JP6807749B2 - 細胞培養方法及び細胞培養装置 - Google Patents
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Description
図1は、本発明の実施の形態である細胞培養装置1の外観構成を示す斜視図である。また、図2は、図1に示した細胞培養装置1の構成を示すブロック図である。図1及び図2に示すように、細胞培養装置1は、基板2の上部中央に培養皿3が設けられ、培養皿3の両端から培養皿3を挟むように、培養液を培養皿3に供給する送液部10及び培養皿3から培養液を排出する排液部20が基板2上に設けられる。
ここで、本実施の形態では、培養皿3内で、供給口4から排出口5に向かう培養液の移動線速度Vが、培養細胞6にせん断応力を与えない最大速度未満となるように培養液を培養皿3に供給しつつ排出するようにしている。
x=(4Dt)^(1/2)
として表すことができる。ここで、Dは、拡散係数であり、室温では、D=(1〜2)×10^(−5)[cm^2/s]程度である。
したがって、培養液の分子が1分間に移動する平均距離xは、0.4〜0.7mmとなり、拡散速度V1は、0.4〜0.7mm/min となる。
図9は、流量制御部30による培養液の流量制御処理手順を示すフローチャートである。図9に示すように、まず、培養細胞6を培養皿3の底部に接着させ、その後、排出側微小流量ポンプ22を停止したまま、供給側微小流量ポンプ12を駆動し、培養皿3内に培養液が満ちるように培養液を供給する(ステップS101)。その後、供給側微小流量ポンプ12を停止し、排出側微小流量ポンプ22を駆動して培養液を排出し、培養液の深さが所定深さとなるように設定する(ステップS102)。その後、この所定深さで、供給口4から排出口5に向かう培養液の移動線速度が、培養細胞6にせん断応力を与えない最大速度未満となるように、好ましくは、培養液の拡散速度以下となるように、培養液を一定流量で供給し、かつ、排出するように、供給側微小流量ポンプ12及び排出側微小流量ポンプ22の流量制御を行う(ステップS103)。
上述した細胞培養装置1を用いて、A549細胞(ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞)を培養皿3に播種し、5日間、培養液を拡散速度以下で供給、かつ、排出して培養した。そして、細胞にせん断応力がかかっていたか否かを調べた。せん断応力がかかったか否かは、NOの経路、PKCの経路でのリン酸化状態を調べることによってわかる。実験結果では、NOの経路には、eNOSのリン酸ペプチドが一度も同定されなかった。また、PKCの経路では、KRTS(S73)のリン酸化ペプチドは同定されず、KRTS(S73)のリン酸化は変化がなかった。これらの結果から、細胞には、せん断応力がかかっていないものと推定できる。
上述した実施の形態では、図10の上部に示したように、供給口4の開口位置は、供給口側面3aに対して培養液面内で水平方向に線状で等間隔に配置されていたが、図10の下部に示すように、供給口4の開口位置を中央側にずらした配置としてもよい。この場合、メニスカスによる影響が軽減され、先端領域E1を一層、直線状に移動させることができる。なお、排出口5の開口位置も同様である。
ところで、図7では、流れ方向側面3c,3dにおける培養液の移動線速度がメニスカスによって速くなっていた。そこで、メニスカスの発生を抑制するために、流れ方向側面3c,3d、供給口側面3a、排出口側面3bに、フッ素系の撥水剤を塗布した。その結果、図10の上部に示した供給口4の開口配置であっても、図12に示すように、流れ方向側面3c,3dにおける培養液の移動線速度を抑えることができた。すなわち、流れ方向側面3c,3d、供給口側面3a、排出口側面3bにフッ素系の撥水剤を塗布することによってメニスカスの発生が抑制され、培養液の移動線速度を均一にすることができる。なお、メニスカスの発生を抑制すればよいので、少なくとも流れ方向側面3c,3dにフッ素系の撥水剤が塗布されればよい。また、撥水剤はフッ素系に限らず、撥水性を有する材料であればよい。
なお、図12に示した培養液の流れの先端は、流れ方向に対して斜めになっている。これは、培養皿3が水平に配置されず、幅方向に傾斜して培養液の深さが異なっていたからである。そこで、図13に示すように、培養皿3が固定される培養皿用基板2eを基板2上に設けるとともに、基板2と培養皿用基板2eとの間であって、培養皿3の四隅に対応する部分に、4つの水平調整機構51(51a,51b,51c,51d)を設ける。さらに、培養皿用基板2eの上部に、X方向とY方向との水平性を検知する2つの水準器52を取り付ける。なお、XY平面の水平性を検知できるものであれば、1つの水準器であってもよい。
図15に示すように、リザーバタンク11と供給側微小流量ポンプ12の流入口との間の接続部61、供給側微小流量ポンプ12の流出口と供給口4との間の接続部62、排出口5と排出側微小流量ポンプ22の流入口との間の接続部63、及び、排出側微小流量ポンプ22の流出口と廃液タンク21との間の接続部64は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるようにしてもよい。
上述した細胞培養装置は、平板状であるため、多段に積み重ねることができる。したがって、例えば、図17に示すように、保温が可能な運搬箱80で細胞培養装置1を多段に積み重ねて運搬することができる。各細胞培養装置1の電源コネクタ81は、バッテリ83に接続される電源コネクタ82にそれぞれ接続される。電源コネクタ82は、バッテリ83に対して数珠つなぎに接続されている。したがって、例えば、上側から3段目の細胞培養装置1が取り外されても、この取り外された細胞培養装置1の電源コネクタ81と電源コネクタ82とを取り外すのみで、他の細胞培養装置1を連続して培養し続けることができる。
上述した実施の形態では、培養皿3と排出側微小流量ポンプ22との流路は、可撓性チューブを用い、この可撓性チューブと排出側微小流量ポンプ22との流出口とはユーザが接続するようにしていた。この実施の形態の変形例では、すべての流路に開放部を設けない閉鎖かん流系流路を形成している。
2,201 基板
2a,2b フランジ
2c,2d 穴
2e 培養皿用基板
3,203a,203b 培養皿
3a 供給口側面
3b 排出口側面
3c,3d 流れ方向側面
3e 底面
4,253 供給口
5,254 排出口
6 培養細胞
10 送液部
11,211 リザーバタンク
12,212a,212b 供給側微小流量ポンプ
12a,22a ポンプ群
12b,22b 減速機
12c,22c,213a,213b モータ
13,23 絞り調整機構
20 排液部
21,223 廃液タンク
22 排出側微小流量ポンプ
30 流量制御部
40 温度制御部
41 透明導電膜ヒータ
42,44 温度センサ
43 ペルチェ素子
50 電源
51(51a,51b,51c,51d) 水平調整機構
52 水準器
53 調整ダイヤル
53a ネジ部
54 傾斜部材
54a,55a 傾斜部
55 昇降部材
61〜64,71〜74 接続部
75 供給側流路
76 排出側流路
80 運搬箱
81,82 電源コネクタ
83 バッテリ
103a,103b,111a,111b,121a,121b 押さえ部材
220 流路プレート
C 直線
D 相対濃度
E1 先端領域
L11,L12,L21,L22 流路
L231 第1の流路
L232 第2の流路
L233 第3の流路
L234 第4の流路
P1,P2 圧力
R 距離
SD 液位検出センサ
V 移動線速度
V1 拡散速度
Vmax 最大速度
Claims (15)
- 培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な培養液を供給するとともに前記培養皿内の前記培養液を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養方法であって、
前記培養細胞を挟むように前記培養皿の一端の供給口側面における前記培養液の液面内で水平方向に線状に複数、離散配置された前記培養液の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端の排出口側面における前記培養液の液面内で水平方向に線状に複数、離散配置された前記培養液の排出口を設け、複数の前記供給口から複数の前記排出口に向かう前記培養液の移動線速度が、前記培養液内の培養細胞に必要な栄養素の使用温度環境下における分子運動による拡散速度範囲の上限拡散速度以下となるように前記培養液を前記培養皿に供給しつつ排出することを特徴とする細胞培養方法。 - 培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な培養液を供給するとともに前記培養皿内の前記培養液を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養装置であって、
前記培養皿の一端の供給口側面における前記培養液の液面内で水平方向に線状に複数、離散配置された前記培養液の供給口と、
前記供給口との間で前記培養細胞を挟むように前記培養皿の他端の排出口側面における前記培養液の液面内で水平方向に線状に複数、離散配置された前記培養皿の排出口と、
前記培養皿に供給する前記培養液を蓄えるリザーバタンクと、
前記培養皿から排出された前記培養液を蓄える廃液タンクと、
前記供給口を介して前記リザーバタンク内の前記培養液を前記培養皿に供給する供給側微小流量ポンプと、
前記排出口を介して前記培養皿から前記培養液を排出する排出側微小流量ポンプと、
前記供給口から前記排出口に向かう前記培養液の移動線速度が、前記培養液内の培養細胞に必要な栄養素の使用温度環境下における分子運動による拡散速度範囲の上限拡散速度以下となるように前記供給側微小流量ポンプ及び前記排出側微小流量ポンプの流量制御を行う流量制御部と、
を備えたことを特徴とする細胞培養装置。 - 前記培養皿の側面の表面自由エネルギーは、前記培養皿の底面の表面自由エネルギーに比して小さいことを特徴とする請求項2に記載の細胞培養装置。
- 複数の前記供給口の開口位置を、流れ方向の両側面から中央側にずらしたことを特徴とする請求項2又は3に記載の細胞培養装置。
- 複数の前記供給口の開口位置を、前記培養液の深さ方向を含めて離散配置したことを特徴とする請求項2又は3に記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の底面を水平に調整する水平調整機構を備えたことを特徴とする請求項2〜5のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の底面を斜めに調整する傾斜調整機構を備えたことを特徴とする請求項2〜6のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記供給側微小流量ポンプの流出口と複数の前記供給口との間、及び、複数の前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間は、複数の可撓性チューブで接続され、
前記供給側微小流量ポンプと複数の前記供給口との間、及び前記排出側微小流量ポンプと複数の前記排出口との間にそれぞれ設けられた各複数の可撓性チューブの開口を可変に絞る絞り調整機構を設け、
前記流量制御は、前記供給側微小流量ポンプから供給される前記培養液の流量及び前記排出側微小流量ポンプから排出される前記培養液の流量を再調整する流量制御を行うことを特徴とする請求項2〜7のいずれか一つに記載の細胞培養装置。 - 前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、及び、前記排出側微小流量ポンプの流出口と前記廃液タンクとの間は、着脱自在に直接接続されることを特徴とする請求項2〜8のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記供給口と前記供給側微小流量ポンプの流出口とを結ぶ供給側流路の上部に前記リザーバタンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の供給口側に横置きし、他端から、前記供給側微小流量ポンプの流入口を前記リザーバタンクに着脱自在に接続するとともに前記供給側微小流量ポンプの流出口を前記供給側流路の流入口に着脱自在に接続し、
前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口とを結ぶ排出側流路の上部に前記廃液タンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の排出口側に横置きし、他端から、前記排出側微小流量ポンプの流出口を前記廃液タンクに着脱自在に接続するとともに前記排出側微小流量ポンプの流入口を前記排出側流路の流出口に着脱自在に接続したことを特徴とする請求項9に記載の細胞培養装置。 - 前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプとの間の第1の流路、前記供給側微小流量ポンプと前記培養皿との間の第2の流路、前記培養皿と前記排出側微小流量ポンプとの間の第3の流路、前記排出側微小流量ポンプと前記廃液タンクとの間の第4の流路とを内部に埋め込み形成し、前記リザーバタンク、前記培養皿、前記廃液タンクの上部に配置される流路プレートを備え、
前記第1の流路と前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第2の流路と前記供給側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続され、前記第3の流路と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第4の流路と前記排出側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続されることを特徴とする請求項2〜8のいずれか一つに記載の細胞培養装置。 - 前記培養皿内の液位を検出する液位検出センサを備え、
前記流量制御部は、前記液位検出センサが検出する液位が一定となるように流量制御を行うことを特徴とする請求項2〜11のいずれか一つに記載の細胞培養装置。 - 前記供給側微小流量ポンプを駆動する供給側駆動源は前記供給側微小流量ポンプに対して着脱可能であり、前記排出側微小流量ポンプを駆動する排出側駆動源は前記排出側微小流量ポンプに対して着脱可能であることを特徴とする請求項2〜12のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 少なくとも前記培養皿を配置する基板を備え、前記基板は、前記培養細胞の培養状態を観察する領域に、穴、または前記培養皿が配置される反対側が開口した無色透明の凹部を形成していることを特徴とする請求項2〜13のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の底部に設けられた透明導電膜ヒータと、
前記培養皿内の前記培養液の温度を検出する温度センサと、
前記温度センサの検出結果をもとに前記透明導電膜ヒータを通電して前記培養皿内の前記培養液の温度を所定温度範囲内に保つ制御を行う温度制御部と、
を備えたことを特徴とする請求項2〜14のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
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