826)的樣品，以移液器回收懸浮於培養液的細胞，以含有培養基的狀態使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)抽出總RNA。使用總RNA與PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。又，作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正PPAR gamma mRNA或FABP4 mRNA的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
FABP4：HS01086177
其結果，若使用本發明之培養基組成物進行人類前驅脂肪細 胞之成為脂肪細胞的分化誘導，則細胞中之脂肪細胞標記之PPAR gamma及FABP4的mRNA表現量增加。又，藉由使多醣類濃度降低，回收於離心操作後於上澄液中所懸浮的細胞。懸浮的細胞群，PPAR gamma mRNA的表面量特別高，顯示為高度分化的脂肪細胞。PPAR gamma及FABP4的mRNA表現值示於表1。
(試驗例3：使用去醯化結蘭膠之3D培養所致之成為脂肪細胞的分化誘導)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞 分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。作為使用低接著盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為30000細胞/mL的方式，接種於上述添加有去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基(0.015%)後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續10天。除了使用於mRNA分析的孔之外，將殘餘之孔中的細胞懸浮液分別移至15mL試管，進行離心操作(400g，3分鐘)，僅分取沉降部分2.5mL，添加不含去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基組成物2.5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第20天為止，亦即再播種後持續10天。於培養開始後的第20天，將細胞懸浮液移至15mL試管，進行離心操作(400g，3分鐘)，分成上澄部分2.5mL與沉降部分2.5mL，分別用於mRNA分析(樣品名為sup20與bottom20)。又，將另一孔之細胞懸浮液，進行離心操作(400g，3分鐘)，分取上澄部分2.5mL，添加不含去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基組成物2.5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第30天為止，亦即再再播種後持續10天。令已存在於上澄部分之sup20繼續培養的樣品名為sup(2030)。
於mRNA分析中，關於沉降部分及bottom20的樣品，對培養物進行離心分離(400g，3分鐘)以回收細胞。使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)由細胞抽出總RNA。對於上澄部分、sup20、及sup(2030)的樣品，以移液器回收懸浮於培樣液中的細胞，以含有培養基的狀態使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)萃取總RNA。使用總RNA 與PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。又，作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正PPAR gamma mRNA或脂蛋白脂酶(LPL)的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
LPL：HS00173425
[以油紅法之細胞內的脂肪滴染色]
使用前述之sup(2030)細胞，以油紅法實施細胞內的脂肪滴的染色。將細胞懸浮液3μL滴下至經抗剝離處理之載玻片(松浪硝子公司製，APS coat)，添加2μL之試藥1液(Smear Gell，#SG-01，Funakoshi公司製)並移液。接著，添加5μL之試藥2液(Smear Gell，#SG-01，Funakoshi公司製)並迅速地移液2次，直接塗布於載玻片，靜置約2分鐘使其凝固。接著滴下Diluted Lipid Droplets Assay Fixative(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)75μL，靜置15分鐘。再滴下Wash Solution(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)100μL，靜置5分鐘。重複進行該操作2次後，除去Wash Solution，使樣品於室溫下乾燥。接著，滴下Oil Red O (adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)75μL，靜置約20分鐘後，以蒸餾水洗淨。重複進行該洗淨操作至洗淨液不再成為粉紅色為止。滴下Wash Solution(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)100μL，靜置約5分鐘。重複進行該操作2次後，除去Wash Solution，使樣品於室溫下乾燥。之後，實施顯微鏡觀察。
其結果，若使用本發明之培養基組成物進行人類前驅脂肪細胞之成為脂肪細胞的分化誘導，則細胞中之脂肪細胞標記之PPAR gamma及LPL的mRNA表現量增加。以此方法分化的脂肪細胞，藉由油紅染色具有單胞性的脂肪滴，並且PPAR gamma mRNA及LPL mRNA的表現量高，故顯示為高度分化的脂肪細胞。PPAR gamma及LPL的mRNA表現值示於表2，以油紅染色之脂肪細胞影像示於第2圖。
(試驗例4：使用去醯化結蘭膠之3D培養所致之成為脂肪 細胞的分化誘導與UCP-1表現)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。接著，作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為90000細胞/mL的方式，接種於上述添加有去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基(0.015%)後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續10天。將各孔中的細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第21天為止，亦即再播種後持續11天。於培養開始後的第21天，將細胞懸浮液移至15mL試管，進行離心操作(400g，3分鐘)，分成上澄部分5mL與沉降部分5mL，分別用於mRNA分析(樣品名為sup21與bottom21)。又，將另一孔之細胞懸浮液移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物10mL，再次再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第36天為止，亦即再播種後持續15天。於培養開始後的第36天，將細胞懸浮液移至50mL試管，進行離心操作(400g，3分鐘)，分成上澄部分10mL與沉降部分10mL，分別用於mRNA分析(樣品名為sup36與bottom36)。
於mRNA分析中，關於沉降部分及bottom20的樣品，對培養物進行離心分離(400g，3分鐘)以回收細胞。使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)由細胞抽出總RNA。對於上澄部分、sup20、及sup(2030)的樣品，以移液器回收懸浮於培樣液中的細胞，以含有培養基的狀態使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)萃取總RNA。使用總RNA與PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正PPAR gamma mRNA或UCP-1 mRNA的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
UCP-1：HS00222453
[以油紅法之細胞內的脂肪滴染色]
使用前述之bottom36細胞，以油紅法實施細胞內的脂肪滴的染色。將細胞懸浮液3μL滴下至經抗剝離處理之載玻片(松浪硝子公司製，APS coat)，添加2μL之試藥1液(Smear Gell，#SG-01，Funakoshi公司製)並移液。接著，添加5μL之試藥2液(Smear Gell，#SG-01，Funakoshi公司製)並迅速地移液2次，直接塗布於載玻片，靜置約2分鐘使其凝固。 接著滴下Diluted Lipid Droplets Assay Fixative(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)75μL，靜置15分鐘。再滴下Wash Solution(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)100μL，靜置5分鐘。重複進行該操作2次後，除去Wash Solution，使樣品於室溫下乾燥。接著，滴下Oil Red O(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)75μL，靜置約20分鐘後，以蒸餾水洗淨。重複進行該洗淨操作至洗淨液不再成為粉紅色為止。滴下Wash Solution(adipogenesis assay kit,#10006908,Cayman Chemical Company公司製)100μL，靜置約5分鐘。重複進行該操作2次後，除去Wash Solution，使樣品於室溫下乾燥。之後，實施顯微鏡觀察。
其結果，使用本發明之培養基組成物，即使以實施例2之3倍的細胞密度進行接種之條件，進行人類前驅脂肪細胞之成為脂肪細胞的分化誘導，則細胞中之脂肪細胞標記之PPAR gamma的mRNA表現量增加。以此方法分化的脂肪細胞，藉由油紅染色具有單胞性的脂肪滴，數個分化之脂肪細胞凝集。又，米色脂肪細胞標記之掌管熱量產生之UCP-1 mRNA的表現增大，於第36天顯示最大值。若以本法分化誘導為脂肪細胞，則為單胞性且PPAR gamma的mRNA表現量高，並且，顯示為掌管熱量產生之UCP-1的表現增大之如米色的之脂肪細胞。PPAR gamma及UCP-1的mRNA表現值示於表3，以油紅染色之脂肪細胞影像示於第3圖。
(試驗例5：使用去醯化結蘭膠之3D培養與組合各分化誘導培養基所致之成為脂肪細胞的分化誘導與UCP-1表現)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)、或含有10%(v/v)胎牛血清(FES)、1μg/mL胰島素、2μM地塞米松、500μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IDI分化誘導材料，Takara公司，Takara-Bio AdipoInducer Reagent)的DMEM培養基(WAKO公司製)，調製成培養基組成物。接著，作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為90000細胞/mL的方式，懸浮於上述添加有去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基(0.015%)或含有 10%FBS之IDI分化培養基(0.015%)後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續10天。將各孔中的細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，分別添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物5mL或10%FBS之IDI分化培養基組成物5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第20天為止，亦即再播種後持續10天。於培養開始後的第20天，將各孔中之細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物10mL或10%FBS之IDI分化培養基組成物10mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第31天及第40天為止，亦即再播種後持續11天及20天。於培養開始後的第10天、第20天、第31天、第40天，由一部分的各孔回收細胞懸浮液，分別用於mRNA分析。
於mRNA分析中，對含有培養基之細胞懸浮液使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)抽出總RNA。使用總RNA與PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正UCP-1 mRNA或PPAR gamma mRNA的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
UCP-1：HS00222453
其結果，即使用組合一般之脂肪細胞分化誘導劑之IDI(胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，亦可確認單胞性之脂肪細胞的出現，且脂肪細胞標記之PPAR及FABP4之mRNA表現增加。又，米色脂肪細胞標記之掌管熱量產生之UCP-1 mRNA的表現增大，於第40天顯示最大值。由該等結果可知，藉由本發明之製造方法，於各種之脂肪細胞分化誘導條件下，可分化誘導成單胞性之類米色的脂肪細胞。PPAR gamma及UCP-1的mRNA表現值示於表4，分化誘導第39天之細胞形態示於第4圖。
(試驗例6：使用去醯化結蘭膠之來自脂肪之間葉系幹細胞之成為脂肪細胞的分化誘導)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。接著，作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使來自人類脂肪之間葉系幹細胞(C-12977，Takara Bio公司製)成為90000細胞/mL的方式，懸浮於上述添加有去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基(0.015%)後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續10天。將各孔中的細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，分別添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第20天為止，亦即再播種後持續10天。於培養開始後的第20天，將各孔中之細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物10mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第30天為止，亦即再播種後持續10天及20天。於培養開始後的第10天、第20天、第30天，由一部分的各孔回收細胞懸浮液，分別用於mRNA分析。
於mRNA分析中，對含有培養基之細胞懸浮液使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)抽出總RNA。使用總RNA與 PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正PPAR gamma mRNA或FAB mRNA的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
FABP4：HS01086177
其結果，若使用含有去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物，進行來自人類脂肪之間葉系幹細胞之成為脂肪細胞的分化誘導，則分化為單胞性之脂肪細胞，細胞中之脂肪細胞標記之PPAR gamma及FABP4之mRNA表現量增加。PPAR gamma及FABP4之mRNA表現量示於表5，分化誘導第30天之細胞形態示於第5圖。
(試驗例7：使用多醣類之3D培養所致之成為脂肪細胞的分化誘導與UCP-1表現)
以使成為0.3%(w/v)的方式使迪特膠(KELCO GRETE DG-F，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.03%(w/v)的方式，添加迪特膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。以使成為1%(w/v)的方式使三仙膠(KELCOGEL CG，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之本水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.03%(w/v)的方式，添加三仙膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。又，以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。接著，作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為90000細胞/mL的方式，接種於上述之添加有去醯化結蘭膠、三仙膠或迪特膠的人類脂肪細胞分化培養基組成物後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續9天。將各孔中的細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，分別添加不含去醯化結蘭膠、三仙膠或迪特膠之人類脂肪細胞分化培養基 組成物5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第20天為止，亦即再播種後持續10天。於培養開始後的第20天，將各孔中之細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠、三仙膠及迪特膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物10mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第30天為止，亦即再播種後持續10天及20天。於培養開始後的第10天、第20天、第30天，由一部分的各孔回收細胞懸浮液，分別用於mRNA分析。
於mRNA分析中，對含有培養基之細胞懸浮液使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)抽出總RNA。使用總RNA與PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正PPAR gamma mRNA或FAB mRNA的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
UCP-1：HS00222453
其結果，若使用本發明之含有多醣類之迪特膠或三仙膠的培養基組成物，對人類前驅脂肪細胞進行分化誘導成脂肪細胞，細胞中之脂肪細胞標記之PPAR gamma的mRNA表現量，會增加至與去醯化結蘭膠同等程度。另一方面，米色脂肪細胞標記之掌管熱量產生之UCP-1 mRNA的表現，於含有迪特膠之培養基或含有三仙膠之培養基進一步增大，顯示去醯化結蘭膠以上的效果。PPAR gamma及UCP-1表面值示於表6及表7。
(試驗例8：使用去醯化結蘭膠之3D培養所致之成為脂肪細胞之分化誘導及白色脂肪細胞化)
以使成為0.3%(w/v)的方式使去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)懸浮於超純水(Mill-Q水)後，邊以90℃加熱邊攪拌使其溶解，將所得之水溶液以高壓釜以121℃滅菌20分鐘。使用本溶液，以使終濃度為0.015%(w/v)的方式，添加去醯化結蘭膠於人類脂肪細胞分化培養基(#CAS11D250，東洋紡公司製)調製成培養基組成物。接著，作為使用低貼附盤的3D培養法，係以使人類前驅脂肪細胞(來自皮下，#CAS02s05a，東洋紡公司製)成為90000細胞/mL的方式，接種於上述添加有去醯化結蘭膠的人類脂肪細胞分化培養基(0.015%)後，以使每1孔為5mL的方式分注於6孔平底超低貼附表面微量盤(Corning公司製，#3471)的孔中。於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態進行細胞培養，持續10天。將各孔中的細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠人類脂肪細胞分化培養基組成物5mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第20天為止，亦即再播種後持續10天。於培養開始後的第20天，將各孔中之細胞懸浮液分別移至50mL試管，以滅菌水修正培養基蒸發量，添加不含去醯化結蘭膠之人類脂肪細胞分化培養基組成物10mL，再接種於孔中。將細胞於CO2培養箱(37℃、5%CO2)內以靜置狀態培養，持續至培養開始後的第30天為止，亦即再再播種後持續10天。
白色脂肪細胞的生產，係將含有第30天之經分化之脂肪細胞的細胞懸浮液，接種於6孔Transwell plate(Preset VECELL(R)30/6 well(1)# PSVC 30-1，Vessels公司)的上部孔部分。Transwell的下部孔部分，經由過濾器，去除滲出的分化培養基，於上述孔中添加含有10%(v/v)胎牛血清 (FBS)，1μg/mL胰島素、2μM地塞米松(Takara公司、Takara-Bio Adipo Inducer Reagent)及1nM T3(3,3’5-三碘-L-甲狀腺胺，#T2877，Sigma Sldrich公司)及125nM吲哚美辛(#I 7378，Sigma Aldrich公司)的DMEM培養基(WAKO公司製)，以下稱為(白色脂肪培養基)，實施培養基交換持續至自培養開始第59天為止。Transwell中的白色脂肪培養基的交換，於第39天及第50天實施。於培養開始後第20天、第30天、第39天、第59天，由一部分的各孔回收細胞懸浮液，分別用於mRNA分析。
於mRNA分析中，對含有培養基之細胞懸浮液使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)抽出總RNA。使用總RNA與PrimerScriptTMRT Master Mix(Takara Bio公司製)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。分注各cDNA樣品，以滅菌水稀釋為1/10，使用於PCR。作為使用於檢量線的樣品，使用分注混合的cDNA，以3倍公比設定為稀釋至1/3至1/243的定量範圍。PCR，係使用各cDNA樣品、檢量樣品、Premix Ex TaqTM(Takara Bio公司製)與各種TaqMan探針(Applied Biosystems公司製)，使用7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司製)來實施。作為PPIA(cyclophilin B)之mRNA的內部對照，以PPIA之值修正PPAR gamma mRNA或FAB mRNA的表現。所使用之各探針(Applied Biosystems公司製)係示於以下。
PPIA：HS99999904
UCP-1：HS00222453
Adiponectin：Hs00605917
Leptin：Hs00174877
其結果，若使用本發明之培養基組成物，使其分化成UCP-1 之表現亢進的脂肪細胞後，再交換成促進白色脂肪化的培養基，則白色脂肪細胞標記之瘦素(Leptin)mRNA的表現增大。另一方面，相反地米色脂肪細胞標記之UCP-1之表現則降低。再者，作為已知為小型脂肪細胞標記之脂聯素(adiponectin)mRNA之表現亦隨著白色化而降低。以本法分化誘導為白色細胞時，若以白色脂肪培養基進行培養，則為單胞性、且瘦素mRNA的表現量增大，顯示生長成白色脂肪細胞。脂聯素、瘦素及UCP-1之mRNA表現值示於表8。
〔產業上可利用性〕
藉由本發明，可於生物體外製造與由生物體所分離之脂肪細胞同樣地於一個細胞內含有一個大脂肪滴之單胞性的白色脂肪細胞。又，藉由本發明，亦可於生物體外製造不僅於新藥開發研究、於藉由移植對糖尿病或肥滿之治療用途可期待的米色脂肪細胞。
本發明係以於日本提出申請之日本特願2017-221360(申請日：2017年11月16日)為基礎，於此提及，其之內容皆包含於本說明書中。

Claims (19)

  1. 一種單胞性脂肪細胞之製造方法，該製造方法包含：將具有成為脂肪細胞之分化能力的間葉系細胞，於含有藉由二價金屬陽離子之結合而形成可使細胞或組織懸浮之結構體、具陰離子性官能基之高分子化合物之可懸浮培養細胞或組織的液狀培養基組成物中，懸浮培養，並且誘導成為單胞性脂肪細胞的分化。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，該間葉系細胞為前驅脂肪細胞、間葉系幹細胞或纖維母細胞。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之製造方法，其中，該高分子化合物為多醣類。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之製造方法，其中，該多醣類含有葡萄糖醛酸部位。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之製造方法，其中，該多醣類為去醯化結蘭膠、迪特膠、三仙膠或該多醣類之鹽。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之製造方法，其中，該多醣類為去醯化結蘭膠或其鹽，該培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽的濃度為0.01~0.05%(w/v)。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之製造方法，其中，該多醣類為迪特膠或三仙膠或該多醣類之鹽，該培養基組成物中之迪特膠或三仙膠或該多醣類之鹽的濃度為0.01~0.05%(w/v)。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之製造方法，其中，該培養基組成物含有二價金屬陽離子。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之製造方法，其中，二價金屬陽離子為鈣離子。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之製造方法，其中，該培養基組成物含有脂肪細胞分化誘導因子。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之製造方法，其中，該脂肪細胞分化誘導因子，為選自胰島素、糖皮質素受體促效劑、cAMP磷酸二酯酶抑制劑、環氧化酶抑制劑、前列腺素、長鏈脂肪酸、三碘甲狀腺胺酸、及PPARγ促效劑所構成之群中的至少一因子。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中，該脂肪細胞分化誘導因子，包含胰島素、糖皮質素受體促效劑、及環氧化酶抑制劑。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中，糖皮質素受體促效劑為地塞米松。
  14. 如申請專利範圍第12或13項所述之製造方法，其中，環氧化酶抑制劑為吲哚美辛。
  15. 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中，該脂肪細胞分化誘導因子，包含胰島素、糖皮質素受體促效劑、及cAMP磷酸二酯酶抑制劑。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之製造方法，其中，糖皮質素受體促效劑為地塞米松。
  17. 如申請專利範圍第15或16項所述之製造方法，其中，cAMP磷酸二酯酶抑制劑為3-異丁基-1-甲基黃嘌呤。
  18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述之製造方法，其中，該單胞性脂肪細胞為UCP-1陽性。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之製造方法，其進一步使懸浮培養所得之細胞懸浮液中之該高分子化合物濃度，降低至該間葉系細胞無法懸浮的濃度，而回收維持為懸浮狀態的單胞性脂肪細胞。
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